Summary
आयु संबंधी रोग कोशिका द्रव्य के घटकों में कई दोषों से जुड़े हैं। यहां, हम अस्थि मज्जा मेसेनचिमल स्टेम सेल से प्लाज्मा झिल्ली के vesicles तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल पेश करते हैं। यह तकनीक संभावित रूप से आयु-संबंधित फेनोटॉप्स को सुधारने या रिवर्स करने के लिए साइटोप्लाज्म रिप्लेसमेंट थेरेपी के साधन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Abstract
हमने पहले स्तनधारी कोशिकाओं के मैकेनिकल एक्सट्रूज़न के जरिए प्लाज्मा झिल्ली के vesicles (पीएमवी) की पीढ़ी के बारे में बताया है। एमआईटीचोन्ड्रियल की कमी वाले Rho0 कोशिकाओं के साथ पीएमवी का संलयन सामान्य संस्कृति की स्थिति के तहत mitotic गतिविधि बहाल। एथ्रोस्क्लेरोसिस, टाइप 2 डायबिटीज, अल्जाइमर रोग, और कैंसर आयु से संबंधित बीमारियों है जो साइटोसोल में कई मैकेनिकल और कार्यात्मक दोषों और विभिन्न प्रकार के सेल प्रकार के अंगों से जुड़ा हुआ है। अस्थि मज्जा मेसेनचिमल स्टेम कोशिका (बीएमएससी) अस्थि मज्जा से एक अनूठी सेल आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं जो कि उनकी बहुतायत को बनाए रखते हुए स्वयं-नवीकरण क्षमता रखती हैं। पीएमवी के संलयन के माध्यम से ऑटोलॉगस बीएमएससी से युवा कोशिका कोशिकाओं के साथ सिनसेंस कोशिकाओं की पूर्ति से उम्र-संबंधित फेनोटाइप सुधारने या रिवर्स करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण भी प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल 3 के साथ पॉली कार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से बीएमएससी से पीएमवी तैयार करने के तरीके का वर्णन करता है1; मी pores, मिटोकोंड्रिया के अस्तित्व का निर्धारण करते हैं और पीएमवी में एक confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करते हुए झिल्ली की क्षमता के रखरखाव की जांच, पीएमवी को केन्द्रित करके केंद्रित करता है, और पीवीवी के विवो इंजेक्शन में चूहों के गैस्ट्रोकैनिएशिया पेशी में काम करता है।
Introduction
जीन, एंजाइम, और सेल प्रतिस्थापन उपचार के लिए तरीकों को स्थापित करने के लिए एक जबरदस्त प्रयास किया गया है। यह महान सफलताओं और यहां तक कि नैदानिक आवेदन 1 , 2 , 3 में हुई है । हाल ही में, न्यूक्लियस ट्रांसफर तकनीक पर आधारित एक विवादास्पद मिटोकॉन्ड्रिया रिप्लेसमेंट थेरॉन्ग को बुढ़ापे की महिलाओं के लिए इन विट्रो निषेचन में लागू किया गया था या घातक मिटोचांड्रियल डीएनए उत्परिवर्तन 4 रखा गया था । आयु-संबंधी रोगों में पाया गया दोष, एथ्रोस्कोलेरोसिस, टाइप 2 डायबिटीज़, अल्जाइमर रोग और कैंसर, आमतौर पर बहुआयामी हैं। यह प्रलेखित किया गया है कि लिपिड बूंदों का संग्रह; Amyloid प्रोटीन के बयान; एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में खुला प्रोटीन का प्रतिधारण; और इन बीमारियों के विकास या उत्तेजना में दोषपूर्ण proteasome, autophagosome, और mitochondria योगदान"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 वर्तमान में, साइटोसोल और ऑर्गेनल्स में खराबी के प्रत्यक्ष उपाय करने के उद्देश्य से कोई उपलब्ध तंत्र नहीं है, जिसके कारण जननेंद्रिय और वृद्धावस्था के फ़िनोटाइप होते हैं।
हमने पहले स्तनधारी कोशिकाओं 12 के मैकेनिकल एक्सट्रूज़न के जरिए प्लाजमा झिल्ली vesicles (पीएमवी) की पीढ़ी पर सूचना दी है। नाभिक के अपवाद के साथ, प्रोटीन और आरएनए सहित झिल्ली या साइटोसोल के घटकों, साथ ही साथ ऑक्सीन, जैसे कि मिटोचंद्रिया, पीएमवी में पाए गए थे। मूलतः, एक पीएमवी को लघु इंबेक्लेक्टेड सेल के रूप में माना जा सकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, एमआईटीचोन्द्रिया की कमी वाली पीएचवी की कोशिकाओं की संलयन सामान्य संस्कृति परिस्थितियों में मित्सुशीय क्रियाकलाप को बहाल कर रहा है। यह स्थापित होने पर पहली रिपोर्ट हैCytoplasm रिसेप्शन थेरेपी के लिए एक संभावित रूप से कुशल तरीके से शिंग
अस्थि मज्जा मेसेनचिमल स्टेम सेल (बीएमएससी) बहुसंकेतक पूर्वज कोशिकाएं हैं जो नियमित रूप से अस्थि मज्जा से उत्पन्न होती हैं और संस्कृति में आसानी से विस्तारित होती हैं। एमएससीएस 13 में कम स्तर पर भ्रूण स्टेम सेल मार्करों Oct4, Nanog, और SOX2 का पता चला है। टेलोमेरेस गतिविधि भी औसत दर्जे का है। इसके अलावा, सह-उत्तेजक अणुओं और मानव लियोकाइट एंटीजन (एचएलए) कक्षा II के अणुओं के अभाव, साथ ही साथ एमएससी पर एचएलए क्लास I की कम अभिव्यक्ति, उन्हें एलोजेनिक के लिए आदर्श कोशिकाओं या "ऑफ-द-शेल्फ" का उपयोग करते हैं दोनों पुनर्योजी दवाओं और immunomodulatory अनुप्रयोगों 14
यहां, हम यह बताते हैं कि 3 बीएमसीसी पॉइरो के साथ पॉलीकार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से एमओएम बीएमएससी से पीएमवी तैयार करने के तरीके, एमटोचोन्द्रिया के अस्तित्व का निर्धारण करते हैं और पीएमवी में एफएमओ में ट्रांसकॉन्मेंट का इस्तेमाल करते हैं।अल माइक्रोस्कोपी, केन्द्रित किया जाता है लेकिन केंद्रित पीएमवी को केन्द्रित करने के लिए तैयार नहीं है, और पीआईवी के विवो इंजेक्शन में चूहों के गैस्ट्रोकैनेमियस मांसपेशी में काम करता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
8 से 12 सप्ताहीय बीएएलबी / सी चूहों को शंघाई प्रायोगिक पशु केंद्र (शंघाई, चीन) से खरीदा गया था और एक विशिष्ट रोगजन-मुक्त और वातानुकूलित पशु सुविधा में उठाया गया था। शंटु विश्वविद्यालय द्वारा स्थापित प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग और देखभाल के लिए पशु देखभाल और प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं दिशानिर्देशों का अनुपालन करती हैं।
1. उपकरण के विधानसभा
- बांझपन सुनिश्चित करने के लिए, ट्यूस्यू कल्चर हुड के यूवी लाइट को उपयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए चालू करें।
- एक डिस्पोजेबल 25 एमएम फिल्टर यूनिट को खोलें और इकाई के कैप और नीचे को 200 एमएल गिलास कप में डालें जो कि 30 मिनट के लिए 75% एथेनॉल से भरा होता है। यूनिट मेडिकल-ग्रेड पॉलीप्रोपीलेन का बना है।
- संदंश का उपयोग कर यूनिट के कैप और नीचे उठाएं, हाथ से शेष इथेनॉल को हिलाएं, और भागों को हुड में 10 मिनट के लिए सूखने दें।
- पीबीएस में एक 19 मिमी पॉली कार्बोनेट झिल्ली गीला और इसे बोटो के सहायक मैट्रिक्स के ऊपर ध्यान से रखेंयूनिट का मीटर बहुलक फिल्म में एक चिकनी, सपाट सतह और ट्रैक-खोखले 3 सुक्ष्ममापी छिद्र हैं।
- नीचे के खिलाफ कसकर टोपी को पेंच करके यूनिट को पुन: निकालें। सुनिश्चित करें कि झिल्ली केंद्र से उखाड़ फेंका नहीं है।
- 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज की सुई निकालें और पीबीएस के 1 एमएल को आकर्षित करें। सिरिंज को फ़िल्टर इकाई से संलग्न करें और फिर पीबीएस को इकाई के माध्यम से विधानसभा को गीला करने के लिए धक्का दें और जांच करें कि क्या कोई रिसाव है।
2. प्लाज्मा झिल्ली वेसल्स (पीएमवी) का निर्माण
- एक बीएमएससी संस्कृति की स्थापना, जैसा कि नेमेथ एट अल द्वारा रिपोर्ट किया गया 15 , डीएमईएम संस्कृति माध्यम में 15% एफबीएस युक्त और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 वाला आर्मीडेड इनक्यूबेटर में 6-अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं को विकसित करना
- कोशिकाओं का प्रचार करने के लिए, संस्कृति के माध्यम को हटा दें और कैल्शियम मुक्त पीबीएस के 0.5 एमएल के साथ अच्छी तरह से कुल्ला।
- 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 0.5 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं3 मिनट के लिए सेल अलगाव की सुविधा के लिए दो हाथों की हथेली के खिलाफ प्लेट को टैप करें। संस्कृति माध्यम के 1 एमएल को जोड़कर पाचन रोकें।
- एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को ले लीजिए और 200 मिनट में 2 मिनट के लिए एक बेंच टॉप अपकेंद्रित्र में स्पिन करें। कोशिकाओं के 4 एमएल में कोशिकाओं को पुन: resuspend और कोशिकाओं को एक 6 अच्छी तरह से थाली के दो कुओं में विभाजित।
नोट: सेल आमतौर पर लगभग 24 घंटे में संगम तक पहुंचते हैं। - पीएमवी बनाने के लिए, कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से (लगभग 5 x 10 5 कोशिकाओं) से 6-अच्छी तरह से प्लेट में ट्राइपसिन पाचन द्वारा फसल डालें और 0.5 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को मोनोडिस्पेंस करें।
- इंसुलिन सिरिंज में कोशिकाओं को लोड करें, इसे फिल्टर इकाई में संलग्न करें, और फ़िल्टर के माध्यम से कोशिकाओं को निचोड़ने के लिए जल्दी से सवार हो जाएं। Extruded माध्यम को त्यागें क्योंकि इसमें केवल कुछ पीएमवी होने चाहिए।
- सिरिंज में एक अतिरिक्त 0.5 एमएल मध्यम लोड करें और इसे फिल्टर के माध्यम से जल्दी से दबाएं। दूसरे एक्सट्रूज़न का माध्यम एकत्रित किया गयाएसएमवी विभिन्न आकार के हैं।
- इकट्ठा किए गए माध्यम के 150 μL को 35 मिमी के गिलास नीचे के डिश में लोड करें और पीएमवी को लगभग 10 मिनट के लिए नीचे तक व्यवस्थित करने दें। 20 एक्स उद्देश्य लेंस का उपयोग करते हुए एक सीसीडी कैमरा से सुसज्जित औंधा चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत पीएमवी की जांच करें।
3. कन्फोकल माइक्रोस्कोपी का प्रयोग करते हुए पीएमवी में सामग्री की परीक्षा
- बीएमएससी में अभिकर्मक प्रदर्शन करने के लिए, सीरम मुक्त डीएमईएम के 50 μL में 2 माइक्रोग्राम सुपरकोल्ड प्लाज्मिड डीएनए और 6 μ एल के कैटेनिक अभिकर्मक अभिकर्मक ( जैसे, पॉलीजेट) को कम करना। भंवर को अच्छी तरह से मिलाएं और ट्यूब के दोनों तरफ से सभी तरल एकत्र करने के लिए संक्षेप में स्पिन करें।
- पतला समाधान (चरण 3.1 से) बूंदों को पतला डीएनए समाधान में डालें, भंवर के लिए 1 मिनट, संक्षेप में स्पिन करें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते रहें।
- बीएमएससी पर पुराने माध्यम को बदलें, जो लगभग 30% संगम पर रातोंरात बीजगणित किया गया है, ताजा संस्कृति माध्यम के 2 एमएल के साथ और डीएनएक अभिकर्मक मिश्रण dropwise
- 12 एच अभिकर्मक के बाद ताजे माध्यम के 2 एमएल के साथ बदलें।
- Cytoplasmically स्थानीय प्रोटीन का पता लगाने के लिए, ऊपर वर्णित के रूप में, एक ईजीएफपी अभिव्यक्ति कैसेट (पीईजीएफपी-एन 1) युक्त प्लाज्मिड के साथ कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट करें। जैसा कि ऊपर बताया गया है, पीपीवी पीढ़ी के लिए अभिकर्मक के बाद, trypsin पाचन द्वारा 48 घंटे कोशिकाओं को फसल डालें।
- मिटोकोंड्रिया का पता लगाने के लिए, 30 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए ताजा संस्कृति माध्यम में मिटोचॉन्ड्रियल डाई (1 सुक्ष्ममापी, मिटोट्र्रेकर) वाले कोशिकाओं को दाग़ाना।
- मिटोकोंड्रिया के झिल्ली की क्षमता का पता लगाने के लिए, साइनाइन डाई जेसी -1 (5,5 ', 6,6' -टेट्राक्लोरो -11 ', 3,3' -टेट्राइथिलेबेंजिमी-डाज़ोलिलाकार्बोकायनिन आयोडाइड) के साथ कोशिकाओं को दाग़ी (10 ग्राम) / एमएल) 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ताजा संस्कृति माध्यम में
- पीबीएस के 0.5 एमएल के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं और फिर पीएमवी पीढ़ी के लिए ट्रिप्सिन पाचन द्वारा कोशिकाओं को फसल डालें, जैसा ऊपर बताया गया है।
- एकत्रित मेड के 150 μL लोड करेंIum को 35 मिमी के गिलास नीचे के डिब्बे में और पीएमवी को लगभग 10 मिनट के लिए नीचे तक व्यवस्थित करने की अनुमति दें। 100 एक्स ऑयल वर्जन लेंस का उपयोग करके एक confocal माइक्रोस्कोप के तहत पीएमवी जांचें
- ईजीएफपी या मिटोकॉन्ड्रियल डाई का पता लगाने के लिए, 488-एनएम लेजर को चालू करें और 505-530 एनएम पर संकेत इकट्ठा करें। जेसी -1 का पता लगाने के लिए, 488-एनएम और 543-एनएम पराबैंगनीकिरण को चालू करें और 505-530 एनएम और 560-615 एनएम पर संकेत एकत्र करें। पिनहोल मान को लगभग 1.4 में सेट करें
4. केन्द्रितकरण द्वारा केंद्रित पीएमवी की तैयारी
- Trypsin पाचन द्वारा कोशिकाओं काटा और पीएमवी उत्पन्न, जैसा कि ऊपर वर्णित है, संस्कृति माध्यम के 0.5 एमएल में।
- पीएमवी को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए बेंचटॉप अपकेंद्रित्र में 1200 XG में स्पिन करें सतह पर तैरने वाले को ध्यानपूर्वक परामर्श देना और 100 मीटर की संस्कृति के माध्यम से नरम घूमता के साथ गोली को फिर से खोलना।
- पीएमवी के 50 μL को 35 मिमी कांच के नीचे के डिश में लोड करें और उन्हें लगभग 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर व्यवस्थित करने की अनुमति दें। पीएमवी की जांच करें40 एक्स ऑयल लेंस लेंस का उपयोग करके एक confocal माइक्रोस्कोप के तहत
- 1 घंटे के लिए बीएमएससी संस्कृति के लिए पतला पॉलीथाइलिनिमिन (पीई) समाधान की श्रृंखला जोड़ें और साइटोटोक्सिसिटी के लक्षणों की जांच करें।
नोट: बीएमएससी में विषाक्तता का कोई संकेत नहीं मिला क्योंकि यहां 2 μg / mL में पीआई चुना गया था। - ट्रिप्सिन पाचन द्वारा कोशिकाओं को फसल डालें और 1 एच के लिए 2 μg / mL में पीई को जोड़ने से एकत्रीकरण को रोकने के साधन के रूप में सेल झिल्ली को चार्ज करना है। संस्कृति माध्यम के 0.5 एमएल में ऊपर वर्णित के रूप में पीएमवी उत्पन्न करें। पीएमवी को ध्यान में रखें और एक confocal सूक्ष्मदर्शी के तहत उन्हें जांच, जैसा कि ऊपर वर्णित है
5. गैस्ट्रोकनिमेस स्नायु में पीएमवी के इंजेक्शन
- झिल्ली को दाग़ने के लिए, बीएमएससी में ताजा संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर में 30 मिनट के लिए सीएम-डीआई (क्लोरोमिथाइल डायलकेल-इंडोकार्बोकायनिन) (10 माइक्रोग्राम) डाई डाई।
- Trypsin पाचन द्वारा कोशिकाओं (लगभग 5 x 10 5 ) काटा और उन्हें 0.5 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से पुन: resuspend। 1 के लिए पीई (2 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ेंएच। ऊपर बताए अनुसार, 100 एमएल के संस्कृति माध्यम में पीएमवी को जनरेट और ध्यान केंद्रित करें।
- 12 घंटे उपवास के बाद सोडियम बारबिटल (10 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्शन करके एक बाल्ब / सी माउस को एनास्टेट करें।
- 75% इथेनॉल के साथ गैस्ट्रोकैनिअस मांसपेशी के बाहर साफ करें धीरे-धीरे पीएमवी (100 μL) को 30 जी इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करते हुए गैस्ट्रोएंमेनियस मांसपेशी में इंजेक्षन करें।
- संज्ञाहरण का प्रशासन करने के बाद, प्रयोग की अवधि के लिए आँखों पर गीली धुंध रखें और एक गरमागरम प्रकाश के साथ माउस को गर्म करें जब तक कि यह जाग न हो। एक अकेले वेंटिलेशन पिंजरे में माउस अकेले घर।
- गैस्ट्रोन्मेइयुस मांसपेशियों 12 घंटे के ऑपरेशन को फसल करने के लिए, ग्रीवा अव्यवस्था से माउस को मार डालो।
- गैस्ट्रोकैनिअस मांसपेशियों पर 75% इथेनॉल छिड़कें, कैंची के साथ त्वचा को खोलें, और दोनों सिरों पर संपूर्ण गैस्ट्रोकैनिएशिया पेशी को काट लें।
- पीबीएस के साथ मांसपेशियों को कुल्ला और 20 एक्स उद्देश्य लेंस का उपयोग करते हुए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत इसका परीक्षण करें।
- एक के साथ मांसपेशियों को छाँटेंकोई प्रतिदीप्ति नहीं के साथ भागों को हटाने के लिए तेज उस्तरा ब्लेड लगभग 9 मिमी 3 क्यूब्स में मजबूत लाल प्रतिदीप्ति के साथ भागों कट।
- इष्टतम काटने के तापमान माध्यम (ओसीटी) में प्रत्येक क्यूब को एम्बेड करें, इसे 5 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में डुबोकर रखें, और जब तक उपयोग न करें तब इसे -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र में रखें।
- जमे हुए वर्गों को एक cryostat का उपयोग करके 20 μm मोटी टुकड़ों में काटें और प्रत्येक अनुभाग को एक गिलास स्लाइड में पालन करें। अनुभाग एक बार पीबीएस के साथ कुल्ला।
- एक दाग सर्कल पेन के साथ अनुभाग के चारों ओर एक चक्र बनाएं और 100 μL डीएपीआई (1 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें। पीठ के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट ऊष्मायन के बाद डीएपीआई समाधान की आकांक्षा करें और पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
- नमूना पर बढ़ते हुए तेल को छोड़ दें, इसे एक गिलास पर्ची के साथ कवर करें, और नेल पॉलिश के साथ स्लाइड को सील करें। 100X तेल उद्देश्य लेंस का उपयोग कर एक confocal सूक्ष्मदर्शी के तहत अनुभाग की जांच करें।
- सीएम-डीआई का पता लगाने के लिए, 543 एनएम लेजर को चालू करें और 560-615 एनएम पर संकेत इकट्ठा करें। डीएपीआई का पता लगाने के लिए, 405 चालू करेंएनएम लेजर और 420-480 एनएम पर संकेत इकट्ठा। लगभग 1.4 के लिए पिनहोल मान सेट करें
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
पीएमवी की सफल तैयार करने की कुंजी फिल्टर यूनिट ( चित्रा 1 ) के सही विधानसभा पर निर्भर करती है, जिसे झिल्ली के माध्यम से पीबीएस के 1 एमएल को दबाकर परीक्षण किया जा सकता है। यदि रिसाव होता है, तो फ़िल्टर इकाई को फिर से इकट्ठा करें और फिर से परीक्षण करें। हालांकि, रिसाव केवल मज़बूती से परीक्षण किया जा सकता है जब कोशिकाएं झिल्ली के माध्यम से धकेल दी जाती हैं। यदि केवल 10 एक्स उद्देश्य का उपयोग करते हुए नियमित माइक्रोस्कोप के तहत कुछ पीएमवी का पता लगाया जाए, या यदि पीएमवी का आकार लगभग 1 माइक्रोन के आसपास होता है, तो यह इंगित करेगा कि गलत विधानसभा के कारण अधिकांश कोशिका इकाई के अंदर फंस रहे हैं। 20 एक्स उद्देश्य ( चित्रा 2 ) का उपयोग करते हुए एक चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत जांच के दौरान पीढ़ी के बारे में 3 माइक्रोन व्यास की सीमा में एक आकार के साथ प्रमुख थे। चूंकि नैनोमीटर आकार के पीएमवी आसानी से नहीं देखे गए थे, संख्या के संदर्भ में बड़े पीएमवी का प्रतिशत कम था। यह सिरिंज को फिर से दबाकर मददगार साबित हुआझिल्ली मलबे की मात्रा, जो जाहिरा तौर पर गोलाकार पीएमवी बनाने में विफल रहता है। इसके अलावा, छोटे आकार के पीएमवी (1 माइक्रोग्राम से कम) पहले एक्सट्रूज़न माध्यम में पाए गए, जिसमें दूसरे पीले रंग की पीएमवी दूसरी एक्सट्रूज़न में बरामद किए गए थे।
पीएमवी के सबसे अनूठे पहलू, न्यूक्लियस 12 से सेलुलर घटकों को अलग करना था। पीएमवी तैयारी के लिए इस्तेमाल होने से पहले 48 घंटे के लिए ईजीएफपी की एक अभिव्यक्ति कैसेट के साथ बीएमएससी ट्रांसफ़ेक्ट किए गए थे। परिणाम बताते हैं कि ईओजीएफपी प्रोटीन को स्थानांतरित किया जा सकता है पीएमवी में समझाया जा सकता है ( चित्रा 3 ए )। मिटोचोनड्रिया के बाड़े को मिटौकोन्डायडियल डाई के धुंधला द्वारा इसका सबूत दिया गया था, यह दर्शाता है कि पीएमवी में हरे फ्लोरोसेंट डोट्स होते हैं, जो मिटोचोनड्रिया ( चित्रा 3 ) का संकेत है। पीएमवी में से कुछ, यहां तक कि 3 माइक्रोन के व्यास वाले व्यास वाले भी, मिटोकोंड्रिया युक्त साक्ष्य नहीं दिखाते थेकुछ यांत्रिक बाधाओं पर पीएमवी में मितोचोनड्रिया के इनकैप्सुलेशन को रोका जा सकता है। मिटोकोंड्रिया की झिल्ली की क्षमता जेसी -1 धुंधला द्वारा पता लगाई गई थी, जो कि लाल प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करती है, जब मिटोकोंड्रिया की एक सामान्य क्षमता होती है परिणाम दिखाते हैं कि पीएमवी में लाल प्रतिदीप्ति वास्तव में पाया गया ( चित्रा 3 ), जबकि हरी प्रतिदीप्ति पता नहीं था (डेटा नहीं दिखाया गया), यह सुझाव देते हुए कि पीएमवी के भीतर मितोचोनड्रिया कार्यात्मक थे।
पीएमवी के लिए एक एकाग्रता प्रक्रिया की आवश्यकता होती है, खासकर vivo अनुप्रयोग में मात्रा को कम करने के साथ-साथ एक्सट्रूज़न के दौरान जारी किए गए सेलुलर घटकों को निकालने के लिए। तापमान के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1200 xg पर सेंटीफ्यूगेशन के बाद, सतह पर तैरने वाले में बहुत कम पीएमवी छोटे आकार के पाए गए। गोली के पुनर्जीवन की सुविधा के लिए, 2-एमएल गोल-नीचे ट्यूब सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, अधिकांश पीएमवी को गोली में एकत्रित किया गया था, खासकर पीछोटे आकार के एमवी ( चित्रा 4 ) यह शायद झिल्ली पर आसंजन अणुओं के कारण होता है। इसलिए माध्यम पीई (2 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक था, जिनकी एकाग्रता को कोई ध्यान देने योग्य साइटोटोक्सिसिटी नहीं था। सेल झिल्ली से जुड़ी पीआई के सकारात्मक आरोप ने सेंट्रीफ्यूगेशन ( चित्रा 4 ) के दौरान पीएमवी के एकत्रीकरण को रोका।
अंत में, बीएमएससी की झिल्ली पीएमवी की तैयारी से पहले CM-DII डाई के साथ लेबल किया गया था ( चित्रा 5 )। एकाग्रता के बाद, पीएमवी को चूहों की गैस्ट्रोकेंमिअस मांसपेशियों में अंतःक्षिप्त किया गया था, जो 12 घंटे के ऑपरेशन का उत्पादन किया गया था और एक confocal सूक्ष्मदर्शी के तहत जांच की गई थी। गैस्ट्रोकोनेमियस मांसपेशियों के जमे हुए वर्गों की जांच लाल फ्लोरोसेंस की उपस्थिति के लिए की गई, जो कि माईफैबर ( चित्रा 5 ) के भीतर पाया गया था, यह दर्शाते हुए कि पीएमवी को संभवतः एनोसोइटोसिस के माध्यम से, साइटोप्लाज्म को दिया गया था। नोट, लाल फ्लुर्सकुंड myofiber (डेटा नहीं दिखाया गया) की परिधि के आसपास पाया गया था, यह दर्शाता है कि पीएमवी के एक बड़े अंश या तो नहीं थे या 12 घंटे के बाद इंजेक्शन पर एंडोसाइटिसोसिस की शुरुआत में थे।
चित्रा 1: फिल्टर यूनिट की विधानसभा। ( ए ) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉली कार्बोनेट झिल्ली ( बी ) व्यास में 3 सुक्ष्ममापी के ट्रैक-etched छिद्र, एक 20X उद्देश्य के साथ एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत देखा। स्केल बार = 50 माइक्रोन ( सी ) झिल्ली एक डिस्पोजेबल फिल्टर यूनिट के सहायक मैट्रिक्स के शीर्ष पर रखा गया था। ( डी ) अंदर एक झिल्ली के साथ इकट्ठे फ़िल्टर इकाई। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
पेज = "1"> 
चित्रा 2: बीएमएससी से पीएमवी की जनरेशन। ( ए ) चूहों से बीएमएससी एक 6-अच्छी तरह से थाली में खेती की जाती थी। ( बी ) बीएमएससी (5 x 10 5 ) ट्रिप्सिन पाचन द्वारा खरीदा गया था और संस्कृति के 500 μL में मोनोडीस्पर्स किया गया था। संलग्न और रिज़ःपेंडेड बीएमएससी की छवियों को 20 एक्स उद्देश्य के साथ ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत लिया गया था। ( सी ) फिल्टर इकाई से जुड़ी होने से पहले कोशिकाओं को इंसुलिन सिरिंज में लोड किया गया था। ( डी ) बीएमएससी से उत्पन्न पीएमवी 35 एमएम ग्लास-नीचे डिश में लोड किए गए थे और एक 20 एक्स उद्देश्य लेंस का उपयोग करते हुए एक औंधा चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत जांच की गई थी। स्केल सलाखों = 40 सुक्ष्ममापी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
Les / ftp_upload / 55741 / 55741fig3.jpg "/>
चित्रा 3: confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पीएमवी सामग्री की जांच। पीएमवी ( ए ) बीएमएससी से 48 घंटे के लिए पीओजीएफपी-एन 1 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था जो माइॉटोकॉन्ड्रिया के अस्तित्व का पता लगाने के लिए 30 मिनट के लिए माइॉटोकॉन्ड्रियल डाई (1 सुक्ष्ममापी) के साथ सीओप्टलस्मैमिक रूप से स्थानीय ईजीएफपी प्रोटीन, बी ( बी ) बीएमएससी का पता लगाया, या ( सी ) बीटीएससीएस 30 मिनट के लिए जेसी-1 (10 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ धुंधला हो जाना, मिटोकोंड्रिया की झिल्ली की क्षमता की पुष्टि करने के लिए। बीएमएससी से उत्पन्न पीएमवी 35 एमएम ग्लास-नीचे डिश पर लोड किए गए थे और एक 100 एक्स ऑयल लेंस लेंस का उपयोग करके confocal microscopy द्वारा जांच की गई थी। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 4: पीएमवी का एकाग्रता सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एस। बीएमएससी (5 x 10 5 ) ट्रिप्सिन पाचन द्वारा खरीदा गया था और 0.5 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम में पुन: पेश किया गया था, जिसे पीई के 2 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ या बिना पूरक किया गया था। उत्पन्न पीएमवी 5 मिनट के लिए 1200 ग्राम पर घूम रहे थे, संस्कृति के 100 μL में रिसाव किए गए थे, और एक 40 x तेल उद्देश्य के साथ एक confocal सूक्ष्मदर्शी के तहत जांच की गई। ( ए ) पीएमवी एकत्रीकरण की योजनाबद्धता शायद सेंटीफ्यूजेशन के बाद आसंजन अणुओं के संपर्क के कारण होती है। ( बी ) पीईवी के आरोप लगाए जाने के बाद मोनोडिस्पेंसिंग बनाए रखने के पीएमवी के योजनाबद्ध ( सी ) सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद समेकित पीएमवी। ( डी ) पीएमवी, पीई के साथ सकारात्मक चार्जिंग के कारण केंद्र वृद्धि के बाद कम एकत्रीकरण दिखाते हैं। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
ग्योर 5 "src =" / फ़ाइलें / एफटीपी_अपलोड / 55741 / 55741fig5.jpg "/>
चित्रा 5: सीएम-डीआई-लेबल पीएमवी की गैस्ट्रोकैनेमियस पेशी को वितरण। पीएमवी 5 x 10 5 बीएमएससी से उत्पन्न किये गये थे, centrifugation द्वारा 100 μL की मात्रा में ध्यान केंद्रित किया, और धीरे धीरे एक बाल्ब / सी माउस के गैस्ट्रोक्रॉनिएस मांसपेशी में इंजेक्ट किया गया। ( ए ) पीएमवी इंजेक्शन के योजनाबद्ध। ( बी ) सीएम-डीआई के साथ लेबल बीएमएससी; स्केल बार = 20 माइक्रोन ( सी ) सीएम-डीआई-लेबल बीएमएससी से उत्पन्न पीएमवी और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की; स्केल बार = 10 माइक्रोन ( डी ) गैस्ट्रोएंमेनियस मांसपेशी 12 घंटे के ऑपरेशन काटा गया; स्केल बार = 20 माइक्रोन ( ई - एच ) confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गैस्ट्रोएंमेनियस पेशी के फ्रोजन अनुभाग; स्केल बार = 10 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध को ली का शिंग फाउंडेशन, गुआंग्डोंग हाई-लेवल यूनिवर्सिटी प्रोजेक्ट "ग्रीन टेक्नोलॉजीज फॉर मरीन इंडस्ट्रीज," चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (http://www.nsfc.gov.cn/ ग्रांट नंबर 30 9 71665, 81172894, 81370 9 25), और ग्वांगडोंग शिक्षा विभाग (http://www.gdhed.edu.cn/ ग्रांट नं। सीसीजेड 1123)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 mL |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/mL |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75,000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
References
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
- Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
- Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
- Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
- López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H.
- Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
- Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
- Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
- Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
- Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
- Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
- Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
- Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
- Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, Unit 22F.12 (2013).
- Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print (2017).
- Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
- Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
- Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
- Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).
