Summary
Åldersrelaterade sjukdomar är förknippade med flera defekter i komponenterna i cytoplasman. Här presenterar vi ett protokoll för att förbereda plasmamembranvesiklar från benmärgs mesenkymala stamceller. Denna teknik kan potentiellt användas som ett medel för cytoplasmersättningsterapi för att förbättra eller till och med omvänt åldersrelaterade fenotyper.
Abstract
Vi har tidigare rapporterat om generering av plasmamembranvesiklar (PMV) genom mekanisk extrusion av däggdjursceller. Sammansmältningen av PMV med mitokondriella defekta Rho0-celler återställde mitotisk aktivitet under normala odlingsbetingelser. Ateroskleros, typ 2-diabetes, Alzheimers sjukdom och cancer är åldersrelaterade sjukdomar som har rapporterats vara förknippade med flera mekaniska och funktionella defekter i cytosolen och organellerna i olika celltyper. Benmärgs mesenkymala stamceller (BMSCs) representerar en unik cellpopulation från benmärgen som har självförnyelsekapacitet samtidigt som den behåller sin multipotens. Kompletteringen av senescensceller med ung cytoplasma från autologa BMSC via fusion av PMV ger ett lovande tillvägagångssätt för att förbättra eller till och med omvänt åldersrelaterade fenotyper. Detta protokoll beskriver hur man förbereder PMVs från BMSCs via extrudering genom ett polykarbonatmembran med 31; m porer, bestämma förekomsten av mitokondrier och undersöka upprätthållandet av membranpotentialen inom PMV med användning av ett konfokalt mikroskop, koncentrera PMVs genom centrifugering och genomföra in vivo injektion av PMV i muskels gastrocnemiusmuskel.
Introduction
En enorm mängd ansträngningar har ägnats åt att etablera tillvägagångssätt för gen-, enzym- och cellbytesterapier. Detta har resulterat i stora genombrott och till och med kliniska tillämpningar 1 , 2 , 3 . Nyligen applicerades en kontroversiell mitokondri-ersättningsbehandling baserad på kärnöverföringsteknik på in vitro fertilisering för kvinnor i ålderdom eller med en dödlig mitokondriell DNA-mutation 4 . Brister som finns i åldersrelaterade sjukdomar, inklusive ateroskleros, typ 2-diabetes, Alzheimers sjukdom och cancer, är vanligtvis mångfacetterade. Det har dokumenterats att ackumulering av lipiddroppar; Depositionen av amyloidprotein; Retentionen av utfällda proteiner i endoplasmatisk retikulum; Och defekt proteasom, autofagosom och mitokondrier bidrar till utvecklingen eller förvärringen av dessa sjukdomar"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . För närvarande finns det ingen tillgänglig mekanism som syftar till direkt remediering av fel i cytosolen och organellerna, vilket orsakar senescens och åldrande fenotyper.
Vi har tidigare rapporterat om generering av plasmamembranvesiklar (PMV) genom mekanisk extrusion av däggdjursceller 12 . Med undantag av kärnan hittades komponenter i membranet eller cytosolen, inklusive proteiner och RNA, liksom organellerna, såsom mitokondrier, i PMV. I huvudsak kan en PMV betraktas som en miniatyr enukleerad cell. Ännu viktigare återställde sammansmältningen av PMV med mitokondria-bristande Rho0-celler mitotisk aktivitet under normala odlingsbetingelser. Detta är den första rapporten om establiSkänka ett potentiellt effektivt tillvägagångssätt för cytoplasmersättningsterapi.
Benmärgs mesenkymala stamceller (BMSCs) är multipotenta stamceller som genereras rutinmässigt från benmärgen och expanderas lätt i odling. Embryonala stamcellsmarkörer Okt4, Nanog och SOX2 har detekterats vid låga nivåer i MSCs 13 . Telomerasaktivitet är också mätbar. Dessutom gör frånvaron av samstimulerande molekyler och humana leukocytantigen (HLA) klass II-molekyler, såväl som lågt HLA-klass I-uttryck på MSC, dem som ideala celler för allogen eller "off-the-shelf" användning i Både regenerativ medicin och immunmodulerande applikationer 14 .
Här beskriver vi hur man förbereder PMV från mus-BMSCs via extrudering genom ett polykarbonatmembran med 3 μm porer, bestämmer förekomsten av mitokondrier och undersöker underhållet av membranpotentialen i PMVs med hjälp av confocAl mikroskopi, förbereda koncentrerade men ej aggregerade PMV genom centrifugering och genomföra in vivo injektion av PMV i muskels gastrocnemius muskeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
8 till 12 veckor gamla BALB / c-möss köptes från Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, Kina) och uppväxt i en specifik patogenfri och luftkonditionerad djuranläggning. Djurvård och försöksförfaranden överensstämde med riktlinjerna för användning och vård av laboratoriedjur som grundades av Shantou University.
1. Montering av apparaten
- För att säkerställa sterilitet, sätt på UV-ljuset på en vävnadskulturhuvud i 30 minuter före användning.
- Skruva av en engångsfilm med 25 mm filter och nedsänk kåpan och botten av enheten i en 200 ml glaskopp fylld med 75% etanol i 30 minuter. Enheten är gjord av polypropen av medicinsk kvalitet.
- Plocka upp kåpan och botten av enheten med tångar, skaka av resterande etanol för hand och låt delarna lufttorka i 10 minuter i huven.
- Vatt ett 19 mm polykarbonatmembran i PBS och placera det försiktigt ovanpå bottens stödmatrisM av enheten. Polymerfilmen har en jämn, plan yta och spår-etsad 3 μm porer.
- Montera enheten igen genom att skruva locket ordentligt mot botten. Se till att membranet inte lossnar från mitten.
- Ta bort nålen i en 1 ml insprutningsspruta och dra 1 ml PBS. Fäst sprutan på filterenheten och tryck sedan PBS genom enheten för att blöta aggregatet och testa om det finns läckage.
2. Generering av plasmamembranvesiklar (PMV)
- Upprätta en BMSC-kultur, som rapporterats av Nemeth et al. 15 i DMEM-odlingsmedium innehållande 15% FBS och 1% penicillin / streptomycin. Odla cellerna i en 6-brunnsplatta i en fuktad inkubator innehållande 5% CO2 vid 37 ° C.
- För att sprida cellerna, ta bort odlingsmediet och skölj brunnen med 0,5 ml kalciumfritt PBS.
- Tillsätt 0,5 ml 0,25% trypsin-EDTA och inkubera cellerna vid 37 ° CI 3 min. Knacka plattan mot handflatan ett par gånger för att underlätta celldetachment. Sluta digestion genom att tillsätta 1 ml odlingsmedium.
- Samla cellerna i ett 15 ml koniskt rör och snurra vid 200 xg i 2 min i en bänk toppcentrifug. Resuspendera cellerna i 4 ml odlingsmedium och alikvot cellerna i två brunnar i en 6-brunnsplatta.
OBS! Celler når vanligtvis sammanflöde på cirka 24 timmar. - För att generera PMV, skörda cellerna från en brunn (ca 5 x 10 5 celler) av en 6-brunnsplatta genom trypsin-digestion och monodispera cellerna i 0,5 ml odlingsmedium.
- Ladda cellerna i insulinsprutan, fäst den på filterenheten och tryck på kolven snabbt för att klämma cellerna genom filtret. Kassera det extruderade mediet eftersom det bara borde finnas några få PMV inuti det.
- Ladda ytterligare 0,5 ml medium i sprutan och tryck det snabbt genom filtret. Samlat mediet av den andra strängsprutningen, som innehållerS PMVs av olika storlek.
- Ladda 150 μL av det uppsamlade mediet i en 35 mm glasbaserad maträtt och låt PMV: erna sätta sig i botten i ca 10 min. Undersök PMV: erna under ett inverterat faskontrastmikroskop utrustad med en CCD-kamera med 20X objektivlinsen.
3. Undersökning av innehållet i PMV: erna med hjälp av konfokal mikroskopi
- För att utföra transfektion i BMSC: erna, späd 2 μg supercoiled plasmid-DNA och 6 | il katjonisk transfektionsreagens ( t.ex. PolyJet) i 50 | il serumfri DMEM. Virvelblandningen blandas väl och roterar kort för att samla all vätska från rörets sidor.
- Tillsätt den utspädda lösningen (från steg 3.1) droppvis i utspädd DNA-lösning, virvelstark starkt under 1 minut, snurra kort och inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter.
- Byt ut det gamla mediet på BMSC: erna, vilka har utsöndts vid ca 30% sammanflöde över natten, med 2 ml färskt odlingsmedium och tillsätt DNEn transfektionsblandning droppvis.
- Ersätt med 2 ml färskt medium efter 12 timmars transfektion.
- För att spåra cytoplasmatiskt lokaliserade proteiner transfekterar cellerna med plasmiden innehållande en EGFP-expressionskassett (pEGFP-N1), såsom beskrivits ovan. Skörda cellerna genom trypsin digestion 48 h efter transfektion för PMV-generering, som beskrivits ovan.
- För att spåra mitokondrierna fläckar cellerna med mitokondriska färgämnen (1 uM, MitoTracker) i friskt odlingsmedium under 30 minuter vid 37 ° C.
- För att upptäcka mitokondriernas membranpotential, fläck cellerna med cyaninfärg JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetraklor-1,1', 3,3'-tetraetylbensimidazolylkarbocyaninjodid) (10 μg / Ml) i färskt odlingsmedium under 30 minuter vid 37 ° C.
- Tvätta cellerna med 0,5 ml PBS tre gånger och skörda sedan cellerna genom trypsin-digestion för PMV-generering, som beskrivits ovan.
- Ladda 150 μL av den insamlade medIum i en 35 mm glasbaserad maträtt och låt PMV: erna sätta sig i botten i ca 10 min. Undersök PMV: erna under ett konfokalmikroskop med hjälp av 100X-objektivlinsen.
- För att upptäcka EGFP eller mitokondriska färgämnen, slå på 488 nm laser och samla signalen vid 505-530 nm. För att upptäcka JC-1, slå på 488 nm och 543 nm lasrar och samla signaler vid 505-530 nm och 560-615 nm. Ställ in pinhålsvärdet till ca 1,4.
4. Framställning av koncentrerade PMV genom centrifugering
- Skörda cellerna genom trypsin digestion och generera PMV, som beskrivits ovan, i 0,5 ml odlingsmedium.
- Snurra PMV: erna vid 1200 xg i en bänkcentrifug i 5 minuter vid rumstemperatur. Aspirera försiktigt supernatanten och resuspendera pelleten i 100 | il odlingsmedium med försiktig vridning.
- Ladda 50 μL PMV i en 35 mm glasbottnad maträtt och låt dem sätta sig vid rumstemperatur i ca 10 min. Undersök PMV: ernaUnder ett konfokalmikroskop med 40X olje objektivlinsen.
- Lägg till serien av utspädd polyetylenimin (PEI) lösning till BMSC-kulturen i 1 h och kontrollera efter tecken på cytotoxicitet.
OBS: Här valdes PEI vid 2 μg / ml eftersom inga tecken på toxicitet detekterades i BMSC. - Skörda cellerna genom trypsin digestion och tillsätt PEI vid 2 μg / mL i 1 h för att ladda cellmembranet som ett medel för att förhindra aggregering. Generera PMV, som beskrivits ovan, i 0,5 ml odlingsmedium. Koncentrera PMV: erna och undersöka dem under ett konfokalt mikroskop, som beskrivits ovan.
5. Injektion av PMV i Gastrocnemius Muscle
- För att fläcka membranet tillsätt CM-DiI (klormetyldialkyl-indokarbocyanin) (10 | im) färgämne i 1 ml färskt odlingsmedium till BMSCs under 30 minuter.
- Skörda cellerna (ca 5 x 10 5 ) genom trypsin digestion och resuspendera dem i 0,5 ml odlingsmedium. Tillsätt PEI (2 μg / ml) för 1h. Generera och koncentrera PMV: erna i 100 | il odlingsmedium, såsom beskrivits ovan.
- Anestesera en BALB / c-mus genom att injicera natriumbarbital (10 mg / kg) efter 12 timmars fastande.
- Rengör utsidan av gastrocnemius muskeln med 75% etanol. Injicera PMV: erna (100 μL) långsamt i gastrocnemius-muskeln med hjälp av en 30 G insulinspruta.
- Efter administrering av anestesen, placera en våt gasbindning över ögonen under försöksperioden och värm musen med ett glödlampa tills det vaknar. Håll musen ensam i en individuell ventilationsbur.
- För att skörda gastrocnemiusmuskeln 12 h efter operationen, döda musen genom cervikal dislokation.
- Stänk 75% etanol över gastrocnemius muskeln, öppna huden med sax och skär ut hela gastrocnemius muskeln i båda ändarna.
- Skölj muskeln med PBS och undersök den under ett fluorescensmikroskop med 20X objektivlinsen.
- Trimma muskeln med aSkarpt rakblad för att avlägsna delarna utan fluorescens. Skär delarna med stark röd fluorescens i ca 9 mm 3 kuber.
- Bädda in varje kub i optimalt snittemperaturmedium (OCT), nedsänk det i flytande kväve i 5 minuter och förvara det i en -20 ° C frys tills användningen.
- Skär de frusna sektionerna i stycken 20 μm tjocka med hjälp av en kryostat och fäst varje sektion på en glasskiva. Skölj avsnittet en gång med PBS.
- Rita en cirkel runt sektionen med en fläckcirkelpenna och tillsätt 100 μL DAPI (1 μg / ml). Aspirera DAPI-lösningen efter 10 min inkubation vid rumstemperatur i mörkret och tvätta tre gånger med PBS.
- Lossa monteringsoljan över provet, täck den med en glidglidning och täta gliden med nagellack. Undersök avsnittet under ett konfokalmikroskop med hjälp av 100X-objektivlinsen.
- För att upptäcka CM-DiI, sätt på 543 nm-lasern och samla signalen vid 560-615 nm. För att upptäcka DAPI, sätt på 405Nm laser och samlar signal vid 420-480 nm. Ställ in pinhålvärdet till ca 1,4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nyckeln till en lyckad förberedelse av PMV beror på den korrekta monteringen av filterenheten ( Figur 1 ), som kan testas genom att trycka 1 ml PBS genom membranet. Om läckage uppstår, sätt ihop filterenheten och test igen. Läckaget kan dock endast testas på ett tillförlitligt sätt när cellerna skjuts genom membranet. Om det endast upptäcks några få PMV-värden under ett regelbundet mikroskop med 10X-objektivet, eller om storleken på PMVs är mestadels omkring 1 μm, skulle det indikera att de flesta cellerna är fastna inuti enheten på grund av felaktig montering. PMV med en storlek i intervallet ca 3 pm i diameter var övervägande när de undersöktes under ett faskontrastmikroskop med användning av 20X-målet ( Figur 2 ). Eftersom PMVs av nanometer-storlek inte var lätt att visualisera var andelen stora PMV i termer av antal låga. Det visade sig vara till hjälp att snabbt trycka in sprutan för att återställaDuce mängden membranavfall, som uppenbarligen misslyckas med att bilda sfäriska PMV. Vidare hittades PMV med mindre storlekar (mindre än 1 jim) i det första extrusionsmediet, med större PMV som utvanns i den andra strängsprutningen.
Den mest unika aspekten av PMV: erna var inkapslingen av cellulära komponenter bortsett från kärnan 12 . BMSCs transfekterades med en expressionskassett av EGFP under 48 timmar innan de användes för PMV-beredning. Resultaten visar att cytoplasmatiskt lokaliserat EGFP-protein kan inkapslas i PMV ( figur 3A ). Höljet av mitokondrier visades vid färgning av mitokondriska färgämnen, vilket visar att en stor del av, men inte alla, PMV innehåller gröna fluorescerande prickar, som indikerar mitokondrier ( Figur 3 ). Några av PMV: erna, även de med en diameter som är så stor som 3 μm, visade inte bevis på att de innehåller mitokondrier, vilket tyder påVid några mekaniska begränsningar kan förhindra inkapsling av mitokondrier i PMV. Membranpotentialen hos mitokondrier detekterades genom JC-1-färgning, vilken avger röd fluorescens när mitokondrier har en normal potential. Resultatet visar att röd fluorescens faktiskt detekterades i PMVs ( Figur 3 ), medan den gröna fluorescensen inte var detekterbar (data ej visad), vilket tyder på att mitokondrierna i PMV: erna var funktionella.
En koncentrationsprocess för PMV erfordras, speciellt för in vivo- applicering för att minska volymen såväl som för att avlägsna de cellulära komponenterna som frigörs under extrudering. Efter centrifugering vid 1 200 xg i 5 min vid rumstemperatur hittades mycket få PMV med mindre storlek i supernatanten. För att underlätta pellets resuspendering användes ett 2-ml rundbottensrör för centrifugering. De flesta PMV: erna aggregerades emellertid i pelleten, speciellt PMVs med mindre storlekar ( Figur 4 ). Detta beror förmodligen på vidhäftningsmolekyler på membranet. Mediet kompletterades därför med PEI (2 | ig / ml), vars koncentration var skräddarsydd för att inte ha någon märkbar cytotoxicitet. Den positiva laddningen av PEI fäst vid cellmembranet förhindrade aggregeringen av PMV under centrifugering ( Figur 4 ).
Slutligen märktes membranerna av BMSCs med CM-DiI-färgämne före framställningen av PMV: erna ( Figur 5 ). Efter koncentration injicerades PMV i muskels gastrocnemius muskler, vilka skördades 12 h efter operation och undersöktes under ett konfokalt mikroskop. Frysta delar av gastrocnemiusmusiken undersöktes för närvaron av röd fluorescens, vilken detekterades inom myofiberen ( Figur 5 ), vilket demonstrerade att PMV levererades till cytoplasman, förmodligen via endocytos. OBS: röda fluorerCence hittades runt myofiberens periferi (data ej visad), vilket indikerar att en stor del av PMV inte antingen endocytoserades eller var just i början av endocytos vid 12 h efter injektion.
Figur 1: Montering av filterenheten. ( A ) Kommersiellt tillgängliga polykarbonatmembran. ( B ) Spår-etsade porer med en diameter av 3 μm, betraktad under ett optiskt mikroskop med ett 20X-objektiv. Skala bar = 50 μm. ( C ) Membranet placerades ovanpå bärarmatrisen hos en engångsfilterenhet. ( D ) Den monterade filterenheten med ett membran inuti. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
page = "1"> 
Figur 2: Generering av PMV från BMSCs. ( A ) BMSC från mus odlades i en 6-brunnsplatta. ( B ) BMSCs (5 x 10 ^) skördades genom trypsin-digestion och monodispergerades i 500 | il odlingsmedium. Bilder av bifogade och resuspenderade BMSCs togs under ett optiskt mikroskop med ett 20X objektiv. ( C ) Celler laddades i en insulinspruta innan de fästes på filterenheten. ( D ) PMV som genererades från BMSCs laddades i en 35 mm glasbaserad maträtt och undersöktes under ett inverterat faskontrastmikroskop med en 20X objektivlins. Skalstänger = 40 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Les / ftp_upload / 55741 / 55741fig3.jpg "/>
Figur 3: Detektion av PMV-innehåll med konfokal mikroskopi. PMVs genererades från ( A ) BMSCs transfekterade med pEGFP-Nl under 48 timmar för att spåra det cytoplasmatiskt lokaliserade EGFP-proteinet, ( B ) BMSCs färgade med mitokondrialt färgämne (1 uM) under 30 minuter för att spåra förekomsten av mitokondrier eller BMSCs färgning med JC-1 (10 | ig / ml) under 30 min för att bekräfta membranpotentialen hos mitokondrier. PMV genererade från BMSCs laddades på en 35 mm glasbaserad maträtt och undersöktes av konfokal mikroskopi med en 100x olje objektivlins. Skalstänger = 10 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Koncentration av PMV S genom centrifugering. BMSC: er (5 x 105) skördades genom trypsin-digestion och resuspenderades i 0,5 ml odlingsmedium, vilket kompletterades med eller utan 2 | ig / ml PEI. Genererade PMV sönderdelades vid 1200 g under 5 min, resuspenderades i 100 | il odlingsmedium och undersöktes under ett konfokalt mikroskop med ett 40X oljemål. ( A ) Schematisk för PMV-aggregering troligen orsakad av interaktionen mellan adhesionsmolekylerna efter centrifugering. ( B ) Schematisk av PMV som upprätthåller monodispersion efter att ha laddats med PEI. ( C ) Aggregerade PMV efter centrifugering. ( D ) PMV visar mindre aggregering efter centrifugering på grund av positiv laddning med PEI. Skalstänger = 10 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Ren 5 "src =" / files / ftp_upload / 55741 / 55741fig5.jpg "/>
Figur 5: Leverans av CM-DiI-märkta PMV till gastrocnemius muskeln. PMV genererades från 5 x 10 ^ BMSCs, koncentrerades genom centrifugering i en volym av 100 | il och injicerades långsamt i gastrocnemius-muskeln i en BALB / c-mus. ( A ) Schematisk för PMV-injektion. ( B ) BMSCs märkta med CM-DiI; Skala bar = 20 μm. ( C ) PMV genererade från CM-DiI-märkta BMSCs och undersökt med konfokal mikroskopi; Skala bar = 10 μm. ( D ) Gastrocnemius muskel skördad 12 h efter operationen; Skala bar = 20 μm. ( E - H ) Frosna delen av gastrocnemius muskeln undersökt av konfokal mikroskopi; Skala bar = 10 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Li Ka Shing Foundation, Guangdong High Level University Project "Gröna Technologies for Marine Industries", Natural Science Foundation of China (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925) och Education Department of Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 mL |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/mL |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75,000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
References
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
- Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
- Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
- Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
- López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
- Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
- Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
- Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
- Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
- Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
- Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
- Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
- Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
- Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, Unit 22F.12 (2013).
- Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print (2017).
- Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
- Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
- Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
- Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).
