연령 관련 질환은 세포질 구성 요소의 여러 결함과 관련이 있습니다. 여기, 우리는 골수 간엽 줄기 세포에서 플라즈마 막 소포를 준비하는 프로토콜을 제시합니다. 이 기법은 연령 관련 phenotypes을 개선하거나 심지어 심지어 세포질 대체 요법의 수단으로 잠재적으로 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 이전에 포유류 세포의 기계적 압출을 통한 원형질막 소포 (PMVs)의 생성에 대해보고했다. 미토콘드리아 결핍 Rho0 세포와 PMVs의 융합은 정상적인 배양 조건 하에서 유사 분열 활성을 회복시켰다. 죽상 동맥 경화증, 제 2 형 당뇨병, 알츠하이머 병 및 암은 다양한 세포 유형의 세포질 및 세포 소기관에서 여러 가지 기계적 및 기능적 결함과 관련이 있다고보고 된 연령 관련 질환입니다. 골수 간엽 줄기 세포 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)는 다 기능성을 유지하면서자가 재생 능력을 보유한 골수에서 유래 된 독특한 세포 집단을 대표합니다. PMVs의 융합을 통한자가 BMSCs로부터의 어린 세포질을 가진 노화 세포의 보충은 노화와 연관된 표현형을 개선하거나 심지어 역전시키는 유망한 접근법을 제공한다. 이 프로토콜은 압출을 통해 BMSC에서 PMV를 준비하는 방법을 설명합니다.1, 공극, 미토콘드리아의 존재를 결정하고 공 촛점 현미경을 사용하여 PMV 내의 막 전위의 유지를 검사하고, 원심 분리에 의해 PMV를 농축하고 생쥐의 비복근 내로 PMV의 생체 내 주입을 수행한다.
서론
유전자, 효소 및 세포 대체 요법에 대한 접근법을 수립하는데 엄청난 노력이 기울여왔다. 이것은 획기적인 발전을 가져 왔고 심지어 임상 적용 1 , 2 , 3을 가져 왔습니다. 최근 핵 전달 기술에 기반을 둔 논란이되고있는 미토콘드리아 보충 요법이 노년기 여성 또는 치명적인 mitochondrial DNA 돌연변이를 가지고있는 체외 수정에 적용되었습니다. 아테롬성 동맥 경화증, 2 형 당뇨병, 알츠하이머 병 및 암을 포함한 연령 관련 질환에서 발견되는 결함은 대개 다각적입니다. 지질 방울의 축적이 문서화되어있다. 아밀로이드 단백질의 침전; 소포체에서 전개되지 않은 단백질의 유지; autophagosome, mitochondria가 이들 질병의 발달 또는 악화에 기여한다."xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 ,
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프로토콜
8-12 주된 BALB / c 마우스는 Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, China)에서 구입하여 특정 병원균이없고 공기가없는 동물 시설에서 자랐습니다. 동물 관리 및 실험 절차는 산 터우 대학 (Shantou University)에 의해 설립 된 실험용 동물의 사용 및 관리에 대한 지침을 준수했습니다.
1. 장치의 조립
- 무균 상태를 유지하려면 사용하기 전에 30 분 동안 조직 배양 후드의 자외선을 켭니다.
- 일회용 25 mm 필터 유닛의 나사를 풀고 캡과 장치의 바닥을 75 % 에탄올이 채워진 200 mL 유리 컵에 30 분간 담근다. 의료용 폴리 프로필렌으로 만들어졌습니다.
- 포셉을 사용하여 장치의 뚜껑과 바닥을 잡고 남은 에탄올을 손으로 털어 내고 부품을 후드에서 10 분 동안 공기 건조시킵니다.
- PBS에 19mm 폴리 카보네이트 멤브레인을 적신 다음 조심스럽게 보토의지지 매트릭스 위에 올려 놓습니다m입니다. 고분자 필름은 매끄럽고 평평한 표면을 가지고 있으며 3 μm의 공극을 트랙 에칭했습니다.
- 캡을 바닥에 단단히 조여서 장치를 다시 조립하십시오. 멤브레인이 중앙에서 빠지지 않았는지 확인하십시오.....
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결과
PMV의 성공적인 제조의 열쇠는 1 mL의 PBS를 멤브레인을 통과시켜 시험 할 수있는 필터 유닛 ( 그림 1 )의 정확한 조립에 크게 의존합니다. 누출이 발생하면 필터 장치를 다시 조립하고 다시 테스트하십시오. 그러나 누설은 세포가 멤브레인을 통과 할 때만 신뢰성있게 테스트 할 수 있습니다. 단지 10X 대물 렌즈를 사용하는 일반적인 현미경으로 PMV가 몇 개 발견되거나 PMV의 크기가 대부분 1μm 정도라면 부정확 한 조립으로 인해 대부분의 세포가 장치 내부에 갇히게됩니다. 직경 약 3 μm 범위의 PMV는 20X 대물 렌즈 ( 그림 2 )를 사용하여 위상차 현미경으로 검사했을 때 가장 두드러졌습니다. 나노 미터 크기의 PMV는 쉽게 시각화되지 않았기 때문에, 큰 PMV의 수에 대한 비율은 낮았다. 재빨리 주사기를 눌러서 다시 주사하는 것이 도움이되는 것으로 판명되었습니다.명백하게 구형 PMV를 형성하지 .......
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토론
이 원고에서 제안된 세포질 대체 요법은 유전자, 분자 및 세포 요법과 같은 다른 보고된 접근법에 비해 고유한 이점을 가지고 있습니다. BMSC에서 생성된 PMV는 줄기 유전자의 산물뿐만 아니라 노화와 관련된 노화 표현형을 치료하는 데 필수적인 온전한 세포 소기관도 캡슐화합니다. 젊은 세포질이 노화 세포에 전달되면 오작동 메커니즘이 잠시 완화될 수 있습니다. 동시에 후성유전체를 재프로그래밍하고 활성화하여 오래 지속되는 효과를 제공할 수 있습니다. 또한, 외인성 미토콘드리아는 이전 연구12에서 나타난 바와 같이 증식 속도가 더 빠를 수 있습니다. 미토콘드리아 기능 장애는 많은 노화 질환과 관련이 있기 때문에 손상된 미토콘드리아의 교체는 필수적입니다11. 또한, 줄기 세포와 달리 적출된 PMV는 증식할 수 없습니다. 따라서 암 발병에 대한 우려를 제기할 가능성은 거의 없습니다. 마지막으로, PMV에 핵 DNA가 부족하면 DNA 무작위 통합에 의한 게.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국의 자연 과학 재단 (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665)의 Li Ka Shing Foundation, 광동 고 수준 대학 프로젝트 "해양 산업을위한 녹색 기술" 81172894, 81370925) 및 광동 교육부 (http://www.gdhed.edu.cn/ 보조금 번호 cxzd1123).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| IsoporeTM 막 | Millipore | TSTP04700 | 3mm 포어 |
| 일회용 필터 유닛 | Xinya, 상하이, 중국 | 25mm | 의료용 폴리프로필렌 |
| 인슐린 주사기 | BD | 328446 1 mL | |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | 분자 프로브 | M7514 | Green FM, 1 μ M |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/mL |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75,000 |
| 형광 현미경 | Nikon | Eclipse TE 2000 | CCD 카메라 |
| 포함 Confocol 현미경 | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | 세포 형질 주입용 |
참고문헌
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
- Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Soli....
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재인쇄 및 허가
