Summary
연령 관련 질환은 세포질 구성 요소의 여러 결함과 관련이 있습니다. 여기, 우리는 골수 간엽 줄기 세포에서 플라즈마 막 소포를 준비하는 프로토콜을 제시합니다. 이 기법은 연령 관련 phenotypes을 개선하거나 심지어 심지어 세포질 대체 요법의 수단으로 잠재적으로 사용할 수 있습니다.
Abstract
우리는 이전에 포유류 세포의 기계적 압출을 통한 원형질막 소포 (PMVs)의 생성에 대해보고했다. 미토콘드리아 결핍 Rho0 세포와 PMVs의 융합은 정상적인 배양 조건 하에서 유사 분열 활성을 회복시켰다. 죽상 동맥 경화증, 제 2 형 당뇨병, 알츠하이머 병 및 암은 다양한 세포 유형의 세포질 및 세포 소기관에서 여러 가지 기계적 및 기능적 결함과 관련이 있다고보고 된 연령 관련 질환입니다. 골수 간엽 줄기 세포 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)는 다 기능성을 유지하면서자가 재생 능력을 보유한 골수에서 유래 된 독특한 세포 집단을 대표합니다. PMVs의 융합을 통한자가 BMSCs로부터의 어린 세포질을 가진 노화 세포의 보충은 노화와 연관된 표현형을 개선하거나 심지어 역전시키는 유망한 접근법을 제공한다. 이 프로토콜은 압출을 통해 BMSC에서 PMV를 준비하는 방법을 설명합니다.1, 공극, 미토콘드리아의 존재를 결정하고 공 촛점 현미경을 사용하여 PMV 내의 막 전위의 유지를 검사하고, 원심 분리에 의해 PMV를 농축하고 생쥐의 비복근 내로 PMV의 생체 내 주입을 수행한다.
Introduction
유전자, 효소 및 세포 대체 요법에 대한 접근법을 수립하는데 엄청난 노력이 기울여왔다. 이것은 획기적인 발전을 가져 왔고 심지어 임상 적용 1 , 2 , 3을 가져 왔습니다. 최근 핵 전달 기술에 기반을 둔 논란이되고있는 미토콘드리아 보충 요법이 노년기 여성 또는 치명적인 mitochondrial DNA 돌연변이를 가지고있는 체외 수정에 적용되었습니다. 아테롬성 동맥 경화증, 2 형 당뇨병, 알츠하이머 병 및 암을 포함한 연령 관련 질환에서 발견되는 결함은 대개 다각적입니다. 지질 방울의 축적이 문서화되어있다. 아밀로이드 단백질의 침전; 소포체에서 전개되지 않은 단백질의 유지; autophagosome, mitochondria가 이들 질병의 발달 또는 악화에 기여한다."xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . 현재, 노화 및 노화 표현형을 일으키는 세포질 및 세포 기관에서의 오작동의 직접적인 개선을 목표로하는 이용 가능한 메커니즘이 없다.
우리는 이전에 포유 동물 세포의 기계적 압출을 통해 플라즈마 막 소포 (PMVs)의 생성에 대해보고했습니다 12 . 핵을 제외하고는 미토콘드리아와 같은 세포 소기관뿐만 아니라 단백질과 RNA를 비롯한 막 또는 세포질의 구성 요소가 PMV에서 발견되었습니다. 본질적으로, PMV는 소형 핵 세포로 간주 될 수 있습니다. 더 중요한 것은, 미토콘드리아 결핍 Rho0 세포와 PMVs의 융합은 정상적인 문화 조건 하에서 mitotic 활동을 복원했다. 이것은 첫 번째 보고서입니다.세포질 대체 요법을위한 잠재적으로 효율적인 접근 방법을 제시하고있다.
골수 간엽 줄기 세포 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)는 골수에서 일상적으로 생성되는 다 분화 선조 세포 (multipotent progenitor cell)이며 배양 물에서 쉽게 확장됩니다. 배아 줄기 세포 마커 Oct4, Nanog 및 SOX2는 MSCs 13 에서 낮은 수준으로 검출되었다. 텔로 머라 아제 활성도 측정 가능합니다. 또한 MSC에서의 낮은 HLA Class I 발현뿐만 아니라 공동 자극 분자 및 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 II 분자의 부재는 동종 이성체 또는 "기성품 인"사용에 이상적인 세포로 작용합니다. 재생 의학 및 면역 조절 응용 14 .
여기, 우리는 3 μm의 공극을 가진 폴리 카보 네이트 멤브레인을 통해 압출을 통해 마우스 BMSC에서 PMV를 준비하는 방법, 미토콘드리아의 존재를 결정하는 방법 및 PMV에서 멤브레인 잠재력의 유지를 검사하는 방법을 설명합니다.현미경 검사법으로 원심 분리에 의해 응축 된 PMV가 아닌 농축 된 PMV를 준비하고 PMV를 생쥐의 비복근 내로 주입합니다.
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Protocol
8-12 주된 BALB / c 마우스는 Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, China)에서 구입하여 특정 병원균이없고 공기가없는 동물 시설에서 자랐습니다. 동물 관리 및 실험 절차는 산 터우 대학 (Shantou University)에 의해 설립 된 실험용 동물의 사용 및 관리에 대한 지침을 준수했습니다.
1. 장치의 조립
- 무균 상태를 유지하려면 사용하기 전에 30 분 동안 조직 배양 후드의 자외선을 켭니다.
- 일회용 25 mm 필터 유닛의 나사를 풀고 캡과 장치의 바닥을 75 % 에탄올이 채워진 200 mL 유리 컵에 30 분간 담근다. 의료용 폴리 프로필렌으로 만들어졌습니다.
- 포셉을 사용하여 장치의 뚜껑과 바닥을 잡고 남은 에탄올을 손으로 털어 내고 부품을 후드에서 10 분 동안 공기 건조시킵니다.
- PBS에 19mm 폴리 카보네이트 멤브레인을 적신 다음 조심스럽게 보토의지지 매트릭스 위에 올려 놓습니다m입니다. 고분자 필름은 매끄럽고 평평한 표면을 가지고 있으며 3 μm의 공극을 트랙 에칭했습니다.
- 캡을 바닥에 단단히 조여서 장치를 다시 조립하십시오. 멤브레인이 중앙에서 빠지지 않았는지 확인하십시오.
- 1 ML 인슐린 주사기의 바늘을 제거하고 PBS 1 ML을 그립니다. 주사기를 필터 장치에 연결 한 다음 PBS를 장치에 밀어 넣어 어셈블리를 적시고 누출이 있는지 테스트하십시오.
2. 플라즈마 막 소포 (PMVs)의 생성
- Nemeth et al. 에 의해보고 된대로 BMSC 문화를 확립 하십시오. 15 , 15 % FBS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유하는 DMEM 배양 배지에서 배양 하였다. 37 ° C에서 5 % CO 2 가 포함 된 humidified 인큐베이터에서 6 잘 접시에있는 세포를 육성.
- 세포를 증식시키기 위해 배양 배지를 제거하고 칼슘이없는 PBS 0.5 mL로 잘 헹구십시오.
- 0.25 % 트립신 - EDTA 0.5 ML을 추가하고 37에서 세포를 품어 ° C3 분 동안. 손바닥에 대해 접시를 몇 번 두드려 세포 분리를 촉진하십시오. 배양액 1 mL를 넣어 소화를 멈춘다.
- 벤치 상단 원심 분리기에서 2 분 200 XG 15 ML 원뿔 튜브와 회전에서 세포를 수집합니다. 배지 4 ML에 세포를 Resuspend하고 6 - 웰 플레이트의 두 우물에 세포를 나누어지는.
참고 : 세포는 대개 24 시간 내에 합류합니다. - PMVs를 생성하기 위해 트립신 소화에 의해 6-well plate의 한 well (약 5 x 10 5 cell)에서 세포를 수확하고 0.5 mL의 배양 배지에서 monodisperse시킨다.
- 인슐린 주사기에 세포를 넣고 필터 장치에 연결 한 다음 플런저를 빠르게 밀어 필터를 통과하는 세포를 쥐어 짜십시오. 내부에 몇 개의 PMV 만 있어야하기 때문에 압출 된 매체를 버립니다.
- 주사기에 추가로 0.5 mL의 배지를 넣고 신속하게 필터를 통과시킵니다. 포함 된 두 번째 압출 매체 수집다양한 크기의 PMV.
- 수집 된 매체 150 μL를 35 mm 유리 바닥 접시에 넣고 PMV를 약 10 분 동안 바닥에 고정시킵니다. 20X 대물 렌즈를 사용하여 CCD 카메라가 장착 된 역상 위상차 현미경으로 PMV를 검사합니다.
3. 공 촛점 현미경을 이용한 PMV 내의 내용물 검사
- BMSC에서 트랜 스펙 션을 수행하려면 50 μL의 무 혈청 DMEM에 2 μg의 supercoiled plasmid DNA와 6 μL의 양이온 transfection reagent ( 예 : PolyJet)를 희석하십시오. 소용돌이가 잘 섞이고 튜브의 측면에서 모든 액체를 수집하기 위해 잠시 회전합니다.
- 희석 된 DNA 용액에 희석 된 용액 (단계 3.1에서)을 적가하고, 1 분 동안 강하게 와동시키고, 짧게 회전시키고, 실온에서 10 분 동안 인큐베이션한다.
- 하룻밤 동안 약 30 %의 농도로 배양 된 BMSC의 새 배지를 2 mL의 새로운 배양 배지로 교체하고 DN형질 전환 혼합물을 적가합니다.
- 형질 감염 12 시간 후 신선한 매체 2 ML로 바꿉니다.
- 세포질로 현지화 된 단백질을 추적하려면 위에 설명한대로 EGFP 발현 카세트 (pEGFP-N1)를 포함하는 플라스미드로 세포를 형질 감염시킵니다. 위에서 설명한대로 PMV 생성에 대한 transfection 48 시간 후 트립신 소화에 의해 세포를 수확.
- 미토콘드리아를 추적하려면 37 ° C에서 30 분 동안 신선한 배지에서 미토콘드리아 염료 (1 μM, MitoTracker)로 세포를 염색하십시오.
- 미토콘드리아의 막 전위를 검출하기 위해, 시아닌 염료 JC-1 (5,5 ', 6,6'- 테트라 클로로 -1,1', 3,3'- 테트라 에틸 벤즈 미미 - 다 졸릴 카르 보시 아닌 요오드화물) (10 μg / ML) 37 ° C에서 30 분 신선한 배지에서.
- 위에서 설명한대로 PBS 0.5 ML의 세 번 세포를 씻어 후 PMV 생성에 대한 트립신 소화에 의해 세포를 수확.
- 150 μL의 수집 된 med로드ium을 35mm 유리 바닥 접시에 넣고 PMV를 약 10 분 동안 바닥에 내려 놓습니다. 100X 오일 객관적인 렌즈를 사용하여 공 촛점 현미경하에 PMVs를 검사하십시오.
- EGFP 또는 미토콘드리아 염료를 검출하려면 488 nm 레이저를 켜고 505-530 nm에서 신호를 수집하십시오. JC-1을 감지하려면 488nm 및 543nm 레이저를 켜고 505-530nm 및 560-615nm에서 신호를 수집합니다. 핀홀 값을 약 1.4로 설정하십시오.
4. 원심 분리에 의한 농축 된 PMV의 제조
- 트립신 소화에 의해 세포를 수확하고 위에서 설명한대로 PMVs를 0.5 ML 문화 매체에 생성합니다.
- 상온에서 5 분 동안 벤치 탑 원심 분리기에서 1,200 xg로 PMV를 돌립니다. 조심스럽게 상등액을 기음과 부드러운 소용돌이와 문화 매체의 100 μL에 펠렛을 resuspend.
- 35mm 유리 바닥 접시에 50 μL의 PMV를로드하고 약 10 분 동안 실온에서 안정되게하십시오. PMV 검사40X 오일 대물 렌즈를 사용하는 공 촛점 현미경 하에서.
- 1 시간 동안 BMSC 배양 물에 일련의 희석 된 폴리에틸렌 이민 (PEI) 용액을 첨가하고 세포 독성의 징후를 확인하십시오.
참고 : BMSC에서 독성의 징후가 발견되지 않았으므로 여기서 2 μg / mL의 PEI를 선택했습니다. - 트립신 소화하여 세포를 수확하고 응집을 방지하는 수단으로 세포막을 충전 1 H 2 μg / ML에 PEI를 추가합니다. 위에서 설명한대로 0.5 ML 문화 매체에서 PMVs를 생성합니다. 위에서 설명한대로 PMV를 집중시키고 공 촛점 현미경으로 검사하십시오.
5. 비복근 근육에 PMV 주사
- 막을 염색하기 위해 30 분 동안 BMSCs에 신선한 문화 매체 1 ML에 CM - DiI (chloromethyl dialkyl - indocarbocyanine) (10 μm의) 염료를 추가합니다.
- 트립신 소화에 의해 세포 (약 5 x 10 5 )를 수확하고 배양 배지 0.5 mL에 그들을 재현 탁한다. PEI (2 μg / mL)를 1h. 위에 설명한대로 PMV를 생성하고 100 μL의 배지에 집중시킵니다.
- 12 시간의 금식 후 sodium barbital (10 mg / kg)을 주사하여 BALB / c 마우스를 마취시킨다.
- 75 % 에탄올로 위의 근육의 외부를 청소하십시오. 천천히 30 G 인슐린 주사기를 사용하여 비복근 근육에 PMV (100 μL)를 주입합니다.
- 마취를 시행 한 후, 실험 기간 동안 눈 위에 젖은 거즈를 놓고 마우스가 깨어날 때까지 백열등으로 따뜻하게합니다. 개별 환기 케이지에 마우스를 홀로 두십시오.
- 수술 12 시간 후 gastrocnemius 근육을 수확하려면 경추 탈구로 마우스를 죽이십시오.
- gastrocnemius 근육 위에 75 % 에탄올을 뿌리고, 가위로 피부를 열고 양끝에서 전체 gastrocnemius 근육을 잘라내십시오.
- PBS로 근육을 헹구고 20X 객관적인 렌즈를 사용하여 형광 현미경으로 검사하십시오.
- 근육을 손질해라.날카로운 면도날로 형광이없는 부분을 제거합니다. 약 9mm 3의 입방체로 강한 붉은 색 형광으로 부품을 자릅니다.
- 최적의 절삭 온도 매체 (OCT)에 각 큐브를 삽입하고 5 분 동안 액체 질소에 담그고 -20 ° C의 냉동고에 보관하십시오.
- 냉동 섹션을 저온 유지 장치를 사용하여 20 μm 두께로 자르고 각 섹션을 유리 슬라이드에 부착하십시오. PBS로 절편을 한 번 헹굽니다.
- 얼룩 원형 펜으로 섹션 주위에 원을 그려 DAPI (1 μg / ML) 100 μL를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 10 분 잠복 후 DAPI 솔루션을 대기음과 PBS로 세 번 씻어.
- 시험편 위에 오일을 떨어 뜨리고, 유리 슬립으로 덮고 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하십시오. 100X 오일 객관적인 렌즈를 사용하여 공 촛점 현미경하에 섹션을 검사하십시오.
- CM-DiI를 검출하기 위해서는 543 nm 레이저를 켜고 560-615 nm에서 신호를 수집하십시오. DAPI를 감지하려면 405를 켭니다.420-480 nm에서 신호를 수집합니다. 핀홀 값을 약 1.4로 설정하십시오.
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Representative Results
PMV의 성공적인 제조의 열쇠는 1 mL의 PBS를 멤브레인을 통과시켜 시험 할 수있는 필터 유닛 ( 그림 1 )의 정확한 조립에 크게 의존합니다. 누출이 발생하면 필터 장치를 다시 조립하고 다시 테스트하십시오. 그러나 누설은 세포가 멤브레인을 통과 할 때만 신뢰성있게 테스트 할 수 있습니다. 단지 10X 대물 렌즈를 사용하는 일반적인 현미경으로 PMV가 몇 개 발견되거나 PMV의 크기가 대부분 1μm 정도라면 부정확 한 조립으로 인해 대부분의 세포가 장치 내부에 갇히게됩니다. 직경 약 3 μm 범위의 PMV는 20X 대물 렌즈 ( 그림 2 )를 사용하여 위상차 현미경으로 검사했을 때 가장 두드러졌습니다. 나노 미터 크기의 PMV는 쉽게 시각화되지 않았기 때문에, 큰 PMV의 수에 대한 비율은 낮았다. 재빨리 주사기를 눌러서 다시 주사하는 것이 도움이되는 것으로 판명되었습니다.명백하게 구형 PMV를 형성하지 못하는 막 파편의 양을 증가시킨다. 또한, 제 1 압출 매체에서보다 작은 크기 (1㎛ 미만)의 PMV가 발견되었고, 제 2 압출에서 더 큰 PMV가 회수되었다.
PMVs의 가장 독특한 측면은 핵을 제외하고 세포 구성 요소를 감싸는 것이 었습니다. BMSCs는 PMV 준비에 사용되기 전에 48 시간 동안 EGFP의 발현 카세트로 트랜 스펙 션되었다. 결과는 세포질에 국부 화 된 EGFP 단백질이 PMVs에 캡슐화 될 수 있음을 보여줍니다 ( 그림 3A ). 미토콘드리아의 엔클로저는 미토콘드리아 염료의 염색에 의해 입증되었으며, PMVs의 대부분이 미토콘드리아를 나타내는 녹색 형광 점을 포함하고 있음을 보여 주었다 ( 그림 3 ). 일부 PMV는 직경이 3 μm에 이르는 환자조차도 미토콘드리아를 함유하고 있다는 증거를 보이지 않아 th일부 기계적 제약 조건에서 미토콘드리아가 PMV로 캡슐화되는 것을 막을 수 있습니다. 미토콘드리아의 막 전위는 미토콘드리아가 정상적인 잠재력을 가질 때 적색 형광을 방출하는 JC-1 염색에 의해 검출되었다. 그 결과, 녹색 형광은 검출되지 않았지만 (PMV에서의 미토콘드리아가 기능적임을 암시 함), 적색 형광은 실제로 PMV에서 검출되었다 ( 도 3 ).
PMVs에 대한 농축 과정은 압출 과정 에서 방출되는 세포 성분을 제거 할뿐만 아니라 부피를 줄이기위한 생체 내 적용에 특히 필요합니다. 실온에서 1,200 xg에서 5 분간 원심 분리 한 후 상등액에서 작은 크기의 PMV가 거의 발견되지 않았다. 펠렛의 재현 탁을 용이하게하기 위해 2 mL 둥근 바닥 튜브를 원심 분리에 사용했다. 그러나, PMVs의 대부분은 pellet에서 응집되었고, 특히 P더 작은 크기의 MVs ( 그림 4 ). 이것은 아마도 멤브레인상의 접착 분자 때문일 것입니다. 따라서 배지는 눈에 띄는 세포 독성이 없도록 농도가 조정 된 PEI (2 μg / mL)로 보충되었다. 세포막에 부착 된 PEI의 양전하는 원심 분리 동안 PMV의 응집을 막았다 ( 그림 4 ).
마지막으로, BMSC의 막은 PMV의 준비 전에 CM-DiI 염료로 표지되었다 ( 그림 5 ). 농축 후, 수술 후 12 시간 동안 수확 한 마우스의 복근 근육에 PMV를 주사하여 공 초점 현미경 하에서 검사 하였다. gastrocnemius 근육의 냉동 섹션은 myofiber ( 그림 5 )에서 검출 된 적색 형광의 존재에 대해 검사하여 PMVs가 endocytosis를 통해 세포질로 전달되었음을 증명했습니다. 빨간 형광coss는 근섬유의 주변에서 발견되었으며 (데이터는 표시되지 않음), PMVs의 큰 부분이 endocytosis되지 않았거나 주사 후 12 시간에 endocytosis의 시작에 불과 함을 나타냅니다.
그림 1 : 필터 장치의 조립. ( A ) 상업적으로 이용 가능한 폴리 카보네이트 막. ( B ) 20X 대물 렌즈가있는 광학 현미경으로 볼 때 직경이 3 μm 인 트랙 에칭 된 구멍. 스케일 바 = 50 μm. ( C ) 멤브레인을 일회용 필터 유닛의지지 매트릭스 위에 놓았다. ( D ) 내부에 멤브레인이있는 조립 된 필터 유닛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2 : BMSC에서 PMV 생성. ( A ) 마우스의 BMSCs는 6 잘 판에서 재배되었다. ( B ) BMSC (5 X 10 5 )를 트립신 소화에 의해 수확하고 배양 배지 500 μL에서 단 분산시켰다. 부착되고 재현 된 BMSC의 이미지는 20X 대물 렌즈가있는 광학 현미경으로 촬영되었습니다. ( C ) 세포를 필터 장치에 부착하기 전에 인슐린 주사기에 넣었다. ( D ) BMSC에서 생성 된 PMV를 35mm 유리 바닥 접시에 넣고 20X 대물 렌즈를 사용하여 거꾸로 된 위상차 현미경으로 검사했습니다. 스케일 바 = 40 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3 : 공 촛점 현미경으로 PMV 콘텐츠의 감지. PMVs는 ( A ) 세포질로 국소화 된 EGFP 단백질을 추적하기 위해 48 시간 동안 pEGFP-N1로 형질 감염된 BMSC, ( B ) 미토콘드리아의 존재를 추적하기 위해 미토콘드리아 염색 (1μM)으로 염색 된 BMSCs, 또는 ( C ) 미토콘드리아의 막 전위를 확인하기 위해 JC-1 (10 μg / mL)로 30 분 동안 염색 된 BMSCs. BMSCs에서 생성 된 PMVs는 35mm 유리 바닥 접시에로드하고 100X 오일 객관적인 렌즈를 사용하여 공 촛점 현미경으로 검사. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : PMV의 농도 s의 원심 분리. BMSCs (5 x 10 5 )를 트립신 소화에 의해 수확하고 2 ㎍ / mL의 PEI를 보충 한 배양 배지 0.5 mL 중에 재현 탁시켰다. 생성 된 PMV를 1,200 g에서 5 분간 회전시키고, 배양 배지 100 μL에 재현 탁하고, 40 배 오일 대물 렌즈가있는 공 초점 현미경 하에서 검사 하였다. ( A ) 아마도 원심 분리 후 접착 분자의 상호 작용에 의해 야기 된 PMV 응집의 도식. ( B ) PEI로 충전 한 후 단 분산을 유지하는 PMV의 개략도. ( C ) 원심 분리 후 응집 된 PMVs. ( D ) PMV는 PEI로 양전하로 인해 원심 분리 후 응집이 적다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 5 : gastrocnemius 근육에 CM - DiI - 레이블 PMVs의 배달. PMVs는 5 x 105 BMSCs에서 생성되었고, 100 μL의 부피로 원심 분리에 의해 농축되었고, BALB / c 마우스의 비복근 근육에 서서히 주입되었다. ( A ) PMV 주입의 도식. ( B ) CM-DiI로 표지 된 BMSC; 스케일 바 = 20 μm. ( C ) CM-DiI- 표지 된 BMSC로부터 생성되고 공 초점 현미경 검사에 의해 조사 된 PMV; 눈금 막대 = 10 μm. ( D ) 수술 후 12 시간 동안 수유 한 비복근 근육; 스케일 바 = 20 μm. ( E - H ) 공 촛점 현미경으로 검사 gastrocnemius 근육의 냉동 섹션; 눈금 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국의 자연 과학 재단 (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665)의 Li Ka Shing Foundation, 광동 고 수준 대학 프로젝트 "해양 산업을위한 녹색 기술" 81172894, 81370925) 및 광동 교육부 (http://www.gdhed.edu.cn/ 보조금 번호 cxzd1123).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 mL |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/mL |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75,000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
References
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