Summary
Les maladies liées à l'âge sont associées à de multiples défauts dans les composants du cytoplasme. Ici, nous présentons un protocole pour préparer des vésicules à membrane plasmatique à partir de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse. Cette technique pourrait potentiellement être utilisée comme moyen de traitement de remplacement du cytoplasme pour améliorer ou même inverser les phénotypes associés à l'âge.
Abstract
Nous avons déjà signalé la génération de vésicules à membrane plasmatique (PMV) par l'extrusion mécanique de cellules de mammifères. La fusion des PMV avec des cellules Rho0 déficitaires mitochondriales a restauré l'activité mitotique dans des conditions de culture normales. L'athérosclérose, le diabète de type 2, la maladie d'Alzheimer et le cancer sont des maladies liées à l'âge qui ont été rapportées comme étant associées à de multiples défauts mécaniques et fonctionnels dans le cytosol et les organites d'une variété de types cellulaires. Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSC) représentent une population cellulaire unique à partir de la moelle osseuse qui possède des capacités d'auto-renouvellement tout en conservant leur multipotence. La supplémentation des cellules de sénescence avec un cytoplasme jeune provenant de BMSC autologues par fusion de PMV offre une approche prometteuse pour améliorer ou même inverser les phénotypes associés à l'âge. Ce protocole décrit comment préparer des PMV à partir de BMSC par extrusion à travers une membrane en polycarbonate avec 31, m pores, déterminent l'existence de mitochondries et examinent le maintien du potentiel de membrane dans les PMV en utilisant un microscope confocal, concentrent les PMV par centrifugation et effectuent l'injection in vivo de PMV dans le muscle gastrocnémien de la souris.
Introduction
Un énorme effort a été consacré à l'établissement d'approches pour les thérapies de remplacement des gènes, des enzymes et des cellules. Cela a entraîné de grandes percées et même des applications cliniques 1 , 2 , 3 . Récemment, une thérapie de remplacement mitochondrie controversée basée sur la technologie de transfert de noyau a été appliquée à la fécondation in vitro pour les femmes de la vieillesse ou portant une mutation de l'ADN mitochondrial létale 4 . Les défauts constatés dans les maladies liées à l'âge, y compris l'athérosclérose, le diabète de type 2, la maladie d'Alzheimer et le cancer, sont habituellement polyvalents. On a documenté que l'accumulation de gouttelettes lipidiques; Le dépôt de protéine amyloïde; La rétention des protéines dépliées dans le réticulum endoplasmique; Et le protéasome défectueux, les autophagosomes et les mitochondries contribuent au développement ou à l'aggravation de ces maladies"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . À l'heure actuelle, il n'existe aucun mécanisme disponible visant à remédier directement au dysfonctionnement du cytosol et des organites, ce qui provoque des phénotypes de sénescence et de vieillissement.
Nous avons déjà signalé la génération de vésicules à membrane plasmatique (PMV) par l'extrusion mécanique de cellules de mammifères 12 . À l'exception du noyau, des composants dans la membrane ou le cytosol, y compris les protéines et l'ARN, ainsi que les organites, comme les mitochondries, ont été trouvés dans les PMV. Essentiellement, un PMV peut être considéré comme une cellule énucléée en miniature. Plus important encore, la fusion des PMV avec des cellules Rho0 déficitaires en mitochondrie a restauré l'activité mitotique dans des conditions de culture normales. Il s'agit du premier rapport sur l'établissementUne approche potentiellement efficace pour la thérapie de remplacement du cytoplasme.
Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSC) sont des cellules progénitérales multipotentes qui sont générées de façon routinière à partir de la moelle osseuse et sont facilement développées en culture. Les marqueurs de cellules souches embryonnaires Oct4, Nanog et SOX2 ont été détectés à des niveaux faibles dans les MSC 13 . L'activité de la télomérase est également mesurable. En outre, l'absence de molécules co-stimulatrices et de molécules de classe II d'antigène de leucocyte humain (HLA), ainsi que d'une faible expression de HLA de classe I sur les MSC, en font des cellules idéales pour une utilisation allogénique ou "off-the-shelf" À la fois la médecine régénératrice et les applications immunomodulatrices 14 .
Ici, nous décrivons comment préparer des PMV à partir de BMSC de souris par extrusion à travers une membrane en polycarbonate avec des pores de 3 μm, déterminer l'existence de mitochondries et examiner le maintien du potentiel de membrane dans les PMV en utilisant du confocEn microscopie, préparer des PMV concentrées mais non agrégées par centrifugation et effectuer l'injection in vivo de PMV dans le muscle gastrocnémien de la souris.
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Protocol
Des souris BALB / c de 8 à 12 semaines ont été achetées auprès du Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, Chine) et élevées dans une installation animale sans agents pathogènes et climatisée. Les soins animaux et les procédures expérimentales étaient conformes aux lignes directrices pour l'utilisation et l'entretien des animaux de laboratoire établis par l'Université de Shantou.
1. Assemblage de l'appareil
- Pour assurer la stérilité, allumez la lumière UV d'un capuchon de culture tissulaire pendant 30 minutes avant utilisation.
- Dévissez une unité de filtre jetable de 25 mm et immergez le capuchon et le bas de l'unité dans une tasse de verre de 200 ml remplie d'éthanol à 75% pendant 30 minutes. L'unité est faite de polypropylène de qualité médicale.
- Ramenez le capuchon et le bas de l'unité à l'aide de pince, secouez l'éthanol restant à la main et laissez les pièces sécher à l'air pendant 10 minutes dans le capot.
- Mouiller une membrane en polycarbonate de 19 mm dans du PBS et la placer soigneusement sur la matrice de support du bottoM de l'unité. Le film polymère a une surface lisse, plate et des pores de 3 μm gravés sur piste.
- Remontez l'appareil en vissant le capuchon fermement contre le bas. Assurez-vous que la membrane n'est pas délogée du centre.
- Retirez l'aiguille d'une seringue d'insuline de 1 mL et tracez 1 mL de PBS. Fixez la seringue à l'unité de filtrage, puis appuyez sur PBS dans l'unité pour mouiller l'ensemble et pour vérifier s'il y a des fuites.
2. Génération de vésicules à membrane plasmatique (PMV)
- Établir une culture BMSC, tel que rapporté par Nemeth et al. 15 , dans un milieu de culture DMEM contenant 15% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine. Cultiver les cellules dans une plaque à 6 puits dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2 à 37 ° C.
- Pour propager les cellules, retirer le milieu de culture et rincer le puits avec 0,5 ml de PBS exempt de calcium.
- Ajouter 0,5 ml de trypsine-EDTA à 0,25% et incuber les cellules à 37 ° CPendant 3 min. Tapotez la plaque contre la paume de la main quelques fois pour faciliter le détachement de cellules. Arrêtez la digestion en ajoutant 1 mL de milieu de culture.
- Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml et tourner à 200 xg pendant 2 min dans une centrifugeuse de banquette. Remettre en suspension les cellules dans 4 ml de milieu de culture et aliquoter les cellules dans deux puits d'une plaque à 6 puits.
NOTE: Les cellules atteignent habituellement la confluence à environ 24 h. - Pour générer des PMV, récolter les cellules d'un puits (environ 5 x 10 5 cellules) d'une plaque à 6 puits par digestion par trypsine et monodisperser les cellules dans 0,5 mL de milieu de culture.
- Chargez les cellules dans la seringue d'insuline, attachez-la à l'unité de filtrage et enfoncez rapidement le piston pour presser les cellules à travers le filtre. Jeter le support extrudé car il ne devrait y avoir que quelques PMV à l'intérieur.
- Chargez 0,5 ml de milieu supplémentaire dans la seringue et passez-le rapidement dans le filtre. Collecte le moyen de la deuxième extrusion, qui contientS PMV de différentes tailles.
- Chargez 150 μL du milieu collecté dans un plat de verre de 35 mm et laissez les PMV se déposer vers le bas pendant environ 10 min. Examinez les PMV sous un microscope à contraste de phase inversé équipé d'une caméra CCD utilisant l'objectif de l'objectif 20X.
3. Examen du contenu dans les PMV utilisant la microscopie confocale
- Pour effectuer une transfection dans les BMSC, diluer 2 pg d'ADN plasmidique super-enroulé et 6 μl de réactif de transfection cationique ( par exemple PolyJet) dans 50 μL de DMEM sans sérum. Vortex pour bien mélanger et tourner brièvement pour collecter tous les liquides des côtés du tube.
- Ajouter la solution diluée (de l'étape 3.1) goutte à goutte dans une solution d'ADN diluée, vortex fortement pendant 1 min, tourner brièvement et incuber à température ambiante pendant 10 min.
- Remplacer l'ancien milieu sur les BMSC, qui ont été semés à environ 30% de confluence pendant la nuit, avec 2 mL de milieu de culture frais et ajouter DNUn mélange de transfection goutte à goutte.
- Remplacer avec 2 ml de milieu frais après 12 h de transfection.
- Pour tracer des protéines localisées cytoplasmiquement, transférez les cellules avec le plasmide contenant une cassette d'expression EGFP (pEGFP-N1), comme décrit ci-dessus. Récolte les cellules par digestion par trypsine 48 h après la transfection pour la génération de PMV, comme décrit ci-dessus.
- Pour tracer les mitochondries, tacher les cellules avec du colorant mitochondrial (1 μM, MitoTracker) dans un milieu de culture frais pendant 30 min à 37 ° C.
- Pour détecter le potentiel membranaire des mitochondries, tacher les cellules avec le colorant cyanine JC-1 (5,5 ', 6,6'-tétrachloro-1,1', 3,3'-tétraéthylbenzimi-diozolcarbocyanine iodure) (10 pg / Ml) dans un milieu de culture frais pendant 30 min à 37 ° C.
- Laver les cellules avec 0,5 ml de PBS trois fois, puis récolter les cellules par digestion par trypsine pour la génération de PMV, comme décrit ci-dessus.
- Chargez 150 μL du médicament collectéDans un plat en verre de 35 mm et permettre aux PMV de s'installer vers le bas pendant environ 10 min. Examinez les PMV sous un microscope confocal à l'aide de l'objectif 100X d'objectif d'huile.
- Pour détecter l'EGFP ou le colorant mitochondrial, allumez le laser 488 nm et collectez le signal à 505-530 nm. Pour détecter JC-1, allumez les lasers 488 nm et 543 nm et collectez les signaux à 505-530 nm et 560-615 nm. Réglez la valeur de l'épi à environ 1,4.
4. Préparation des PMV concentrés par centrifugation
- Récolter les cellules par digestion par trypsine et générer des PMV, comme décrit ci-dessus, dans 0,5 ml de milieu de culture.
- Faire tourner les PMV à 1 200 xg dans une centrifugeuse de table pendant 5 minutes à température ambiante. Aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 100 μL de milieu de culture avec un tourbillonnement doux.
- Chargez 50 μL de PMV dans un plat de verre de 35 mm et leur permettent de déposer à température ambiante pendant environ 10 min. Examiner les PMVSous un microscope confocal à l'aide de l'objectif d'huile 40X.
- Ajouter la série de la solution de polyéthylénimine diluée (PEI) à la culture BMSC pendant 1 heure et vérifier les signes de cytotoxicité.
NOTE: Ici, le PEI à 2 μg / mL a été choisi car aucun signe de toxicité n'a été détecté dans les BMSC. - Récolte les cellules par digestion par trypsine et ajoutez de l'Île-du-Prince-Édouard à 2 μg / mL pendant 1 h pour charger la membrane cellulaire afin de prévenir l'agrégation. Générer des PMV, comme décrit ci-dessus, dans 0,5 ml de milieu de culture. Concentrez les PMV et examinez-les sous un microscope confocal, comme décrit ci-dessus.
5. Injection de PMV dans le muscle Gastrocnemius
- Pour tacher la membrane, ajouter du colorant CM-DiI (chlorométhyl dialkyl-indocarbocyanine) (10 uM) dans 1 ml de milieu de culture frais aux BMSC pendant 30 minutes.
- Récolter les cellules (environ 5 x 10 5 ) par digestion par trypsine et les réinstaller dans 0,5 ml de milieu de culture. Ajouter PEI (2 μg / mL) pour 1H. Générer et concentrer les PMV dans 100 μL de milieu de culture, comme décrit ci-dessus.
- Anesthésier une souris BALB / c en injectant du barbital de sodium (10 mg / kg) après 12 h de jeûne.
- Nettoyez l'extérieur du muscle gastrocnémique avec 75% d'éthanol. Injecter lentement les PMV (100 μL) dans le muscle gastrocnémien en utilisant une seringue à insuline 30 G.
- Après avoir administré l'anesthésie, placez une gaze humide sur les yeux pendant la durée de l'expérience et réchauffez la souris avec une lumière incandescente jusqu'à ce qu'elle se réveille. Entreposer la souris seule dans une cage de ventilation individuelle.
- Pour récolter le muscle gastrocnémien 12 h après l'opération, tuer la souris par dislocation cervicale.
- Saupoudrer 75% d'éthanol sur le muscle gastrocnémien, ouvrir la peau avec des ciseaux et couper l'ensemble du muscle gastrocnémien aux deux extrémités.
- Rincez le muscle avec du PBS et examinez-le sous un microscope à fluorescence à l'aide de l'objectif 20X.
- Couper le muscle avec unLame de rasoir pointu pour enlever les pièces sans fluorescence. Coupez les pièces avec une forte fluorescence rouge dans environ 9 mm 3 cubes.
- Intégrez chaque cube dans un milieu de température de coupe optimal (OCT), immergez-le dans de l'azote liquide pendant 5 min et rangez-le dans un congélateur de -20 ° C jusqu'à l'utilisation.
- Couper les sections congelées en morceaux de 20 μm d'épaisseur à l'aide d'un cryostat et adhérer chaque section à une glissière en verre. Rincer la section une fois avec PBS.
- Dessinez un cercle autour de la section avec un stylo circulaire et ajoutez 100 μL de DAPI (1 μg / mL). Aspirer la solution DAPI après 10 minutes d'incubation à température ambiante dans l'obscurité et laver trois fois avec du PBS.
- Abaissez l'huile de montage sur l'échantillon, recouvrez-le avec un glissement de verre et scellez la glissière avec un vernis à ongles. Examinez la section sous un microscope confocal à l'aide de l'objectif 100X d'objectif d'huile.
- Pour détecter CM-DiI, allumez le laser à 543 nm et collectez le signal à 560-615 nm. Pour détecter DAPI, allumez le 405Nm laser et signal de collecte à 420-480 nm. Réglez la valeur de l'épingle à environ 1,4.
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Representative Results
La clé d'une préparation réussie de PMV dépend fortement du bon assemblage de l'unité de filtrage ( Figure 1 ), qui peut être testé en poussant 1 mL de PBS à travers la membrane. En cas de fuite, remonter l'unité de filtration et tester à nouveau. Cependant, la fuite ne peut être testée de manière fiable que lorsque les cellules sont poussées à travers la membrane. Si seulement quelques PMV sont détectés sous un microscope régulier à l'aide de l'objectif 10X, ou si la taille des PMV est principalement d'environ 1 μm, cela indiquerait que la plupart des cellules sont piégées dans l'unité en raison d'un montage incorrect. Les PMV avec une taille d'environ 3 μm de diamètre étaient prédominants lorsqu'ils étaient examinés sous un microscope à contraste de phase en utilisant l'objectif 20X ( Figure 2 ). Étant donné que les PMV de taille nanométrique n'ont pas été facilement visualisés, le pourcentage de PMV grand en termes de nombre était faible. Il a été jugé utile d'appuyer rapidement sur la seringue pour reLa quantité de débris de membrane, qui apparemment ne parvient pas à former des PMV sphériques. En outre, des PMV de plus petites tailles (moins de 1 μm) ont été trouvés dans le premier milieu d'extrusion, avec des PMV plus volumineux récupérés dans la deuxième extrusion.
L'aspect le plus unique des PMV était l'inclusion de composants cellulaires en dehors du noyau 12 . Les BMSC ont été transfectés avec une cassette d'expression d'EGFP pendant 48 h avant d'être utilisés pour la préparation de PMV. Les résultats montrent que la protéine EGFP localisée cytoplasmiquement peut être encapsulée dans les PMV ( figure 3A ). L'encerclement des mitochondries a été mis en évidence par la coloration du colorant mitochondrial, ce qui montre qu'une grande fraction de PMV, mais pas tous, contient des points fluorescents verts, indiquant des mitochondries ( figure 3 ). Certains des PMV, même ceux ayant un diamètre aussi grand que 3 μm, n'ont pas montré de signes de mitochondrie, ce qui suggèreÀ certaines contraintes mécaniques pourrait empêcher l'encapsulation des mitochondries dans les PMV. Le potentiel membranaire des mitochondries a été détecté par la coloration JC-1, qui émet une fluorescence rouge lorsque les mitochondries ont un potentiel normal. Le résultat montre que la fluorescence rouge a effectivement été détectée dans les PMV ( Figure 3 ), alors que la fluorescence verte n'était pas détectable (données non présentées), suggérant que les mitochondries au sein des PMV étaient fonctionnelles.
Un processus de concentration pour les PMV est nécessaire, en particulier pour une application in vivo pour réduire le volume ainsi que pour éliminer les composants cellulaires libérés lors de l'extrusion. Après centrifugation à 1 200 xg pendant 5 min à température ambiante, très peu de PMV de plus petite taille ont été trouvés sur le surnageant. Pour faciliter la remise en suspension de la pastille, un tube à fond rond de 2 ml a été utilisé pour la centrifugation. Cependant, la plupart des PMV ont été agrégés dans la pastille, en particulier PMV de tailles plus petites ( Figure 4 ). Ceci est probablement dû aux molécules d'adhérence sur la membrane. Le milieu a donc été complété par PEI (2 μg / mL), dont la concentration a été conçue pour ne pas avoir de cytotoxicité notable. La charge positive de PEI attachée à la membrane cellulaire a empêché l'agrégation des PMV pendant la centrifugation ( Figure 4 ).
Enfin, les membranes des BMSC ont été marquées avec du colorant CM-DiI avant la préparation des PMV ( Figure 5 ). Après la concentration, les PMV ont été injectés dans les muscles gastrocnémiens de la souris, qui ont été récoltés 12 heures après l'opération et examinés sous un microscope confocal. Des coupes glacées du muscle gastrocnémien ont été examinées pour détecter la présence de fluorescence rouge qui a été détectée dans la myofibre ( figure 5 ), ce qui démontre que les PMV ont été administrés au cytoplasme, probablement par endocytose. A noter, les fluorescents rougesOn a constaté que l'on trouvait autour de la périphérie de la myofibre (données non présentées), ce qui indique qu'une grande fraction de PMV n'était pas endocytée ou était juste au début de l'endocytose à 12 heures après l'injection.
Figure 1: Assemblage de l'unité de filtrage. ( A ) Les membranes en polycarbonate disponibles dans le commerce. ( B ) Pores gravés sur piste de 3 μm de diamètre, visibles sous un microscope optique avec un objectif 20X. Barre d'échelle = 50 μm. ( C ) La membrane a été placée sur la matrice de support d'une unité de filtre jetable. ( D ) L'unité de filtration assemblée avec une membrane à l'intérieur. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 2: Génération de PMV à partir de BMSC. ( A ) Les BMSC provenant de souris ont été cultivées dans une assiette de 6 puits. ( B ) Les BMSC (5 x 10 5 ) ont été récoltées par digestion par trypsine et ont été monodispersées dans 500 μL de milieu de culture. Les images de BMSC attachés et remis en suspension ont été prises sous un microscope optique avec un objectif 20X. ( C ) Les cellules ont été chargées dans une seringue d'insuline avant d'être attachées à l'unité de filtrage. ( D ) Les PMV générés à partir de BMSC ont été chargés dans un plat de fond de verre de 35 mm et examinés sous un microscope à contraste de phase inversé à l'aide d'une lentille d'objectif 20X. Barres d'échelle = 40 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 3: Détection de la teneur en PMV par microscopie confocale. Les PMV ont été générés à partir de ( A ) BMSC transfectés avec du pEGFP-N1 pendant 48 h pour tracer la protéine EGFP localisée cytoplasmiquement, ( B ) BMSCs colorés au colorant mitochondrial (1 μM) pendant 30 minutes pour tracer l'existence de mitochondries, ou ( C ) BMSCs colorant avec JC-1 (10 μg / mL) pendant 30 minutes pour confirmer le potentiel membranaire des mitochondries. Les PMV générés à partir de BMSC ont été chargés sur un plat de verre de 35 mm et examinés par microscopie confocale à l'aide d'un objectif d'huile 100X. Barres d'échelle = 10 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Concentration de PMV S par centrifugation. Les BMSC (5 x 10 5 ) ont été récoltées par digestion par trypsine et remises en suspension dans 0,5 ml de milieu de culture, qui a été complété avec ou sans 2 μg / mL de PEI. Les PMV générées ont été centrifugées à 1 200 g pendant 5 min, remises en suspension dans 100 μl de milieu de culture et examinées sous un microscope confocal avec un objectif huile 40X. ( A ) Schéma de l'agrégation de PMV probablement causé par l'interaction des molécules d'adhésion après centrifugation. ( B ) Schéma de PMVs qui maintient la monodispersion après avoir été chargé avec PEI. ( C ) PMV agrégés après centrifugation. ( D ) Les PMV montrent moins d'agrégation après centrifugation en raison d'une charge positive avec PEI. Barres d'échelle = 10 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 5: Livraison des PMV marquées par CM-DiI au muscle gastrocnémien. Les PMV ont été générés à partir de 5 x 10 5 BMSC, concentrés par centrifugation en un volume de 100 μL, et injectés lentement dans le muscle gastrocnémien d'une souris BALB / c. ( A ) Schéma d'injection de PMV. ( B ) BMSC étiquetés avec CM-DiI; Barre d'échelle = 20 μm. ( C ) les PMV générées à partir de BMSC marquées par CM-DiI et examinées par microscopie confocale; Barre d'échelle = 10 μm. ( D ) Le muscle gastrocnémien a été récolté 12 heures après l'opération; Barre d'échelle = 20 μm. ( E - H ) Section glacée du muscle gastrocnémien examinée par microscopie confocale; Barre d'échelle = 10 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par la Fondation Li Ka Shing, le projet de l'Université de haut niveau de Guangdong "Technologies vertes pour les industries maritimes", la Fondation des sciences naturelles de la Chine (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925), et le Département de l'éducation de Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 mL |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/mL |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75,000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
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