Summary
加齢性疾患は、細胞質成分の複数の欠陥に関連している。ここでは、骨髄間葉系幹細胞から原形質膜小胞を調製するためのプロトコールを提示する。この技術は、加齢に関連した表現型を改善する、またはそれを逆転させるための細胞質置換療法の手段として潜在的に使用することができる。
Abstract
私たちはこれまで、哺乳動物細胞の機械的押出しによる原形質膜小胞（PMV）の生成について報告してきた。 PMVとミトコンドリア欠損Rho0細胞との融合は、正常培養条件下で有糸分裂活性を回復させた。アテローム性動脈硬化症、2型糖尿病、アルツハイマー病および癌は、様々な細胞型の細胞質ゾルおよび細胞小器官における複数の機械的および機能的欠陥に関連すると報告されている加齢性疾患である。骨髄間葉系幹細胞（BMSC）は、多能性を維持しながら自己再生能力を有する骨髄由来の独特の細胞集団を表す。 PMVの融合を介した自己BMSCからの若い細胞質による老化細胞の補充は、加齢に関連する表現型を改善する、または逆転させる有望なアプローチを提供する。このプロトコルは、押出によってBMSCからPMVをポリカーボネート膜を介して3つミオソンドリアの存在を判定し、共焦点顕微鏡を用いてPMV内の膜電位の維持を調べ、遠心分離によってPMVを濃縮し、マウスの腓腹筋にPMVのインビボ注入を行う。
Introduction
遺伝子、酵素および細胞置換療法のためのアプローチを確立することに多大な努力が注がれてきた。これは大きなブレークスルー、さらには臨床応用1,2,3をもたらしました。最近、核移植技術に基づいた議論の余地のあるミトコンドリア補充療法が、高齢の女性または致死的ミトコンドリアDNA突然変異を有する女性の体外受精に適用された 4 。アテローム性動脈硬化症、2型糖尿病、アルツハイマー病、および癌を含む、年齢関連疾患に見られる欠陥は、通常多面的である。脂質液滴の蓄積が報告されている。アミロイドタンパク質の沈着;小胞体における折り畳まれていないタンパク質の保持;オートファゴソーム、およびミトコンドリアの欠陥が、これらの疾患の発症または悪化に寄与する"xref"> 5,6,7,8,9,10,11。現在、老化および老化表現型を引き起こす細胞質および細胞小器官における機能不全の直接修復を目的とした利用可能なメカニズムは存在しない。
私たちはこれまで、哺乳動物細胞の機械的な押し出しによる原形質膜小胞（PMVs）の生成について報告しています12 。核を除いて、膜または細胞質ゾル（タンパク質およびRNAを含む）ならびに細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）の成分が、PMVにおいて見出された。本質的に、PMVは小型除核細胞とみなすことができる。さらに重要なことに、PMVとミトコンドリア欠損Rho0細胞との融合は、正常培養条件下で有糸分裂活性を回復させた。これは、最初の報告書です。潜在的に効率的な細胞質補充療法のアプローチを提案している。
骨髄間葉系幹細胞（BMSC）は、骨髄から日常的に生成され、培養において容易に増殖する多能性前駆細胞である。胚性幹細胞マーカーOct4、Nanog、およびSOX2は、MSCsにおいて低レベルで検出されている13 。テロメラーゼ活性も測定可能である。さらに、MSC上での共刺激分子およびヒト白血球抗原（HLA）クラスII分子の不在および低HLAクラスI発現は、それらを同種異系または「既製品」使用のための理想的な細胞にする再生医療と免疫調節アプリケーションの両方14 。
ここでは、3μm孔のポリカーボネート膜を介した押し出しによるマウスBMSCからPMVを調製する方法、ミトコンドリアの存在を決定する方法、およびコンポックを用いてPMVにおける膜電位の維持を調べる方法を説明する遠心分離によって濃縮されたが凝集していないPMVを調製し、マウスの腓腹筋にPMVをインビボで注入する。
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Protocol
8〜12週齢のBALB / cマウスをShanghai Experimental Animal Center（上海、中国）から購入し、特定の病原体および空調された動物施設で飼育した。動物のケアおよび実験手順は、汕頭大学によって設立された実験動物の使用およびケアのためのガイドラインに従っていた。
1.装置の組み立て
- 無菌性を確保するために、使用前に組織培養フードのUV光を30分間点灯させます。
- 使い捨ての25 mmフィルターユニットを外し、75％エタノールで満たした200 mLのガラスカップにユニットのキャップと底部を30分間浸します。ユニットは医療グレードのポリプロピレン製です。
- 鉗子を使用してキャップとユニットの底部を持ち上げ、残りのエタノールを手で振り落とし、部品をフード内で10分間空気乾燥させます。
- PBSで19 mmのポリカーボネート膜を湿らせ、ボトムの支持マトリックスの上に注意深く置きますユニットのm。ポリマーフィルムは滑らかで平坦な表面を有し、トラックエッチングされた3μmの孔を有する。
- キャップを底部にしっかりとねじ込むことによってユニットを組み立て直します。メンブレンが中心から外れていないことを確認してください。
- 1mLインスリン注射器の針を外し、1mLのPBSを採取する。シリンジをフィルターユニットに取り付け、PBSをユニットに押し込んでアセンブリを濡らし、漏れがないかどうかをテストします。
2.血漿膜小胞（PMVs）の生成
- Nemeth らによって報告されているように、BMSC培養を確立する。 15 ％のFBSおよび1％のペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM培地中で培養した。 37℃で5％CO 2を含む加湿インキュベーター内で6ウェルプレート中で細胞を培養する。
- 細胞を増殖させるために、培地を除去し、0.5mLのカルシウムフリーPBSでウェルをすすぐ。
- 0.5mLの0.25％トリプシン-EDTAを添加し、細胞を37℃でインキュベートする3分間。細胞の剥離を容易にするために、プレートを手のひらに対して数回タップします。 1 mLの培地を加えて消化を停止する。
- 15mLコニカルチューブに細胞を集め、卓上遠心分離機で200×gで2分間回転させる。 4mLの培地に細胞を再懸濁し、細胞を6ウェルプレートの2つのウェルに分注する。
注：通常、細胞は約24時間でコンフルエンスに達する。 - PMVを生成するために、6ウェルプレートの1つのウェル（約5×10 5細胞）からトリプシン消化によって細胞を回収し、細胞を0.5mLの培地中に単分散する。
- インスリンシリンジに細胞をロードし、それをフィルターユニットに取り付け、プランジャーを素早く押して細胞をフィルターに押し込みます。内部には少数のPMVしかなければならないので、押出された媒体を捨てる。
- シリンジにさらに0.5 mLの培地をロードし、すばやくフィルターに通します。第2の押出物の媒体を回収した。様々なサイズのPMVがある。
- 収集した培地150μLを35mmのガラス底の皿にロードし、PMVを約10分間底に沈降させる。 20倍の対物レンズを使用してCCDカメラを備えた倒立位相差顕微鏡下でPMVを検査する。
3.共焦点顕微鏡を用いたPMV内の内容の検討
- BMSCでトランスフェクションを行うには、50μLの無血清DMEMに2μgのスーパーコイルプラスミドDNAと6μLのカチオントランスフェクション試薬（ 例えば PolyJet）を希釈します。ボルテックスしてよく混合し、チューブの側面から液体をすべて集めるために短時間回転させます。
- 希釈した溶液（ステップ3.1から）を希釈したDNA溶液に滴下し、強く1分間ボルテックスし、短時間回転させ、室温で10分間インキュベートする。
- 約30％のコンフルエンスで一晩播種したBMSC上の古い培地を新鮮な培地2mLで交換し、DNトランスフェクション混合物を滴下する。
- トランスフェクションの12時間後に2 mLの新鮮な培地と交換する。
- 細胞質に局在するタンパク質を追跡するために、上記のように、EGFP発現カセット（pEGFP-N1）を含むプラスミドで細胞をトランスフェクションする。上記のように、PMV生成のためのトランスフェクションの48時間後にトリプシン消化により細胞を回収する。
- ミトコンドリアを追跡するために、ミトコンドリア色素（1μM、MitoTracker）を用いて37℃で30分間新鮮な培地で細胞を染色する。
- ミトコンドリアの膜電位を検出するために、シアニン色素JC-1（5,5 '、6,6'-テトラクロロ-1,1'、3,3'-テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンヨージド）（10μg / mL）を37℃で30分間インキュベートした。
- 上記のように、0.5mLのPBSで細胞を3回洗浄し、PMV生成のためにトリプシン消化によって細胞を回収する。
- 採取したメディウム150μLを負荷するiumを35mmのガラス底の皿に入れ、PMVを約10分間底に沈降させる。 100倍の油対物レンズを使用して共焦点顕微鏡下でPMVを検査する。
- EGFPまたはミトコンドリア色素を検出するには、488 nmレーザーをオンにし、505〜530 nmでシグナルを収集します。 JC-1を検出するには、488 nmおよび543 nmレーザーをオンにし、505〜530 nmと560〜615 nmの信号を収集します。ピンホール値を約1.4に設定します。
4.遠心分離による濃縮PMVの調製
- トリプシン消化により細胞を回収し、0.5mLの培地中で上記のようにPMVを生成する。
- 室温で5分間、卓上遠心分離機で1200xgでPMVを回転させる。慎重に上清を吸引し、穏やかな渦巻きで100μLの培地にペレットを再懸濁する。
- 35mmのガラス底のディッシュに50μLのPMVをロードし、約10分間室温で沈降させる。 PMVを調べる40倍の油対物レンズを用いた共焦点顕微鏡下で測定した。
- 一連の希釈ポリエチレンイミン（PEI）溶液をBMSC培養液に1時間加え、細胞傷害性の兆候がないかチェックする。
注：BMSCでは毒性の兆候が検出されなかったので、ここでは2μg/ mLのPEIを選択した。 - トリプシン消化で細胞を採取し、2μg/ mLのPEIを1時間加えて凝集を防ぐ手段として細胞膜を充填する。上記のように、0.5mLの培地中でPMVを生成する。上記のように、PMVを濃縮し、共焦点顕微鏡下でそれらを調べる。
5.腓腹筋にPMVを注入する
- 膜を染色するために、CM-DiI（クロロメチルジアルキル - インドカルボシアニン）（10μM）色素を1mLの新鮮培地にBMSCに30分間添加する。
- トリプシン消化により細胞（約5×10 5 ）を採取し、0.5mLの培養培地にそれらを再懸濁する。 1に対してPEI（2μg/ mL）を添加するh。上記のように、PMVを生成し、100μLの培地に濃縮する。
- 絶食の12時間後にナトリウムバルビタール（10mg / kg）を注射してBALB / cマウスを麻酔する。
- 75％エタノールで腓腹筋の外側をきれいにする。 30Gインスリン注射器を用いて腓腹筋にPMV（100μL）をゆっくりと注入する。
- 麻酔を施した後、実験期間中、目の上にぬれたガーゼを置き、起きるまで白熱灯でマウスを暖める。個々の換気ケージにマウスを単独で収容する。
- 手術12時間後に腓腹筋を採取するには、頚椎脱臼によりマウスを殺す。
- 腓腹筋に75％エタノールを振りかけ、はさみで皮膚を開き、両端の腓腹筋全体を切り取ってください。
- PBSで筋肉をすすぎ、20倍の対物レンズを使用して蛍光顕微鏡下で調べます。
- 筋肉をトリムするシャープなカミソリの刃は、蛍光のない部分を取り除きます。強い赤色の蛍光を発する部分を約9 mm 3の立方体に切断します。
- 各キューブを最適な切断温度媒体（OCT）に埋め込み、5分間液体窒素に浸し、使用するまで-20℃の冷凍庫に保存します。
- クライオスタットを用いて凍結切片を20μmの厚さに切断し、各切片をガラススライドに接着させる。 PBSで1回洗浄します。
- 染色サークルペンで切片の周りに円を描き、100μLのDAPI（1μg/ mL）を加える。暗所で室温で10分間インキュベートした後、DAPI溶液を吸引し、PBSで3回洗浄する。
- 試料の上に油を落とし、ガラススリップで覆い、マニキュアでスライドを密封する。 100倍の油対物レンズを使用して、共焦点顕微鏡下のセクションを調べます。
- CM-DiIを検出するには、543 nmレーザーをオンにし、560-615 nmでシグナルを収集します。 DAPIを検出するには、405420〜480nmで信号を収集する。ピンホール値を約1.4に設定します。
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Representative Results
PMVをうまく調製するための鍵は、1mLのPBSをメンブレンに通して試験することができるフィルターユニット（ 図1 ）の正しい組み立てに大きく依存します。漏れが発生した場合は、フィルタユニットを再度組み立て、再度テストしてください。しかし、漏出は、細胞が膜を通って押し出されたときにのみ確実に試験することができる。 10倍の対物レンズを使用する通常の顕微鏡下で少数のPMVしか検出されない場合、またはPMVのサイズが主に約1μmである場合、不正確な組み立てのために細胞の大部分がユニット内に閉じ込められることを示す。直径約3μmの範囲のサイズを有するPMVは、20倍対物レンズ（ 図2 ）を用いて位相差顕微鏡下で検査したときに優勢であった。ナノメートルサイズのPMVは容易に可視化されなかったので、PMVの数の点での割合は低かった。シリンジをすばやく押して再起動すると便利です明らかに球状PMVを形成することができない膜破片の量を増加させる。さらに、より小さいサイズ（1μm未満）のPMVが第1の押出媒体中に見出され、より大きなPMVが第2の押出において回収された。
PMVのもっともユニークな側面は、核から離れた細胞成分の封入であった12 。 PMV調製に使用する前に、BMSCをEGFPの発現カセットで48時間トランスフェクションした。結果は、細胞質に局在したEGFPタンパク質をPMVに封入することができることを示している（ 図3A ）。ミトコンドリアの囲いは、ミトコンドリア色素の染色によって証明され、大部分のPMVにミトコンドリアを示す緑色蛍光ドットが含まれることを示した（ 図3 ）。 PMVの中には、直径が3μmのものも含めて、ミトコンドリアを含有しているという証拠は示されておらず、いくつかの機械的制約によって、PMVへのミトコンドリアのカプセル化が妨げられる可能性がある。ミトコンドリアの膜電位はJC-1染色によって検出され、これはミトコンドリアが正常な電位を有する場合に赤色の蛍光を発する。この結果は、PMVにおいて赤色蛍光が実際に検出されたが（ 図3 ）、緑色蛍光は検出できず（データは示さず）、PMV内のミトコンドリアが機能的であることが示唆された。
PMVの濃縮プロセスは、特に、 インビボでの適用のために、容積を減少させると共に、押出しの間に放出される細胞成分を除去するために必要である。室温で1,200×gで5分間遠心分離した後、上清にはより小さなサイズのPMVがほとんど見られなかった。ペレットの再懸濁を促進するために、2mL丸底チューブを遠心分離に使用した。しかし、PMVの大部分はペレット中に凝集しており、特にPより小さなサイズのMV（ 図4 ）。これはおそらく膜上の接着分子によるものであろう。したがって培地には顕著な細胞傷害性がないように濃度を調整したPEI（2μg/ mL）を補充した。細胞膜に付着したPEIの正電荷は、遠心分離の間にPMVの凝集を妨げた（ 図4 ）。
最後に、BMSCの膜をPMVの調製前にCM-DiI色素で標識した（ 図5 ）。濃縮後、PMVをマウスの腓腹筋に注入し、12時間後に採取し、共焦点顕微鏡下で検査した。腓腹筋の凍結切片を、筋線維内で検出された赤色蛍光の存在について調べ（ 図5 ）、PMVがおそらくエンドサイトーシスを介して細胞質に送達されたことを実証した。赤色の蛍光（データは示されていない）、これは、PMVの大部分がエンドサイトーシスされていないか、または注入後12時間でエンドサイトーシスの開始時であったことを示す。
図1：フィルタユニットの組み立て。 （ A ）市販のポリカーボネート膜。 （ B ）20μmの対物レンズを備えた光学顕微鏡下で観察した直径3μmのトラックエッチドポア。スケールバー=50μm。 （ C ）膜を使い捨てフィルターユニットの支持マトリックスの上に置いた。 （ D ）内部に膜を有する組み立てられたフィルタユニット。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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図2：BMSCからのPMVの生成。 （ A ）マウス由来のBMSCを6ウェルプレートで培養した。 （ B ）BMSC（5×10 5 ）をトリプシン消化により回収し、500μLの培地で単分散させた。付着および再懸濁したBMSCの画像を、20倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡下で撮影した。 （ C ）細胞をフィルターユニットに取り付ける前にインスリン注射器に充填した。 （ D ）BMSCから生成されたPMVを35mmのガラス底皿に入れ、20倍の対物レンズを用いて倒立位相差顕微鏡下で検査した。スケールバー=40μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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図3：共焦点顕微鏡によるPMV含有量の検出。 PMVは、（ A ）ミトコンドリアの存在を追跡するためにミトコンドリア色素（1μM）で染色されたBMSC、または（ C ）ミトコンドリアの存在を追跡するために、（ A ）48時間、pEGFP-N1でトランスフェクトされたBMSCs、 BMSCをJC-1（10μg/ mL）で30分間染色して、ミトコンドリアの膜電位を確認した。 BMSCから生成されたPMVを35mmのガラス底のディッシュに載せ、100倍の油対物レンズを用いた共焦点顕微鏡検査によって検査した。スケールバー=10μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：PMVの濃度 sで遠心分離する。トリプシン消化によりBMSC（5×10 5 ）を収集し、2μg/ mLのPEIを補充した0.5mLの培地に再懸濁した。生成したPMVを1,200gで5分間回転させ、100μLの培地に再懸濁し、40倍の油性対物レンズを備えた共焦点顕微鏡下で検査した。 （ A ）おそらく遠心分離後の接着分子の相互作用によって引き起こされるPMV凝集の模式図。 （ B ）PEIで荷電した後の単分散を維持するPMVの概略図。 （ C ）遠心分離後の凝集PMV。 （ D ）PMVは、PEIによる正荷電による遠心分離後の凝集が少ないことを示す。スケールバー=10μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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図5：腓腹筋へのCM-DiI標識PMVの送達。 5×10 5の BMSCからPMVを生成し、100μLの容量に遠心分離して濃縮し、BALB / cマウスの腓腹筋にゆっくりと注入した。 （ A ）PMV注入の略図。 （ B ）CM-DiIで標識されたBMSC;スケールバー=20μm。 （ C ）CM-DiI標識BMSCから生成され、共焦点顕微鏡検査によって検査されたPMV;スケールバー=10μm。 （ D ）手術後12時間に採取した腓腹筋。スケールバー=20μm。 （ E - H ）共焦点顕微鏡で調べた腓腹筋の凍結切片;スケールバー=10μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究は、Li Ka Shing財団、中国の自然科学財団（http://www.nsfc.gov.cn/助成金番号30971665、広東省高水準大学プロジェクト「海洋産業のためのグリーンテクノロジー」） 81172894、81370925）、広東省の教育部（http://www.gdhed.edu.cn/助成金番号cxzd1123）を参照してください。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 mL |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/mL |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75,000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
References
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