Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Fremstilling av plasmamembranvesikler fra benmarg mesenkymale stamceller for potensiell cytoplasm erstatningsterapi

Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55741
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Multidisciplinary Research Center, Shantou University

Summary

Aldersrelaterte sykdommer er forbundet med flere defekter i komponenter i cytoplasma. Her presenterer vi en protokoll for å fremstille plasmamembran vesikler fra mesmermale stamceller fra beinmarg. Denne teknikken kan potensielt brukes som et middel for cytoplasmutskiftningsterapi for å forbedre eller til og med reverserende aldersrelaterte fenotyper.

Abstract

Vi har tidligere rapportert om generering av plasmamembranvesikler (PMV) gjennom mekanisk ekstrudering av pattedyrceller. Fusjonen av PMV med mitokondrielle mangelfulle Rho0-celler gjenopprettet mitotisk aktivitet under normale dyrkningsbetingelser. Aterosklerose, type 2 diabetes, Alzheimers sykdom og kreft er aldersrelaterte sykdommer som har blitt rapportert å være forbundet med flere mekaniske og funksjonelle feil i cytosol og organeller av en rekke celletyper. Knoglemarv mesenkymale stamceller (BMSCs) representerer en unik cellepopulasjon fra beinmarg som har selvfornyelsesevner mens de opprettholder deres multipotency. Tilskudd av senescensceller med ung cytoplasma fra autologe BMSCs via fusjon av PMVs gir en lovende tilnærming til å forbedre eller til og med reverserende aldersrelaterte fenotyper. Denne protokollen beskriver hvordan du klargjør PMVer fra BMSCs via ekstrudering gjennom en polykarbonatmembran med 31; m porene, bestemme forekomsten av mitokondrier og undersøke vedlikeholdet av membranpotensialet i PMVer ved hjelp av et konfokalt mikroskop, konsentrere PMVs ved sentrifugering og utføre in vivo injeksjon av PMVer inn i muskelmuskroppen muskus.

Introduction

En enorm innsats har vært viet til å etablere tilnærminger for gen-, enzym- og celleutskiftningsterapier. Dette har resultert i store gjennombrudd og til og med kliniske applikasjoner 1 , 2 , 3 . Nylig ble en kontroversiell mitokondrierepresjonsterapi basert på nukleoverføringsteknologi anvendt på in vitro befruktning for kvinner i alderdommen eller med en dødelig mitokondriell DNA-mutasjon 4 . Feil som finnes i aldersrelaterte sykdommer, inkludert aterosklerose, type 2 diabetes, Alzheimers sykdom og kreft, er vanligvis mangesidig. Det har blitt dokumentert at akkumulering av lipiddråper; Avsetningen av amyloidprotein; Oppbevaring av utfoldede proteiner i endoplasmatisk retikulum; Og defekt proteasom, autofagosom og mitokondrier bidrar til utvikling eller forverring av disse sykdommene"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . For tiden er det ingen tilgjengelig mekanisme rettet mot direkte avhjelp av funksjonsfeil i cytosol og organeller, som forårsaker senescens og aldrende fenotyper.

Vi har tidligere rapportert om generering av plasmamembresvesikler (PMVs) gjennom mekanisk ekstrudering av pattedyrceller 12 . Med unntak av kjernen ble komponenter i membranen eller cytosolen, inkludert proteiner og RNA, så vel som organeller, så som mitokondrier, funnet i PMVer. I hovedsak kan en PMV betraktes som en miniatyr enucleated celle. Enda viktigere er at fusjonen av PMV med mitokondrier-mangelfulle Rho0-celler gjenopprettet mitotisk aktivitet under normale dyrkningsbetingelser. Dette er den første rapporten om establiShing en potensielt effektiv tilnærming til cytoplasm erstatningsterapi.

Knoglemarv mesenkymale stamceller (BMSCs) er multipotente stamceller som genereres rutinemessig fra beinmarg og blir lett utvidet i kultur. Embryonale stamcellemarkører Okt4, Nanog og SOX2 har blitt påvist ved lave nivåer i MSCs 13 . Telomeraseaktivitet er også målbar. I tillegg gjør fraværet av co-stimulatoriske molekyler og humane leukocytantigen (HLA) klasse II-molekyler, samt lavt HLA klasse I-uttrykk på MSC, dem ideelle celler for allogen eller "off-the-shelf" bruk i Både regenerativ medisin og immunmodulerende applikasjoner 14 .

Her beskriver vi hvordan man klargjør PMV fra mus BMSCs via ekstrudering gjennom en polykarbonatmembran med 3 μm porer, bestemme forekomsten av mitokondrier og undersøke vedlikeholdet av membranpotensialet i PMVer ved bruk av confocAl mikroskopi, forberede konsentrerte, men ikke aggregerte PMVer ved sentrifugering, og utfør in vivo injeksjon av PMV i muskelen i gastrocnemiusmusikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

8 til 12 uker gamle BALB / c-mus ble kjøpt fra Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, Kina) og oppvokst i en spesiell patogenfri og luftkondisjonert dyreanordning. Dyrpleie og eksperimentelle prosedyrer var i samsvar med retningslinjene for bruk og pleie av laboratoriedyr etablert av Shantou University.

1. Montering av apparatet

  1. For å sikre sterilitet, slå på UV-lyset av en vevskulturkledning i 30 minutter før bruk.
  2. Skru av en engangs 25 mm filterenhet og senk hetten og bunnen av enheten i en 200 ml glasskopp fylt med 75% etanol i 30 minutter. Enheten er laget av medisinsk klasse polypropylen.
  3. Plukk opp hetten og bunnen av enheten ved hjelp av pincet, skyll av resterende etanol for hånd, og la delene lufttørke i 10 minutter i hetten.
  4. Våt en 19 mm polykarbonatmembran i PBS og plasser den forsiktig på toppen av bunkenes støttematriseM av enheten. Polymerfilmen har en jevn, flat overflate og spor-etset 3 μm porene.
  5. Monter enheten igjen ved å skru på hetten tett mot bunnen. Pass på at membranen ikke løsnes fra senteret.
  6. Fjern nålen i en 1 ml insulin sprøyte og trekk 1 ml PBS. Fest sprøyten til filterenheten og trykk deretter PBS gjennom enheten for å vaske enheten og for å teste om det er lekkasje.

2. Generering av plasmamembranvesikler (PMVs)

  1. Etablere en BMSC-kultur, som rapportert av Nemeth et al. 15 , i DMEM kulturmedium inneholdende 15% FBS og 1% penicillin / streptomycin. Dyr cellene i en 6-brønnplate i en fuktet inkubator som inneholder 5% CO2 ved 37 ° C.
  2. For å propagere cellene, fjern kulturmediet og skyll brønnen med 0,5 ml kalsiumfritt PBS.
  3. Tilsett 0,5 ml 0,25% trypsin-EDTA og inkuber cellene ved 37 ° CI 3 min. Pek platen mot håndflaten et par ganger for å lette cellefjerning. Stopp fordøyelsen ved å tilsette 1 ml kulturmedium.
  4. Samle cellene i et 15 ml konisk rør og roter ved 200 xg i 2 minutter i en benkentrifugering. Resuspender cellene i 4 ml dyrkningsmedium og del opp celler i to brønner på en 6-brønnsplate.
    MERK: Celler når vanligvis sammenløp på rundt 24 timer.
  5. For å generere PMV, høst cellene fra en brønn (ca. 5 x 10 5 celler) av en 6-brønn plate ved trypsin fordøyelse og monodisperse cellene i 0,5 ml kulturmedium.
  6. Legg cellene i insulininsprøyten, fest den til filterenheten, og skyv stemplet raskt for å klemme cellene gjennom filteret. Kast det ekstruderte mediet fordi det bare skal være noen få PMVer inne i det.
  7. Legg ytterligere 0,5 ml medium inn i sprøyten og skyv det raskt gjennom filteret. Samlet mediet av den andre ekstrudering, som inneholderS PMVer av forskjellig størrelse.
  8. Legg 150 μL av det oppsamlede mediumet i en 35 mm glassbunnsrett og la PMVene slå seg ned i bunnen i ca. 10 minutter. Undersøk PMVene under et invertert fasekontrastmikroskop utstyrt med et CCD-kamera ved hjelp av 20X objektivlinsen.

3. Undersøkelse av innholdet i PMVene ved hjelp av konfokal mikroskopi

  1. For å utføre transfeksjon i BMSCene, fortynne 2 μg supercoiled plasmid-DNA og 6 μl kationisk transfeksjonsreagens ( f.eks. PolyJet) i 50 μl serumfritt DMEM. Vortex skal blandes godt og spinne kort for å samle all væske fra rørets sider.
  2. Tilsett den fortynnede løsningen (fra trinn 3.1) dråpevis i fortynnet DNA-løsning, vortex sterkt i 1 min, roter kort og inkuber ved romtemperatur i 10 minutter.
  3. Erstatt det gamle mediet på BMSC, som har blitt sådd ved ca. 30% sammenflytelse over natten, med 2 ml frisk dyrkningsmedium og tilsatt DNEn transfeksjonsblanding dråpevis.
  4. Erstatt med 2 ml friskt medium etter 12 timers transfeksjon.
  5. For å spore cytoplasmatisk lokaliserte proteiner transfekterer cellene med plasmidet som inneholder en EGFP-ekspresjonskassett (pEGFP-N1), som beskrevet ovenfor. Høst cellene ved hjelp av trypsinfordøyning 48 timer etter transfeksjon for PMV-generasjon, som beskrevet ovenfor.
  6. For å spore mitokondriene flekker cellene med mitokondriell fargestoff (1 uM, MitoTracker) i frisk dyrkningsmedium i 30 minutter ved 37 ° C.
  7. For å oppdage membranpotensialet i mitokondriene flekker cellene med cyanintykket JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetraklor-1,1', 3,3'-tetraetylbenzimidazolylkarbocyaninjodid) (10 μg / Ml) i fersk dyrkningsmedium i 30 minutter ved 37 ° C.
    1. Vask cellene med 0,5 ml PBS tre ganger og høst deretter cellene ved trypsinfordøyning for PMV-generasjon, som beskrevet ovenfor.
    2. Last 150 μL av den samlede medIum inn i en 35 mm glassbunnfat og la PMVene slå seg ned i bunnen i ca 10 minutter. Undersøk PMVene under et konfokalt mikroskop ved hjelp av 100X-objektivlinsen.
  8. For å oppdage EGFP eller mitokondriell fargestoff, slå på 488 nm laser og samle signal ved 505-530 nm. For å oppdage JC-1, slå på 488 nm og 543 nm lasere og samle signaler ved 505-530 nm og 560-615 nm. Sett pinholeverdien til rundt 1,4.

4. Fremstilling av konsentrert PMV ved sentrifugering

  1. Høst cellene ved trypsin fordøyelse og generere PMV, som beskrevet ovenfor, i 0,5 ml dyrkningsmedium.
  2. Spinn PMVene ved 1200 xg i en benchtop-sentrifuge i 5 minutter ved romtemperatur. Sug forsiktig supernatanten og resuspender pelleten i 100 ul kulturmedium med mild svirling.
  3. Legg 50 μL PMVer i en 35 mm glassbunnsrett og la dem løsne seg ved romtemperatur i ca. 10 minutter. Undersøk PMVeneUnder et konfokalmikroskop ved hjelp av 40X-objektivlinsen.
  4. Tilsett serien av fortynnet polyetylenimin (PEI) -løsning til BMSC-kulturen i 1 time og kontroller for tegn på cytotoksisitet.
    MERK: Her ble PEI ved 2 μg / mL valgt siden ingen tegn på toksisitet ble påvist i BMSCs.
  5. Høst cellene ved hjelp av trypsin fordøyelse og tilsett PEI ved 2 μg / mL i 1 time for å lade cellemembranen som et middel for å forhindre aggregering. Generer PMV, som beskrevet ovenfor, i 0,5 ml dyrkningsmedium. Konsentrere PMVene og undersøke dem under et konfokalt mikroskop, som beskrevet ovenfor.

5. Injeksjon av PMV i Gastrocnemius Muscle

  1. For å flekke membranen, tilsatt CM-DiI (klormetyldialkyl-indokarbocyanin) (10 μM) fargestoff i 1 ml friskt dyrkningsmedium til BMSCs i 30 minutter.
  2. Høst cellene (ca. 5 x 10 5 ) ved trypsinfordøyning og resuspender dem i 0,5 ml kulturmedium. Tilsett PEI (2 μg / mL) for 1h. Generer og konsentrere PMVene i 100 ul kulturmedium, som beskrevet ovenfor.
  3. Anaesthetiser en BALB / c-mus ved å injisere natriumbarbital (10 mg / kg) etter 12 timers fasting.
  4. Rengjør utsiden av gastrocnemius muskelen med 75% etanol. Injiser langsomt PMVene (100 μL) i gastrocnemius-muskelen ved hjelp av en 30 G insulinsprøyte.
  5. Etter å ha bedømt anestesien, legg en våt gaze over øynene for eksperimentets varighet, og oppvarm musen med et glødelampe til det våkner. Husk musen alene i et individuelt ventilasjonsbur.
  6. For å høste gastrocnemius muskel 12 timer etter operasjonen, drep musen ved cervikal dislokasjon.
  7. Stryk 75% etanol over gastrocnemius muskelen, åpne huden med saks, og kutt ut hele gastrocnemius muskelen i begge ender.
  8. Skyll muskelen med PBS og undersøk den under et fluorescensmikroskop ved hjelp av 20X objektivlinsen.
  9. Trim muskelen med aSkarpt knivblad for å fjerne delene uten fluorescens. Klipp delene med sterk rød fluorescens i ca 9 mm 3 kuber.
  10. Embed hver terning i optimal skjære temperatur medium (OCT), senke den i flytende nitrogen i 5 minutter, og lagre det i en -20 ° C fryser til bruk.
  11. Klipp de frosne seksjonene i stykker 20 μm tykk ved bruk av en kryostat og fest hver seksjon til en glassglass. Skyll seksjonen en gang med PBS.
  12. Tegn en sirkel rundt seksjonen med en flekkcirkelpenne og legg til 100 μL DAPI (1 μg / ml). Aspirer DAPI-løsningen etter 10 minutter inkubering ved romtemperatur i mørket og vask tre ganger med PBS.
  13. Dekk monteringsoljen over prøven, dekk den med en glidelås, og tett glidelåsen med neglelakk. Undersøk avsnittet under et konfokalmikroskop ved hjelp av 100X-objektivlinsen.
  14. For å oppdage CM-DiI, slå på 543 nm laser og samle signal ved 560-615 nm. For å oppdage DAPI, slå på 405Nm laser og samle signal ved 420-480 nm. Sett pinholeverdien til ca. 1,4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nøkkelen til en vellykket forberedelse av PMV er avhengig av den korrekte samlingen av filterenheten ( Figur 1 ), som kan testes ved å trykke 1 ml PBS gjennom membranen. Hvis det oppstår lekkasje, monter filterenheten igjen og prøv igjen. Lekkasjen kan imidlertid kun testes pålitelig når celler skyves gjennom membranen. Hvis bare noen få PMVer oppdages under et vanlig mikroskop ved hjelp av 10X-objektivet, eller hvis størrelsen på PMVene mest er rundt 1 μm, vil det indikere at de fleste cellene er fanget inne i enheten på grunn av feil montering. PMVer med en størrelse i området på ca. 3 um i diameter var overveiende når de ble undersøkt under et fasekontrastmikroskop ved bruk av 20X-målet ( figur 2 ). Siden PMVer med nanometerstørrelse ikke var lett visualisert, var prosentandelen av store PMVer i form av antall lave. Det ble funnet nyttig å trykke sprøyten raskt for å reDuce mengden membranrusk, som tilsynelatende ikke formler sfæriske PMVer. Videre ble PMVer med mindre størrelser (mindre enn 1 um) funnet i det første ekstruderingsmediet, med større PMVer utvunnet i den andre ekstrudering.

Det mest unike aspektet av PMVene var omslutningen av cellulære komponenter bortsett fra kjernen 12 . BMSCs ble transfektert med en ekspresjonskassett av EGFP i 48 timer før de ble brukt til PMV-fremstilling. Resultatene viser at cytoplasmatisk lokalisert EGFP-protein kan innkapsles i PMVer ( Figur 3A ). Innkapslingen av mitokondrier ble påvist ved farging av mitokondriell fargestoff, noe som viste at en stor brøkdel av, men ikke alle, PMVer inneholder grønne fluorescerende prikker, som indikerer mitokondrier ( figur 3 ). Noen av PMVene, selv de med diameter så stor som 3 μm, viste ikke at de inneholdt mitokondrier, noe som tyder på atVed noen mekaniske begrensninger kan det forhindre innkapsling av mitokondrier i PMV. Membranpotensialet for mitokondrier ble detektert ved JC-1-farging, som avgir rød fluorescens når mitokondrier har et normalt potensial. Resultatet viser at rød fluorescens faktisk ble detektert i PMVs ( Figur 3 ), mens den grønne fluorescensen ikke var detekterbar (data ikke vist), noe som tyder på at mitokondrierene i PMVene var funksjonelle.

En konsentrasjonsprosess for PMV er nødvendig, spesielt for in vivo- applikasjon for å redusere volumet samt å fjerne de cellulære komponentene frigjort under ekstrudering. Etter sentrifugering ved 1200 xg i 5 minutter ved romtemperatur ble det funnet svært få PMVer av mindre størrelse i supernatanten. For å lette resuspenningen av pelleten ble et 2-ml rundbundet rør brukt til sentrifugeringen. Imidlertid ble de fleste PMVene aggregert i pelleten, spesielt PMVer med mindre størrelser ( figur 4 ). Dette skyldes trolig adhesjonsmolekyler på membranen. Mediet ble derfor supplert med PEI (2 μg / mL), hvis konsentrasjon var skreddersydd for å ikke ha merkbar cytotoksisitet. Den positive ladningen av PEI festet til cellemembranen forhindret aggregering av PMV under sentrifugering ( Figur 4 ).

Endelig ble membranene av BMSCs merket med CM-DiI-fargestoff før fremstillingen av PMVene ( Figur 5 ). Etter konsentrasjon ble PMV injisert i muskulaturen gastrocnemius muskler, som ble høstet 12 timer etter operasjonen og undersøkt under et konfokalt mikroskop. Frosne seksjoner av gastrocnemius-muskelen ble undersøkt for nærvær av rød fluorescens, som ble detektert innenfor myofiberen ( Figur 5 ), og demonstrerte at PMV ble levert til cytoplasma, sannsynligvis via endocytose. Av oppmerksomhet, røde fluorerCence ble funnet rundt periferien av myofiber (data ikke vist), noe som indikerer at en stor del av PMV ikke enten endocytosedes eller var bare i begynnelsen av endocytose ved 12 timer etter injeksjon.

Figur 1
Figur 1: Montering av filterenheten. ( A ) Kommersielt tilgjengelige polykarbonatmembraner. ( B ) Spor-etsede porer med en diameter på 3 μm, sett under et optisk mikroskop med et 20X objektiv. Skalbjelke = 50 μm. ( C ) Membranen ble plassert på toppen av den bærende matrisen av en engangsfilterenhet. ( D ) Den monterte filterenheten med en membran innsiden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

page = "1"> Figur 2
Figur 2: Generering av PMVer fra BMSCs. ( A ) BMSC fra mus ble dyrket i en 6-brønn plate. ( B ) BMSCs (5 x 10 5 ) ble høstet ved trypsinfordøyning og monodispersert i 500 ul kulturmedium. Bilder av festet og resuspendert BMSC ble tatt under et optisk mikroskop med et 20X objektiv. ( C ) Celler ble lastet inn i en insulin sprøyte før de ble festet til filterenheten. ( D ) PMVer generert fra BMSCs ble lastet inn i en 35 mm glassbunnsskål og undersøkt under et invertert fasekontrastmikroskop ved bruk av en 20X objektivlins. Skalestenger = 40 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Les / ftp_upload / 55741 / 55741fig3.jpg "/>
Figur 3: Deteksjon av PMV-innhold ved konfokal mikroskopi. PMV ble generert fra ( A ) BMSC'er transfektert med pEGFP-N1 i 48 timer for å spore det cytoplasmatisk lokaliserte EGFP-protein, ( B ) BMSCs farget med mitokondriell fargestoff (1 uM) i 30 minutter for å spore eksistensen av mitokondrier, eller BMSCs farger med JC-1 (10 μg / ml) i 30 minutter for å bekrefte mitokondriets membranpotensiale. PMVer generert fra BMSCs ble lastet på en 35 mm glassbunnskål og undersøkt av konfokal mikroskopi ved hjelp av en 100x olje objektivlinsen. Skalestenger = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Konsentrasjon av PMV S ved sentrifugering. BMSCs (5 x 105) ble høstet ved trypsinfordøyning og resuspendert i 0,5 ml dyrkningsmedium, som ble tilsatt med eller uten 2 ug / ml PEI. Genererte PMV ble spunnet ved 1200 g i 5 minutter, resuspendert i 100 ul kulturmedium og undersøkt under et konfokalt mikroskop med et 40X oljemål. ( A ) Skjematisk for PMV-aggregering sannsynligvis forårsaket av samspillet mellom adhesjonsmolekylene etter sentrifugering. ( B ) Skjematisk av PMV som opprettholder monodispersjon etter å ha blitt belastet med PEI. ( C ) Aggregerte PMV etter sentrifugering. ( D ) PMV viser mindre aggregering etter sentrifugering på grunn av positiv ladning med PEI. Skalestenger = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Gure 5 "src =" / files / ftp_upload / 55741 / 55741fig5.jpg "/>
Figur 5: Levering av CM-DiI-merkede PMV til gastrocnemius muskelen. PMV ble generert fra 5 x 10 5 BMSCs, konsentrert ved sentrifugering i et volum på 100 ul, og injiseres langsomt inn i gastrocnemius-muskelen i en BALB / c-mus. ( A ) Skjematisk for PMV injeksjon. ( B ) BMSCs merket med CM-DiI; Skalbjelke = 20 μm. ( C ) PMV'er generert fra CM-DiI-merkede BMSC'er og undersøkt ved konfokal mikroskopi; Skalbjelke = 10 μm. ( D ) Gastrocnemius muskel høstet 12 timer etter operasjonen; Skalbjelke = 20 μm. ( E - H ) Frosset del av gastrocnemius muskel undersøkt av konfokal mikroskopi; Skalbjelke = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne undersøkelsen ble støttet av Li Ka Shing Foundation, Guangdong High Level University Project "Grønne teknologier for marine industrier", Natural Science Foundation of China (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925), og utdanningsavdelingen i Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IsoporeTM membranes Millipore TSTP04700 3 mm pore
Disposable filter unit Xinya, Shanghai, China 25 mm Medical grade polypropylene
Insulin syringe BD 328446 1 mL
pN1-EGFP Clontech  6085-1
MitoTracker Molecular Probes M7514 Green FM, 1 μM
JC-1 Beyotime, Haimen, China C2006 10 mg/mL
CM-DiI Beyotime, Haimen, China C1036 10 mM
PEI Sigma P3143 Mn = 75,000
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse TE 2000 With CCD camera
Confocol Microscope Carl Zeiss LSM 510 Meta
PolyJet SigaGen SL100688 For cell transfection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
  2. Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
  3. Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
  4. Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
  5. López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  6. Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
  7. Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
  8. Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
  9. Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
  10. Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
  11. Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
  12. Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
  13. Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
  14. Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
  15. Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, Unit 22F.12 (2013).
  16. Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print (2017).
  17. Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
  18. Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
  19. Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
  20. Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
  21. Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 123 plasmamembranvesikler mitokondrier cytoplasm-erstatningsterapi celleekstrudering beinmargestamceller aldersrelaterte sykdommer foryngelse
Fremstilling av plasmamembranvesikler fra benmarg mesenkymale stamceller for potensiell cytoplasm erstatningsterapi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, L. q., Lin, M. j., Li, Y. p.,… More

Xu, L. q., Lin, M. j., Li, Y. p., Li, S., Chen, S. j., Wei, C. j. Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy. J. Vis. Exp. (123), e55741, doi:10.3791/55741 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter