Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Potansiyel Sitoplazma Replasman Tedavisi için Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinden Plazma Membran Vesiküllerinin Hazırlanması

Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55741
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Multidisciplinary Research Center, Shantou University

Summary

Yaşa bağlı hastalıklar, sitoplazmadaki bileşenlerin birden fazla kusuru ile ilişkilidir. Burada, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden plazma membran veziküller hazırlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik yaşla ilişkili fenotipleri iyileştirmek veya hatta tersine çevirmek için sitoplazma replasman tedavisi aracı olarak potansiyel olarak kullanılabilir.

Abstract

Daha önce, memeli hücrelerinin mekanik ekstrüzyonu yoluyla plazma zar veziküllerinin (PMV'ler) üretimini bildirdik. PMV'lerin mitokondriyal yetersiz Rho0 hücreleri ile birleşmesi, normal kültür koşullarında mitotik aktiviteyi geri kazandırdı. Ateroskleroz, tip 2 diyabet, Alzheimer hastalığı ve kanser, çeşitli hücre tiplerinin sitolol ve organellerinde çok sayıda mekanik ve fonksiyonel kusur ile ilişkili olduğu bildirilen yaşa bağlı hastalıklardır. Kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC'ler), kendi çoktanlıklarını korurken kendi kendini yenileme kabiliyetlerine sahip olan kemik iliğinden gelen benzersiz bir hücre popülasyonunu temsil eder. Yaşlanmayı önleyici hücrelerin, otolog BMSC'lerden genç sitoplazması ile PMV'lerin füzyonu yoluyla eklenmesi, yaşa bağlı fenotiplerin iyileştirilmesi veya hatta tersine çevrilmesi için umut verici bir yaklaşım sağlar. Bu protokol, 3'lü polikarbonat membran içinden ekstrüzyon yoluyla BMSC'lerden PMV'lerin nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır.1 gözenekleri, mitokondri varlığını belirlemek ve bir konfokal mikroskop kullanarak PMV'ler içinde zar potansiyelinin bakımı incelemek, santrifüj ile PMVs konsantre ve farelerin gastroknemius kas içine PMVs in vivo enjeksiyonu gerçekleştirmek.

Introduction

Gen, enzim ve hücre replasman tedavileri için yaklaşımlar oluşturmak için büyük çaba harcandı. Bu, büyük ilerlemeler ve hatta klinik uygulamalarla sonuçlandı 1 , 2 , 3 . Yakın zamanda, yaşlı kadınların veya ölümcül mitokondriyal DNA mutasyonu taşıyan in vitro döllenmeye çekirdek transfer teknolojisine dayalı tartışmalı bir mitokondria replasman tedavisi uygulanmıştır4. Ateroskleroz, tip 2 diyabet, Alzheimer hastalığı ve kanser gibi yaşla ilişkili hastalıklarda bulunan kusurlar genellikle çok yönlüdür. Lipid damlacıklarının birikiminin; Amiloid proteinin birikimi; Açılmış proteinlerin endoplazmik retikulumda tutulması; Ve arızalı proteazom, otofagozom ve mitokondri bu hastalıkların gelişimine veya şiddetlenmesine katkıda bulunur"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Halen, yaşlanmaya ve yaşlanmaya neden olan fenotiplere neden olan sitozol ve organellerde arızanın doğrudan düzeltilmesini amaçlayan herhangi bir mekanizma mevcut değildir.

Daha önce, memeli hücrelerinin mekanik ekstrüzyonu yoluyla plazma zar veziküllerinin (PMV'lerin) üretimini bildirdik 12 . Çekirdek dışında, PMV'lerde protein ve RNA da dahil olmak üzere zar veya sitoplazmadaki bileşenlerin yanı sıra mitokondri gibi organel bileşikleri de bulundu. Esasen, bir PMV minyatür enükleated hücre olarak kabul edilebilir. Daha da önemlisi, PMV'lerin mitokondriyal eksik Rho0 hücreleri ile birleşmesi, normal kültür koşulları altında mitotik aktiviteyi geri kazandırdı. Bu, establi hakkındaki ilk rapordur.Sitoplazma replasman tedavisi için potansiyel olarak verimli bir yaklaşım savunur.

Kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC'ler), kemik iliğinden rutin olarak üretilen ve kültürde kolaylıkla genişleyen multipotent progenitör hücrelerdir. Embriyonik kök hücre markörleri Oct4, Nanog ve SOX2 MSC'lerde düşük seviyelerde tespit edildi 13 . Telomeraz etkinliği de ölçülebilirdir. Buna ek olarak, yardımcı uyarıcı moleküller ve insan lökosit antijeni (HLA) Sınıf II moleküllerinin yanı sıra MSC'lerde düşük HLA Sınıf I ifadesi bulunmadığından, bunları allojenik veya "raflarda" kullanım için ideal hücreler haline getirir Hem rejeneratif tıp hem de immünomodülatör uygulamalar 14 .

Burada, 3-μm gözenekli bir polikarbonat zar yoluyla ekstrüzyon yoluyla fare BMSC'lerden PMV'lerin nasıl hazırlanacağını, PMV'lerde mitokondri varlığını belirleyip, confoc kullanarak PMV'lerin bakımını inceliyoruz.Konsantre fakat agregasyonsuz PMV'leri santrifüjleme ile hazırlayın ve PMV'lerin farelerin gastroknemius kütlesine in vivo enjeksiyonu gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

8 ila 12 haftalık BALB / c fareleri Shanghai Experimental Animal Center'dan (Shanghai, Çin) satın alındı ​​ve spesifik patojen içermeyen ve klimalı bir hayvan tesisinde yetiştirildi. Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, Shantou Üniversitesi tarafından kurulan laboratuar hayvanlarının kullanımı ve bakımına ilişkin esaslara uygundu.

1. Cihazın Montajı

  1. Steriliyet sağlamak için, kullanmadan önce 30 dakika boyunca bir doku kültürü kapağının UV ışığını açın.
  2. Tek kullanımlık bir 25 mm filtre ünitesinin vidalarını sökün ve ünitenin altını ve altını 30 dakika süreyle% 75 etanol ile dolu 200 mL'lik bir cam kaba batırın. Ünite tıbbi sınıf polipropilenden yapılmıştır.
  3. Forsep kullanarak ünitenin alt kısmını ve altını kaldırın, kalan etanolü elle çalkalayın ve parçaları havalandırmanın başında 10 dakika boyunca kurumasına izin verin.
  4. PBS'de 19 mm'lik bir polikarbonat zar yerleştirin ve şişenin destekleyici matrisinin üzerine dikkatlice yerleştirin.Ünitenin m. Polimer filmin pürüzsüz, düz bir yüzeyi ve iz sürüklenmiş 3 um gözenekleri vardır.
  5. Kapağı alt tarafa sıkıca vidalayarak üniteyi yeniden monte edin. Zarın merkezden ayrılmadığından emin olun.
  6. 1 mL'lik bir insülin şırınganın iğnesini çıkarın ve 1 mL'lik PBS'yi çekin. Şırıngayı filtre ünitesine takın ve ardından üniteyi ıslatmak ve herhangi bir sızıntı olup olmadığını test etmek için PBS'yi ünite boyunca itin.

2. Plazma Membran Vesiküllerinin Üretimi (PMV'ler)

  1. Nemeth ve diğerleri tarafından bildirilen bir BMSC kültürü oluşturun . 15 ,% 15 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin içeren DMEM kültür ortamında. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO 2 içeren nemli bir kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu bir plakada yetiştirin.
  2. Hücreleri yaymak için, kültür ortamını çıkarın ve kuyu, 0.5 mL kalsiyum içermeyen PBS ile durulayın.
  3. 0.5 mL% 0.25 tripsin-EDTA ilave edin ve hücreleri 37 ° C'de inkübe edin.3 dakika boyunca. Hücrenin ayrılmasını kolaylaştırmak için plakaya birkaç kez elinizin avucuna dokunun. 1 mL kültür ortamı ekleyerek sindirimi durdurun.
  4. 15 mL konik tüp içindeki hücreleri toplayın ve tezgah üstü santrifüjde 200 xg'de 2 dakika döndürün. 4 ml kültür ortamında hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve 6 oyuklu bir plakanın iki kuyucuğuna bölün.
    NOT: Hücreler genellikle yaklaşık 24 saatte konfluansa gelirler.
  5. PMV'ler üretmek için tripsin sindirimi ile 6 oyuklu bir plakanın bir kuyudan (yaklaşık 5 x 10 5 hücre) hücreleri hasat edin ve 0.5 mL kültür ortamındaki hücreleri tek dağılım haline getirin.
  6. Hücreleri insülin şırınga içine yükleyin, filtre ünitesine takın ve hücreleri filtre boyunca sıkıştırmak için pistonu çabucak bastırın. Sıkıştırılmış ortamı atın, çünkü içinde yalnızca birkaç PMV bulunmalıdır.
  7. Şırınga içine 0.5 mL daha ilave edin ve çabucak filtreye itin. Içeren ikinci ekstrüzyon ortamı toplandı.Çeşitli boyutlarda PMV'ler.
  8. Toplanan aracın 150 μL'sini bir 35 mm'lik cam altı tabağa yükleyin ve PMV'lerin yaklaşık 10 dakika boyunca tabana çökelmesine izin verin. PMX'leri, 20X objektif lensi kullanarak bir CCD kamera ile donatılmış ters faz kontrast mikroskopu altında inceleyin.

3. Konfokal Mikroskopi Kullanılarak PMV'ler İçerisinde İçerik İncelenmesi

  1. BMSC'lerde transfeksiyon yapmak için, 50 μL serumsuz DMEM'de 2 μg süper sargılı plazmid DNA ve 6 μL katyonik transfeksiyon reaktifini ( örn., PolyJet) sulandırın. Tüpün kenarlarından tüm sıvıyı toplamak için iyice karıştırmak için kısa bir süre vorteksleyin.
  2. Seyreltilmiş çözelti damla damla DNA çözeltisine damla damla ilave edin (adım 3.1'den), kuvvetli bir şekilde 1 dakika vorteksleyin, kısaca döndürün ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
  3. Gecelik yaklaşık% 30 birleşimde tohumlanmış olan BMSC'lerdeki eski aracı maddeyi 2 mL taze kültür ortamı ile değiştirin ve DNBir transfeksiyon karışımı damla damla.
  4. 12 saatlik transfeksiyon sonrasında 2 mL taze ortam ile değiştirin.
  5. Sitoplazma lokalize proteinleri izlemek için hücreleri yukarıda tarif edildiği gibi bir EGFP ifade kasedi (pEGFP-N1) içeren plasmidle transfekte edin. Yukarıda tarif edildiği gibi PMV üretimi için transfeksiyondan 48 saat sonra tripsin sindirimi ile hücreleri hasat edin.
  6. Mitokondriyeyi izlemek için, hücreleri mitokondriyal boya (1 uM, MitoTracker) ile taze kültür ortamında 37 ° C'de 30 dakika boyunca lekeleyin.
  7. Mitokondrinin zar potansiyelini saptamak için, hücreleri siyanin boyası JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetrakloro-1,1', 3,3'-tetraetilbenzimidazolilkarbosiyanin iyodid) (10 μg / ML) taze kültür ortamında 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    1. Hücreleri 0.5 mL PBS ile üç kez yıkayın ve yukarıda tarif edildiği gibi PMV üretimi için tripsin sindirimiyle hücreleri hasat edin.
    2. Toplanan tıbbi maddenin 150 μL'ini yükleyin.35 mm'lik bir cam altı tabağa koyun ve PMV'lerin yaklaşık 10 dakika boyunca tabana oturmasına izin verin. 100X yağ objektif lens kullanarak konfokal mikroskop altında PMVs inceleyin.
  8. EGFP'yi veya mitokondriyal boyayı algılamak için 488 nm lazeri açın ve 505-530 nm'de sinyal toplayın. JC-1'i saptamak için 488 nm ve 543 nm lazerleri açın ve 505-530 nm ve 560-615 nm'de sinyal toplayın. İğne deliği değerini yaklaşık 1.4 yapın.

4. Konsantre PMV'lerin Santrifüjle Hazırlanması

  1. Tripsin sindirimi ile hücreleri hasat edin ve yukarıda tarif edildiği gibi PMV'leri 0.5 mL kültür ortamında üretin.
  2. PMV'leri oda sıcaklığında 5 dakika süreyle bir tezgah üstü santrifüjde 1200 xg'de döndürün. Dikkatle süpernatantı aspire edin ve yumuşak topraklama ile kültür ortamı 100 mcL pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
  3. 35 mm'lik cam alt tabağa 50 μL PMV yükleyin ve yaklaşık 10 dakika boyunca oda sıcaklığında çökelmelerine izin verin. PMV'leri inceleyin40X yağ objektif lens kullanarak konfokal bir mikroskop altında.
  4. Seyreltilmiş polietilenimin (PEI) çözeltisi serisini 1 saat süreyle BMSC kültürüne ilave edin ve sitotoksisite işaretlerini kontrol edin.
    NOT: Burada BMSC'lerde toksisite işareti bulunmadığından 2 μg / mL PEI seçilmiştir.
  5. Tripsin sindirimle hücreleri hasat edin ve agregasyonu önlemenin bir yolu olarak hücre zarını şarj etmek için 1 saat boyunca 2 ug / mL'de PEI ilave edin. Yukarıda tarif edildiği gibi 0,5 mL kültür ortamında PMV'ler üretin. PMV'leri konsantre hale getirin ve yukarıda açıklandığı gibi konfokal bir mikroskop altında inceleyin.

5. PMV'lerin Gastroknemius Kasına Enjekte Edilmesi

  1. Memeyi lekelenmek için, 30 dakika boyunca BMSC'ye 1 mL taze kültür ortamında CM-DiI (klorometil dialkil-indokarbosiyanin) (10 uM) boya ilave edin.
  2. Tripsin sindirimi ile hücreleri (yaklaşık 5 x 10 5 ) toplayın ve 0.5 mL kültür ortamında tekrar süspansiyon haline getirin. PEI (2 μg / mL) 1h. PMV'leri, yukarıda tarif edildiği gibi, 100 uL kültür ortamında üretin ve konsantre hale getirin.
  3. 12 saatlik aç bıraktıktan sonra sodyum barbital (10 mg / kg) enjekte ederek bir BALB / c fareyi başlatın.
  4. Gastroknemius kasının dışını% 75 etanol ile temizleyin. 30 G'lik bir insülin şırınga kullanarak yavaşça PMV'leri (100 μL) gastroknemius kasına enjekte edin.
  5. Anestezi uygulandıktan sonra, deney süresince gözlerin üzerine ıslak bir gazlı bez yerleştirin ve uyanana kadar fareyi bir akkor ışıkla ısıtın. Fare tek başına bir havalandırma kafesinde yalnız bırakın.
  6. Ameliyattan 12 saat sonra gastroknemius kasını hasat etmek için fare servikal dislokasyonla öldürüldü.
  7. Gastroknemius kası üzerine% 75 etanol serpiştirin, makasla deriyi açın ve her iki ucundaki tüm gastroknemius kasını kesin.
  8. Kas PBS ile durulayın ve bir floresan mikroskop altında 20X objektif lens kullanarak inceleyin.
  9. Kası birFloresan olmayan parçaları çıkarmak için keskin traş bıçağı. Güçlü kırmızı flüorür ile parçaları yaklaşık 9 mm 3 küp içine kesin.
  10. Her küveti optimum kesme sıcaklığı ortamına (OCT) yerleştirin, 5 dakika süreyle sıvı nitrojene batırın ve kullanılıncaya kadar -20 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.
  11. Dondurulmuş parçaları bir kriyostat kullanarak 20 μm kalınlığında parçalara kesin ve her bir bölüme bir cam slayta yapıştırın. Kesiti PBS ile bir kez durulayın.
  12. Bir leke daire kalemi olan bölüm etrafında bir daire çizin ve 100 mcL DAPI (1 μg / mL) ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka sonra DAPI çözüm aspire ve PBS ile üç kez yıkayın.
  13. Örneğe monte yağı atın, bir cam kaymayla örtün ve slaytı oje ile sızdırmaz kılın. 100X yağ objektif lens kullanarak konfokal mikroskop altında bölüm inceleyin.
  14. CM-DiI'yi tespit etmek için 543 nm lazeri açın ve 560-615 nm'de sinyal toplayın. DAPI algılamak için <a0> </ a0>, 405Nm lazer ve 420-480 nm'de sinyal toplayın. İğne deliği değerini yaklaşık 1.4 yapın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PMV'lerin başarılı bir şekilde hazırlanmasının anahtarı, filtre ünitesinin doğru şekilde monte edilmesine ( Şekil 1 ) bağlıdır ve membrandan 1 mL PBS iterek test edilebilir. Sızıntı oluşursa, filtre ünitesini tekrar monte edin ve tekrar test edin. Bununla birlikte, sızıntı, hücreler zardan içeri itildiğinde güvenilir şekilde test edilebilir. 10X objektif kullanarak normal bir mikroskopta yalnızca birkaç PMV tespit edilirse veya PMV'lerin boyutu çoğunlukla 1 μm civarında ise, bu hatalı montajdan dolayı hücrelerin çoğunun ünitede sıkıştığını gösterir. 20X hedefi ( Şekil 2 ) kullanarak bir faz kontrast mikroskop altında incelendiğinde yaklaşık 3 μm çapında bir boyuta sahip PMV'ler ağırlık kazanmıştır. Nanometre boyutundaki PMV'ler kolaylıkla görselleştirilmediğinden, büyük PMV'lerin sayı açısından yüzdesi düşüktü. Yeniden kullanmak için şırınganın hızla bastırılmasının yararlı olduğu bulundu.Görünüşte küresel PMV'ler oluşturmayı başaramayan membran enkazı miktarını duple. Dahası, daha küçük ebatlı (1 um'den daha küçük) PMV'ler, birinci ekstrüzyon ortamında bulunmuş ve ikinci ekstrüzyonda daha büyük PMV'ler toplanmıştır.

PMV'lerin en özgün yanı, hücresel bileşenlerin çekirdek 12'yi bir kenara koymaktı. BMSC'ler PMV hazırlama işlemi için kullanılmadan önce EGFP'nin bir ekspresyon kaseti ile 48 saat boyunca transfekte edildi. Sonuçlar, sitoplazmik olarak lokalize EGFP proteininin PMV'lerde kapsüle edilebileceğini göstermektedir ( Şekil 3A ). Mitokondrinin muhafazası, mitokondriyal boyanın boyanması ile kanıtlandı, PMV'lerin büyük bir kısmının, mitokondrinin göstergesi olan yeşil floresan noktalar içerdiğini gösterdi ( Şekil 3 ). PMV'lerin bazıları, hatta 3 μm kadar büyük çaplı olanlar, mitokondrinin kanıtını göstermedi;Bazı mekanik kısıtlamalarda mitokondrinin PMV'lere yapışmasını önleyebilir. Mitokondrinin zar potansiyeli, mitokondrinin normal bir potansiyele sahip olduğu zaman kırmızı flüoresan yayan JC-1 boyaması ile tespit edildi. Sonuç, PMVlerde kırmızı flüoresansın gerçekten tespit edildiğini ( Şekil 3 ) gösterirken, yeşil flüoresans saptanamamıştır (veriler gösterilmemiştir), PMV'lerdeki mitokondrinin işlevsel olduğunu düşündürmektedir.

Özellikle in vivo uygulamada hacim azaltmak için ve ekstrüzyon esnasında salınan hücresel bileşenleri uzaklaştırmak için, PMV'ler için bir konsantrasyon prosesine ihtiyaç duyulmaktadır. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1,200 xg'de santrifüj edildikten sonra, süpernatan içinde çok küçük PMV'ler daha küçük boyutlar bulundu. Pelletin tekrar süspansiyon haline getirilmesi için, santrifüjleme için 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüp kullanıldı. Bununla birlikte, PMV'lerin çoğu pelet içinde toplandı, özellikle PDaha küçük ebatlarda MV'ler ( Şekil 4 ). Muhtemelen membran üzerindeki yapışma moleküllerinden kaynaklanmaktadır. Ortam, bu nedenle, konsantrasyonu gözle görülür bir sitotoksite sahip olmamak üzere uyarlanmış PEI (2 ug / mL) ile takviye edilmiştir. PEI'nin hücre membranına yapışan pozitif yükü, santrifüj işlemi sırasında PMV'lerin toplanmasını engelledi ( Şekil 4 ).

Sonunda, BMSC membranları, PMV'lerin hazırlanmasından önce CM-DiI boya ile etiketlendi ( Şekil 5 ). Konsantre olduktan sonra, farelerin gastroknemius kaslarına PMV'ler enjekte edildi ve bunlar ameliyattan 12 saat sonra hasat edildi ve konfokal mikroskop altında incelendi. Gastroknemius kasının dondurulmuş kesitleri, miyofiber içinde tespit edilen kırmızı flüoresan varlığı açısından incelendi ( Şekil 5 ), PMV'lerin sitoplazmaya, muhtemelen endositoz yoluyla verildiğini gösterdi. Not, kırmızı fluoresanCens, miyofrenin çevresinde (veri gösterilmemiştir) bulunmuştur; bu, PMV'lerin büyük bir kısmının ya endositozdan yoksun olduğunu ya da enjeksiyondan 12 saat sonra sadece endositozun başına geldiğini gösteriyor.

Şekil 1
Şekil 1: Filtre ünitesinin montajı. ( A ) Ticari olarak temin edilebilen polikarbonat membranlar. ( B ) 20X'lik bir objektifle optik bir mikroskop altında izlenen çapı 3 μm olan iz izolasyonlu gözenekler. Ölçek çubuğu = 50 μm. ( C ) Membran tek kullanımlık bir filtre ünitesinin destekleyici matrisinin üstüne yerleştirildi. ( D ) Monte edilmiş bir filtre ünitesi içinde membran bulunmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

page = "1"> şekil 2
Şekil 2: BMSC'lerden PMV'lerin Üretimi. ( A ) Farelerden alınan BMSC'ler 6 oyuklu bir plakada yetiştirildi. ( B ) BMSC'ler (5 x 105) tripsin sindirimi ile hasat edildi ve 500 uL kültür ortamında monodispers edildi. Ekli ve yeniden asılmış BMSC'lerin resimleri, 20X'lik bir objektifle optik mikroskop altında alındı. ( C ) Hücreler, filtre ünitesine bağlanmadan önce bir insülin şırınga içine yüklenmiştir. ( D ) BMSC'lerden üretilen PMV'ler, 35 mm'lik bir cam altı tabağa yüklendi ve 20X'lik bir objektif lens kullanarak ters faz farkı mikroskopu altında incelendi. Ölçek çubukları = 40 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Les / ftp_upload / 55741 / 55741fig3.jpg "/>
Şekil 3: Konfokal mikroskop ile PMV içeriğinin saptanması. PMV'ler, mitozondrianın varlığını izlemek için 30 dakika boyunca mitokondrial boya (1 uM) ile lekelenmiş sitoplazmik olarak lokalize EGFP proteinini izlemek için 48 saat boyunca pEGFP-N1 ile transfekte edilen ( A ) BMSC'lerden veya ( B ) Mitokondrinin zar potansiyelini teyit etmek için 30 dakika boyunca JC-1 (10 ug / mL) ile boyanmış BMSC'ler. BMSC'lerden üretilen PMV'ler, 35 mm'lik bir cam altı tabağa yüklendi ve 100X'lık bir yağ objektif lens kullanarak konfokal mikroskopi ile incelendi. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4
Şekil 4: PMV konsantrasyonu S santrifüjüyle BMSC'ler (5 x 105), tripsin sindirimi ile hasat edildi ve 2 ug / mL PEI ile ya da içermeyen 0.5 mL kültür ortamı içinde yeniden süspanse edildi. Üretilen PMV'ler 1,200 g'de 5 dakika döndürülmüş, 100 uL kültür ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve 40X bir yağ hedefi ile konfokal mikroskop altında incelenmiştir. ( A ) PMV agregasyon şeması muhtemelen santrifüjleme sonrası adezyon moleküllerinin etkileşiminden kaynaklanmaktadır. ( B ) PEI ile şarj edildikten sonra monodispersiyonu muhafaza eden PMV'lerin şeması. ( C ) Santrifüjden sonra toplanmış PMV'ler. ( D ) PMV'ler PEI ile pozitif yüklenmeye bağlı olarak santrifüjden sonra daha az agregasyon sergilerler. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Gure 5 "src =" / dosyalar / ftp_upload / 55741 / 55741fig5.jpg "/>
Şekil 5: Gastroknemius kasına CM-DiI ile işaretlenmiş PMV'lerin verilmesi. PMV'ler 5 x 10 5 BMSC'den üretildi, santrifüj yoluyla 100 uL hacme konsantre edildi ve yavaşça bir BALB / c fare gastroknemius kasına enjekte edildi. ( A ) PMV enjeksiyon şeması. ( B ) CM-DiI ile etiketli BMSCler; Ölçek çubuğu = 20 μm. ( C ) CM-DiI etiketli BMSC'lerden üretilen ve konfokal mikroskopi ile incelenen PMV'ler; Ölçek çubuğu = 10 μm. ( D ) Gastroknemius kası ameliyattan 12 saat sonra hasat edildi; Ölçek çubuğu = 20 μm. ( E - H ) Konfokal mikroskopi ile incelenen gastroknemius kasının dondurulmuş kısmı; Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu araştırma, Li Ka Shing Vakfı, Guangdong Yüksek Düzeyli Üniversite Projesi "Deniz Teknolojileri için Yeşil Teknolojiler", Çin Doğa Bilimleri Vakfı (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925) ve Guangdong Eğitim Bölümü (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IsoporeTM membranes Millipore TSTP04700 3 mm pore
Disposable filter unit Xinya, Shanghai, China 25 mm Medical grade polypropylene
Insulin syringe BD 328446 1 mL
pN1-EGFP Clontech  6085-1
MitoTracker Molecular Probes M7514 Green FM, 1 μM
JC-1 Beyotime, Haimen, China C2006 10 mg/mL
CM-DiI Beyotime, Haimen, China C1036 10 mM
PEI Sigma P3143 Mn = 75,000
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse TE 2000 With CCD camera
Confocol Microscope Carl Zeiss LSM 510 Meta
PolyJet SigaGen SL100688 For cell transfection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
  2. Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
  3. Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
  4. Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
  5. López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  6. Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
  7. Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
  8. Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
  9. Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
  10. Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
  11. Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
  12. Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
  13. Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
  14. Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
  15. Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, Unit 22F.12 (2013).
  16. Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print (2017).
  17. Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
  18. Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
  19. Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
  20. Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
  21. Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).

Tags

Gelişim Biyolojisi Sayı 123 Plazma membran veziküller mitokondriya sitoplazma replasman tedavisi hücre ekstrüzyonu kemik iliği kök hücreleri yaşa bağlı hastalıklar gençleştirme
Potansiyel Sitoplazma Replasman Tedavisi için Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinden Plazma Membran Vesiküllerinin Hazırlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, L. q., Lin, M. j., Li, Y. p.,… More

Xu, L. q., Lin, M. j., Li, Y. p., Li, S., Chen, S. j., Wei, C. j. Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy. J. Vis. Exp. (123), e55741, doi:10.3791/55741 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter