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Developmental Biology

Preparación de vesículas de membrana plasmática de células madre mesenquimales de médula ósea para terapia potencial de reemplazo de citoplasma

Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55741
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Multidisciplinary Research Center, Shantou University

Summary

Enfermedades relacionadas con la edad se asocian con múltiples defectos en los componentes del citoplasma. Aquí, presentamos un protocolo para preparar vesículas de membrana plasmática de células madre mesenquimales de médula ósea. Esta técnica podría utilizarse potencialmente como medio de terapia de reemplazo del citoplasma para mejorar o incluso revertir los fenotipos asociados a la edad.

Abstract

Hemos informado anteriormente sobre la generación de vesículas de membrana plasmática (PMVs) a través de la extrusión mecánica de células de mamíferos. La fusión de PMVs con células Rho0 deficientes mitocondriales restauró la actividad mitótica en condiciones normales de cultivo. La aterosclerosis, la diabetes tipo 2, la enfermedad de Alzheimer y el cáncer son enfermedades relacionadas con la edad que se ha informado que están asociadas con múltiples defectos mecánicos y funcionales en el citosol y organelos de una variedad de tipos celulares. Las células madre mesenquimales de la médula ósea (BMSC) representan una población celular única de la médula ósea que posee capacidades de auto-renovación mientras mantiene su multipotencia. La suplementación de células de senescencia con citoplasma joven de BMSC autóloga a través de la fusión de PMVs proporciona un enfoque prometedor para mejorar o incluso revertir los fenotipos asociados a la edad. Este protocolo describe cómo preparar PMVs de BMSCs a través de la extrusión a través de una membrana de policarbonato con 3Determinan la existencia de mitocondrias y examinan el mantenimiento del potencial de membrana dentro de PMVs usando un microscopio confocal, concentran PMVs por centrifugación y llevan a cabo la inyección in vivo de PMVs en el músculo gastrocnemio de ratones.

Introduction

Se ha dedicado una tremenda cantidad de esfuerzo a establecer enfoques para terapias de reemplazo de genes, enzimas y células. Esto ha dado lugar a grandes avances e incluso aplicaciones clínicas 1 , 2 , 3 . Recientemente, una terapia de reemplazo de mitocondrias polémica basada en la tecnología de transferencia de núcleo se aplicó a la fecundación in vitro para las mujeres de edad avanzada o portador de una mutación mitocondrial letal del ADN [ 4] . Los defectos encontrados en enfermedades relacionadas con la edad, como la aterosclerosis, la diabetes tipo 2, la enfermedad de Alzheimer y el cáncer, suelen ser multifacéticos. Se ha documentado que la acumulación de gotitas de lípidos; La deposición de proteína amiloide; La retención de proteínas desplegadas en el retículo endoplásmico; Y proteasoma defectuoso, autofagosoma y mitocondrias contribuyen al desarrollo o agravamiento de estas enfermedades"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . En la actualidad, no existe un mecanismo disponible dirigido a la remediación directa de malfuncionamiento en el citosol y orgánulos, que causa la senescencia y los fenotipos de envejecimiento.

Hemos informado anteriormente sobre la generación de vesículas de membrana plasmática (PMVs) a través de la extrusión mecánica de células de mamíferos [ 12] . Con la excepción del núcleo, los componentes de la membrana o citosol, incluyendo proteínas y ARN, así como los organelos, como las mitocondrias, se encontraron en PMVs. Esencialmente, una PMV puede ser considerada como una célula enucleada en miniatura. Más importante aún, la fusión de PMVs con células Rho0 deficientes en mitocondrias restauró la actividad mitótica en condiciones normales de cultivo. Este es el primer informe sobreUn enfoque potencialmente eficiente para la terapia de reemplazo del citoplasma.

Las células madre mesenquimales de médula ósea (BMSC) son células progenitoras multipotentes que se generan rutinariamente a partir de la médula ósea y se expanden fácilmente en cultivo. Marcadores de células madre embrionarias Oct4, Nanog, y SOX2 se han detectado a bajos niveles en MSCs [ 13] . La actividad de la telomerasa también es medible. Además, la ausencia de moléculas coestimuladoras y de moléculas de antígeno de leucocitos humanos (HLA) de clase II, así como la baja expresión de HLA de clase I en MSC, las convierten en células ideales para uso alogénico o "off-the-shelf" Tanto la medicina regenerativa como las aplicaciones inmunomoduladoras 14 .

Aquí se describe cómo preparar PMVs de BMSC de ratón mediante extrusión a través de una membrana de policarbonato con poros de 3 μm, determinar la existencia de mitocondrias y examinar el mantenimiento del potencial de membrana en PMVs utilizando confocAl microscopio, preparar concentrados pero no agregados PMV por centrifugación, y llevar a cabo la inyección in vivo de PMVs en el músculo gastrocnemius de ratones.

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Protocol

Se compraron ratones BALB / c de 8 a 12 semanas de edad de Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, China) y se criaron en una instalación de animales específicos libres de patógenos y con aire acondicionado. El cuidado de los animales y los procedimientos experimentales cumplieron con las directrices para el uso y cuidado de animales de laboratorio establecidos por la Universidad de Shantou.

1. Montaje del aparato

  1. Para asegurar la esterilidad, encienda la luz UV de una campana de cultivo de tejidos durante 30 minutos antes de usar.
  2. Desatornille una unidad de filtro desechable de 25 mm y sumerja la tapa y el fondo de la unidad en una taza de vidrio de 200 ml llena con etanol al 75% durante 30 min. La unidad está hecha de polipropileno de grado médico.
  3. Recoger la tapa y la parte inferior de la unidad con fórceps, sacudir el etanol restante a mano, y permitir que las piezas al aire seco durante 10 minutos en la campana.
  4. Humedecer una membrana de policarbonato de 19 mm en PBS y colocarla cuidadosamente en la parte superior de la matriz de soporte del bottoM de la unidad. La película de polímero tiene una superficie lisa, plana y 3 μm poros grabados en pista.
  5. Vuelva a montar la unidad atornillando firmemente la tapa contra el fondo. Asegúrese de que la membrana no se desprenda del centro.
  6. Retire la aguja de una jeringa de insulina de 1 mL y extraiga 1 mL de PBS. Conecte la jeringa a la unidad de filtro y luego empuje PBS a través de la unidad para mojar el conjunto y para comprobar si hay alguna fuga.

2. Generación de vesículas de membrana plasmática (PMV)

  1. Establecer un cultivo BMSC, según lo informado por Nemeth et al. 15 , en medio de cultivo DMEM que contenía 15% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina. Cultivar las células en una placa de 6 pocillos en un incubador humidificado que contiene 5% de CO 2 a 37 ° C.
  2. Para propagar las células, eliminar el medio de cultivo y enjuagar el pocillo con 0,5 ml de PBS sin calcio.
  3. Añadir 0,5 ml de tripsina-EDTA al 0,25% e incubar las células a 37 ° CDurante 3 min. Toque la placa contra la palma de la mano un par de veces para facilitar el desprendimiento celular. Detener la digestión añadiendo 1 mL de medio de cultivo.
  4. Recoger las células en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 2 min en una centrífuga de mesa. Resuspender las células en 4 ml de medio de cultivo y alícuota de las células en dos pozos de una placa de 6 pocillos.
    NOTA: Las células suelen alcanzar la confluencia alrededor de las 24 h.
  5. Para generar PMVs, recoger las células de un pocillo (aproximadamente 5 x 10 5 células) de una placa de 6 pocillos por digestión con tripsina y monodispersar las células en 0,5 ml de medio de cultivo.
  6. Cargue las células en la jeringa de insulina, colóquela en la unidad de filtro y empuje el émbolo rápidamente para apretar las células a través del filtro. Deseche el medio extruido porque sólo debe haber unos pocos PMV dentro de él.
  7. Cargue un 0,5 mL adicional de medio en la jeringa y rápidamente presione a través del filtro. Se recoge el medio de la segunda extrusión, que contieneS PMVs de varios tamaños.
  8. Cargar 150 μl del medio recogido en un plato de 35 mm de fondo de vidrio y dejar que los PMV se depositen en el fondo durante aproximadamente 10 minutos. Examine los PMVs bajo un microscopio de contraste de fase invertido equipado con una cámara CCD usando la lente de objetivo 20X.

3. Examen del Contenido dentro de las PMVs usando Microscopía Confocal

  1. Para realizar la transfección en las BMSC, diluir 2 μg de ADN de plásmido superenrollado y 6 μl de reactivo de transfección catiónica ( por ejemplo, PolyJet) en 50 μl de DMEM exento de suero. Vortex para mezclar bien y girar brevemente para recoger todo el líquido de los lados del tubo.
  2. Añadir la solución diluida (del paso 3.1) gota a gota en solución diluida de ADN, revolver fuertemente durante 1 min, centrifugar brevemente e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
  3. Reemplazar el medio antiguo en las BMSC, que han sido sembradas a aproximadamente 30% de confluencia durante la noche, con 2 ml de medio de cultivo fresco y añadir DNUna mezcla de transfección gota a gota.
  4. Reemplazar con 2 ml de medio fresco después de 12 h de transfección.
  5. Para rastrear las proteínas localizadas citoplasmicamente, transfectar las células con el plásmido que contiene un casete de expresión EGFP (pEGFP-N1), como se ha descrito anteriormente. Se cosecha las células mediante digestión con tripsina 48 h después de la transfección para la generación de PMV, como se ha descrito anteriormente.
  6. Para rastrear las mitocondrias, mancha las células con colorante mitocondrial (1 μ M, MitoTracker) en medio de cultivo fresco durante 30 min a 37 ° C.
  7. Para detectar el potencial de membrana de las mitocondrias, se tiñen las células con el colorante de cianina JC-1 (yoduro de 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraetilbencimidi-dazolilcarbocianina) (10 μg / ML) en medio de cultivo fresco durante 30 min a 37ºC.
    1. Lavar las células con 0,5 ml de PBS tres veces y luego recoger las células por digestión con tripsina para la generación de PMV, como se ha descrito anteriormente.
    2. Carga de 150 μL de la medIum en un plato de fondo de vidrio de 35 mm y permitir que los PMVs se depositen en el fondo durante aproximadamente 10 min. Examine los PMVs bajo un microscopio confocal usando el objetivo de aceite 100X.
  8. Para detectar EGFP o el colorante mitocondrial, activar el láser de 488 nm y recoger la señal a 505-530 nm. Para detectar JC-1, encienda los láseres de 488 nm y 543 nm y recoja las señales a 505-530 nm y 560-615 nm. Establecer el valor del agujero de alfiler a alrededor de 1,4.

4. Preparación de concentrados de PMV por centrifugación

  1. Cosechar las células por digestión con tripsina y generar PMVs, como se describió anteriormente, en 0,5 ml de medio de cultivo.
  2. Girar los PMV a 1.200 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 100 μl de medio de cultivo con suave remolino.
  3. Cargar 50 μL de PMV en un plato de 35 mm de fondo de vidrio y dejar que se asienten a temperatura ambiente durante unos 10 min. Examinar los PMVsBajo un microscopio confocal usando el objetivo de aceite 40X.
  4. Añadir la serie de solución de polietilenimina diluida (PEI) al cultivo BMSC durante 1 h y comprobar si hay signos de citotoxicidad.
    NOTA: Aquí se eligió el PEI a 2 μg / mL ya que no se detectó ningún signo de toxicidad en las BMSC.
  5. Cosecha de las células por digestión con tripsina y añadir PEI a 2 μ g / mL durante 1 h para cargar la membrana celular como un medio para evitar la agregación. Generar PMVs, como se describió anteriormente, en 0,5 mL de medio de cultivo. Concentrar los PMVs y examinarlos bajo un microscopio confocal, como se describe anteriormente.

5. Inyección de PMVs en el músculo gastrocnemio

  1. Para teñir la membrana, añadir CM-DiI (clorometil dialquil-indocarbocianina) (10 μ M) de colorante en 1 mL de medio de cultivo fresco a la BMSCs durante 30 min.
  2. Cosechar las células (aproximadamente 5 x 10 5 ) por digestión con tripsina y resuspender en 0,5 ml de medio de cultivo. Añadir PEI (2 μg / ml) durante 1marido. Generar y concentrar los PMVs en 100 μL de medio de cultivo, como se describe anteriormente.
  3. Anestesiar un ratón BALB / c inyectando sodio barbital (10 mg / kg) después de 12 h de ayuno.
  4. Limpie el exterior del músculo gastrocnemio con etanol al 75%. Inyecte lentamente los PMVs (100 μl) en el músculo gastrocnemio usando una jeringa de insulina de 30 G.
  5. Después de administrar la anestesia, coloque una gasa húmeda sobre los ojos durante la duración del experimento y caliente el ratón con una luz incandescente hasta que se despierte. Coloque el ratón solo en una jaula de ventilación individual.
  6. Para cosechar el músculo gastrocnemio 12 horas después de la operación, matar el ratón por dislocación cervical.
  7. Espolvorear 75% de etanol sobre el músculo gastrocnemio, abrir la piel con tijeras y cortar todo el músculo gastrocnemio en ambos extremos.
  8. Enjuague el músculo con PBS y examínelo bajo un microscopio de fluorescencia usando la lente de objetivo 20X.
  9. Recortar el músculo con unCuchilla de afeitar afilada para quitar de las piezas sin fluorescencia. Cortar las partes con fluorescencia roja fuerte en unos 9 mm 3 cubos.
  10. Insertar cada cubo en medio óptimo de temperatura de corte (OCT), sumergirlo en nitrógeno líquido durante 5 min y almacenarlo en un congelador de -20 ° C hasta su uso.
  11. Cortar las secciones congeladas en trozos de 20 μm de espesor usando un criostato y adherir cada sección a un portaobjetos de vidrio. Enjuague la sección una vez con PBS.
  12. Dibuje un círculo alrededor de la sección con un rotulador de manchas y agregue 100 μL de DAPI (1 μg / mL). Aspirar la solución DAPI después de 10 min de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad y lavar tres veces con PBS.
  13. Coloque el aceite sobre el espécimen, cúbralo con un resbalón de vidrio y selle el portaobjetos con esmalte de uñas. Examine la sección bajo un microscopio confocal usando el objetivo de aceite 100X.
  14. Para detectar CM-DiI, active el láser de 543 nm y recoja la señal a 560-615 nm. Para detectar DAPI, active el 405Nm láser y recoger la señal a 420-480 nm. Establezca el valor del agujero de alfiler a aproximadamente 1,4.

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Representative Results

La clave para una preparación exitosa de los PMVs depende en gran medida del montaje correcto de la unidad de filtro ( Figura 1 ), que se puede probar empujando 1 mL de PBS a través de la membrana. Si se produce una fuga, vuelva a montar la unidad de filtro y vuelva a probar. Sin embargo, la fuga sólo se puede probar confiablemente cuando las células son empujadas a través de la membrana. Si sólo se detectan unos PMVs bajo un microscopio regular usando el objetivo 10X, o si el tamaño de los PMVs es mayormente alrededor de 1 μm, eso indicaría que la mayoría de las células están atrapadas dentro de la unidad debido al montaje incorrecto. PMVs con un tamaño en el rango de alrededor de 3 μ m de diámetro fueron predominantes cuando se examina en un microscopio de contraste de fase utilizando el objetivo 20X ( Figura 2 ]. Dado que los PMVs de tamaño nanométrico no eran fácilmente visualizables, el porcentaje de PMVs grandes en términos de número era bajo. Se encontró que era útil presionar la jeringa rápidamente paraLa cantidad de restos de membrana, que aparentemente falla en formar PMVs esféricas. Además, se encontraron PMVs de tamaños más pequeños (menos de 1 μm) en el primer medio de extrusión, con PMVs más grandes recuperados en la segunda extrusión.

El aspecto más singular de los PMVs fue la inclusión de componentes celulares aparte del núcleo 12 . BMSCs fueron transfectadas con un casete de expresión de EGFP durante 48 h antes de ser utilizado para la preparación de PMV. Los resultados muestran que citoplasmicamente localizada EGFP proteína puede ser encapsulado en PMVs ( Figura 3A ]. El recuento de las mitocondrias se evidenció por la tinción de colorante mitocondrial, lo que demuestra que una gran parte de, pero no todos los PMVs contienen puntos fluorescentes verdes, indicativo de las mitocondrias ( Figura 3 ]. Algunos de los PMV, incluso aquellos con un diámetro tan grande como 3 μm, no mostraron evidencia de que contengan mitocondrias,En algunas restricciones mecánicas podría prevenir la encapsulación de las mitocondrias en PMVs. El potencial de membrana de las mitocondrias fue detectado por tinción JC-1, que emite fluorescencia roja cuando las mitocondrias tienen un potencial normal. El resultado muestra que la fluorescencia roja de hecho se detectó en PMVs ( Figura 3 ], mientras que la fluorescencia verde no era detectable (datos no presentados), lo que sugiere que la mitocondria dentro de los PMVs fueron funcionales.

Se necesita un proceso de concentración para PMVs, especialmente para aplicaciones in vivo para reducir el volumen, así como para eliminar los componentes celulares liberados durante la extrusión. Después de la centrifugación a 1.200 xg durante 5 min a temperatura ambiente, muy pocas PMV de menor tamaño se encontraron en el sobrenadante. Para facilitar la resuspensión del gránulo, se utilizó un tubo de fondo redondo de 2 ml para la centrifugación. Sin embargo, la mayoría de los PMVs se agregaron en el pellet, especialmente PMVs de tamaños más pequeños ( Figura 4 ). Esto es probablemente debido a moléculas de adhesión en la membrana. Por lo tanto, el medio se suplementó con PEI (2 μg / ml), cuya concentración se ajustó para que no tuviera citotoxicidad notable. La carga positiva de PEI unido a la membrana celular impedido la agregación de PMVs durante la centrifugación ( Figura 4 ].

Finalmente, las membranas de BMSCs se marcaron con CM-DiI tinte antes de la preparación de los PMVs ( Figura 5 ]. Después de la concentración, se inyectaron PMV en los músculos gastrocnemios de los ratones, que se cosecharon 12 horas después de la operación y se examinaron bajo un microscopio confocal. Las secciones congeladas del músculo gastrocnemio se examinaron para la presencia de fluorescencia roja, que se detectó dentro de la miofibra ( Figura 5 ], lo que demuestra que PMVs fueron entregados al citoplasma, probablemente a través de endocitosis. De la nota, las fluorescencias rojas(Datos no mostrados), lo que indica que una gran fracción de PMVs no estaban endocitadas o estaban al comienzo de la endocitosis a las 12 h después de la inyección.

Figura 1
Figura 1: Montaje de la unidad de filtro. ( A ) Membranas de policarbonato comercialmente disponibles. ( B ) Poros grabados en la pista de 3 μm de diámetro, vistos bajo un microscopio óptico con un objetivo de 20X. Barra de escala = 50 μm. ( C ) La membrana se colocó encima de la matriz de soporte de una unidad de filtro desechable. ( D ) La unidad de filtro ensamblada con una membrana interior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Page = "1"> Figura 2
Figura 2: Generación de PMVs de BMSCs. ( A ) BMSCs de ratones se cultivaron en una placa de 6 pocillos. ( B ) Se cosecharon BMSC (5 x 10 ^ { 5 }) por digestión con tripsina y se monodispersaron en 500 mu l de medio de cultivo. Las imágenes de BMSCs unidos y resuspendidos se tomaron bajo un microscopio óptico con un objetivo de 20X. ( C ) Las células se cargaron en una jeringa de insulina antes de ser unidas a la unidad de filtro. ( D ) Las PMV generadas a partir de BMSC se cargaron en una placa de fondo de vidrio de 35 mm y se examinaron bajo un microscopio de contraste de fase invertido usando una lente de objetivo 20X. Barras de escala = 40 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Detección del contenido de PMV por microscopía confocal. Las PMVs se generaron a partir de ( A ) BMSCs transfectadas con pEGFP-N1 durante 48 h para rastrear la proteína EGFP localizada citoplasmicamente, ( B ) BMSCs teñidas con colorante mitocondrial (1 μM) durante 30 min para rastrear la existencia de mitocondrias o ( C ) BMSCs tinción con JC-1 (10 μ g / mL) durante 30 min para confirmar el potencial de membrana de las mitocondrias. Los PMV generados a partir de BMSCs se cargaron en un plato de fondo de vidrio de 35 mm y se examinaron mediante microscopía confocal usando una lente de objetivo de aceite 100X. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Concentración de PMV S por centrifugación. Se cosecharon BMSC (5 x 105) por digestión con tripsina y se resuspendieron en 0,5 ml de medio de cultivo, que se suplementó con o sin 2 μg / ml de PEI. Las PMV generadas se centrifugaron a 1.200 g durante 5 min, se resuspendieron en 100 μl de medio de cultivo y se examinaron bajo un microscopio confocal con un objetivo de aceite 40X. ( A ) Esquema de agregación de PMV probablemente causada por la interacción de moléculas de adhesión después de la centrifugación. ( B ) Esquema de PMVs que mantienen la monodispersión después de cargarse con PEI. ( C ) PMV agregados después de la centrifugación. ( D ) Las PMV muestran menos agregación después de la centrifugación debido a la carga positiva con PEI. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Entrega de PMVs marcados con CM-DiI al músculo gastrocnemio. Las PMV se generaron a partir de 5 x 10 5 BMSC, se concentraron por centrifugación en un volumen de 100 μl y se inyectaron lentamente en el músculo gastrocnemio de un ratón BALB / c. ( A ) Esquema de la inyección de PMV. ( B ) BMSC marcadas con CM - DiI; Barra de escala = 20 μm. ( C ) PMV generadas a partir de BMSC marcadas con CM-DiI y examinadas por microscopía confocal; Barra de escala = 10 μm. ( D ) Músculo gastrocnemio cosechado 12 horas después de la operación; Barra de escala = 20 μm. ( E - H ) Sección congelada del músculo gastrocnemio examinada por microscopía confocal; Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por la Fundación Li Ka Shing, el Proyecto de la Universidad de Alto Nivel de Guangdong "Tecnologías Verdes para Industrias Marinas", la Fundación de Ciencias Naturales de China (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925), y el Departamento de Educación de Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IsoporeTM membranes Millipore TSTP04700 3 mm pore
Disposable filter unit Xinya, Shanghai, China 25 mm Medical grade polypropylene
Insulin syringe BD 328446 1 mL
pN1-EGFP Clontech  6085-1
MitoTracker Molecular Probes M7514 Green FM, 1 μM
JC-1 Beyotime, Haimen, China C2006 10 mg/mL
CM-DiI Beyotime, Haimen, China C1036 10 mM
PEI Sigma P3143 Mn = 75,000
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse TE 2000 With CCD camera
Confocol Microscope Carl Zeiss LSM 510 Meta
PolyJet SigaGen SL100688 For cell transfection

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