Summary
Методика, основанная на модифицированном градиенте плотности центрифугирования, была использована для выделения эпителиальных клеток из ткани кишечника Ripicephalus microplus . Поверхностные белки биотинилировали и очищали с помощью стрептовидиновых магнитных гранул для использования в нисходящих приложениях.
Abstract
Rhipicephalus microplus - клещ крупного рогатого скота - является самым значительным эктопаразитом с точки зрения экономического воздействия на скот в качестве вектора нескольких патогенов. Усилия были направлены на контроль клеща крупного рогатого скота, чтобы уменьшить его пагубные последствия, с упором на открытие кандидатов на вакцины, таких как BM86, расположенных на поверхности эпителиальных клеток кишечника. В текущих исследованиях основное внимание уделяется использованию кДНК и геномных библиотек для скрининга других кандидатов на вакцины. Выделение клеток клещей кишки является важным преимуществом при исследовании состава поверхностных белков на мембране клеток клещей. Эта статья представляет собой новый и осуществимый метод выделения эпителиальных клеток, из содержимого кишечника в виде полупоглощенного R. microplus. В этом протоколе используются TCEP и EDTA для высвобождения эпителиальных клеток из субэпителиальных опорных тканей и градиента дискретной плотности центрифугированияNt для отделения эпителиальных клеток от других типов клеток. Белки клеточной поверхности были биотинилированы и выделены из эпителиальных клеток тикового кишечника, используя магнитные гранулы, связанные с стрептавидином, что позволяет использовать последующие приложения в FACS или LC-MS / MS-анализе.
Introduction
Rhipicephalus microplus , крупный рогатый скот, является самым значительным эктопаразитом с точки зрения экономического воздействия на крупный рогатый скот в тропических и субтропических регионах, поскольку он переносит лихорадку крупного рогатого скота (бабезиоз), анаплазмоз и конский пироплазмоз 1 , 2 , 3 , 4 . Усилия были направлены на контроль крупного рогатого скота, чтобы уменьшить пагубный эффект, однако обычные методы, такие как использование химических акарицидов, имеют скрытые недостатки, такие как наличие химических остатков в молоке и мясе, а также увеличение распространенности химически устойчивых клещей 5 , 6 , 7 . Следовательно, были изучены разработки альтернативных методов контроля тика, такие как использование натурального скота, биологический контроль (биопестициды) и вакцинация4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .
В погоне за белками, которые могут быть использованы в качестве кандидатов на вакцины, текущие исследования сосредоточены на кишке. Стена средней кишки построена из одного слоя эпителиальных клеток, опирающегося на тонкую базальную пластинку, а наружная базальная пластинка образует сеть мышц. Наблюдения света и электронного микроскопа показывают, что средняя кишка состоит из трех типов клеток: резервной (недифференцированной), секреторной и пищеварительной. Количество типов клеток значительно варьируется в зависимости от физиологической фазы. Секреторные и пищеварительные клетки происходят из резервных клеток 18 , 19 , 20 .
Построение библиотек кДНКДля изучения состава клещей кишки привело к идентификации антигенных белков, таких как Bm86, в качестве потенциальных кандидатов вакцины 2 , 3 , 4 . Гликопротеин Bm86 локализуется на поверхности клеток кишечника клещей и индуцирует защитный иммунный ответ против клеща крупного рогатого скота ( R. microplus ) у вакцинированного крупного рогатого скота. Анти-Bm86 IgG, продуцируемые иммунизированным хозяином, проглатываются клещей, распознают этот антиген на поверхности клеток кишечника клеща и впоследствии нарушают функцию и целостность ткани кишечника. Вакцины, основанные на антигенах Bm86, показали эффективный контроль R. microplus и Rhipicephalus annulatus за счет сокращения числа, веса и репродуктивной способности сыпучих самок, что привело к снижению личиночной инвазии в последующих клеточных поколениях 4 . Однако вакцины на основе Bm86 не эффективны против всех этапов тика и имеютПродемонстрировали неудовлетворительную эффективность против некоторых географических штаммов R. microplus , поэтому говядина и молочная промышленность плохо приняли эти вакцины 2 , 4 .
Способность изолировать эпителиальные клетки от клещей кишечника является важным новшеством, которое позволило бы прогрессировать исследования для определения состава белковой мембраны, включая морфологию и физиологию в различных условиях окружающей среды. Описанный здесь способ использует хелатирующий агент этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и восстановитель трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP) для высвобождения эпителия из его субэпителиальных поддерживающих тканей 10 . Эпителий восстанавливается после механического разрушения тканей путем встряхивания с последующим центрифугированием с разрывом градиента в Percoll. В этой статье описывается возможный и новый метод изоляции клещей кишечника epiТеалиальные клетки. Биотинилированные клеточные поверхностные белки, выделенные с поверхности этих эпителиальных клеток, могут впоследствии анализироваться в нисходящих приложениях, таких как FACS и / или LC-MS / MS-анализ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Рассечение кишечного эпителия от R. microplus
- Собирайте полупоглощенные клещи от крупного рогатого скота в день эксперимента. Просеивать тики в течение 24 часов после удаления с хозяина.
- Прикрепите полоску клейкой ленты к нижней части чашки Петри размером 92 мм x 16 мм. Добавьте каплю супер клея на ленту. Поместите тик, вентральную сторону вниз на супер клей, дайте высохнуть в течение 2 мин.
- Налейте 100 мл фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) в чашку Петри или до тех пор, пока тик не будет полностью погружен в воду.
- С помощью скальпеля размером 11, вырезанного с верхней части глаз до нижнего фестона, с обеих сторон клеща.
- С помощью стерильного пинцета, полностью удалить Щит и alloscutum, чтобы выставить внутренние органы.
- Удалите мелкие белые нитевидные органы (трахею) и другие мембраны, чтобы предотвратить загрязнение.
- Удалите кишку, используя щипцы, зажав верхнюю область и вытащив ее изтушки. Удалите все оставшиеся ткани кишечника, гарантируя, что никакие другие ткани не будут расчленены.
- Хранить кишечник в ледяном солевом растворе Хэнкса (HBSS) без хлорида кальция и сульфата магния с коктейлем ингибитора протеиназы (ПОС). Snap заморозить кишки в сухом льду и хранить при -20 ° C.
Примечание: для оказания помощи при расщеплении кишечника и деталях клеточных внутренних органов см. Главу 3.1 Д. Sonenshine, «Biology of Ticks» 19 .
2. Диссоциация эпителиальных клеток
- Вылейте расчлененную кишку на сетчатый фильтр размером 70 мкм внутри трубки объемом 50 мл.
- Промойте ткань кишечника 50 мл ледяного HBSS с помощью PIC, пока раствор не станет прозрачным, и кишки приобретают белый / прозрачный вид.
- Повторно суспендируйте кишки в 30 мл ледяной HBSS с помощью PIC, осторожно перемешайте и центрифугируйте при 500 × g при 4 ° C в течение 10 минут, чтобы осадить кишечник. Удалите супернатант и повторите процесс стирки три раза.
- Отфильтруйте суспензию через сетчатый фильтр размером 250 мкм, прокрутите проточный фильтр и процедите через сетчатый фильтр размером 70 мкм, собирая оставшийся сквозной поток.
- Центрифугируйте суспензию при 500 × g при 4 ° C в течение 20 минут, чтобы осадить отдельные клетки.
3. Выделение одиночных эпителиальных клеток с использованием градиента центрифугирования плотности
- Подготовьте градиент центрифугирования плотности ( например , Percoll) путем фильтрации через предварительно фильтрующую бумагу AP15. Подготовьте 40% и 20% Percoll в mqH 2 0 (об. / Об.) И охладите при 4 ° C в течение 1 часа перед расслоением градиента.
- Использование перистальтикиНасос на минимальной скорости, слой 3 мл градиента центрифугирования плотности 40% в пробирку для ультрацентрифугирования емкостью 16 мл, позволяя ему оседать на льду в течение 15 мин. Скорость насоса должна приводить к скорости потока <1 мл на мин.
- Наклоняя трубку под углом 45 °, используйте перистальтический насос для выравнивания градиента центрифугирования плотности 20% поверх слоя 40%. Скорость насоса должна составлять менее 1 мл на минуту. Дайте слоям оседать на льду в течение 15 мин.
- Используйте перистальтический насос со скоростью <1 мл на минуту до слоя 3 мл среды DMEM, содержащей клетки клещевого кишки, с градиентом центрифугирования с концентрацией 20-40%.
- Запрограммируйте центрифугу для максимального ускорения и минимального замедления. Центрифуга при 600 мкг в течение 10 мин. Собирайте интерфазы между градиентом центрифугирования плотности DMEM: 20% и градиентами центрифугирования плотности 20%: 40% для выделения эпителиальных отдельных клеток. Храните собранные интерфазы при 4 ° C для последующего анализа.
4. Оценка изоляции клеток
- гомоцитометр
- Очистите гемацитометр слайдом со спиртом.
- . Подвесить клетки, осторожно пипеткой клеток вверх и вниз. Пипеткой 100 мкл клеточной суспензии и помещают в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку.
- Добавить 400 мкл 0,4% трипанового синего. Аккуратно перемешайте трубку.
- Внесите 100 мкл суспензии клеток, обработанной Trypan Blue, для медленного заполнения обеих камер гемоцитометра.
- Поместите гемоцитометр под световым микроскопом, сосредоточив внимание на линиях сетки гемоцитометра с объективом 10X.
- Используя ручной счетчик счетчиков, подсчитайте живые незакрашенные ячейки в пределах набора из 16 квадратов. В пределах одной и той же площади подсчитайте синие мертвые клетки. Продолжайте считать до четырех наборов из 16 квадратов.
- Рассчитайте общее количество клеток на мл, используя формулу:
47eq1.jpg "/> - Вычислите процентную жизнеспособность клеток, используя формулу:
- Визуализация изолятов клеток
- Разбавьте 1 мкл изолированных клеток в 9 мкл HBSS в 1,5 мл микроцентрифужной пробирке. Протрите микроцентрифужную пробирку мягко, чтобы перемешать.
- Внесите 5 мкл изолированных клеток в HBSS в середину стеклянного слайда. Нанесите три капли монтажной среды с помощью 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI).
- Инкубируйте слайд при комнатной температуре в течение 5 мин. Осторожно поместите крышку над препаратом, избегая пузырьков воздуха.
- Визуализируйте клетки, окрашенные DAPI при возбуждении 360 нм, и излучение при 460 нм под флуоресцентным микроскопом.
5. Биотинилирование поверхностных белков клеток
- Биотинилируют 100 мкл одноклеточных эпителиальных клеток с использованием конъюгации биотина (типа А)Комплект, при молярном отношении поверхностного белка 1: 1 к конъюгату, согласно инструкциям производителя
- Для лизиса клеток добавьте 100 мкл PBS, 1% Triton X-100, 10% глицерина, 100 мкМ окисленного глутатиона и PIC в биотинилированные клетки. Инкубируйте на льду в течение 1 ч с осторожным перемешиванием каждые 10 мин.
- Центрифугируют биотинилированные клетки при 20 000 × g при 4 ° C в течение 20 минут до нерастворимого в гранулах материала. Собирают супернатант, содержащий цитоплазматические и биотинилированные мембранные белки.
- Определите концентрацию белка, используя анализ Брэдфорда.
6. Выделение биотинилированных поверхностных белков
- Добавить 50 мкл магнитных шариков Стрептавидина в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку.
- Поместите трубу в магнитную подставку, собирая бусины сбоку от трубки. Удалите и выбросьте супернатант.
- Добавить 1000 мкл TBS, 0,1% Tween-20 в пробирку. Аккуратно перемешайте и соберите бусины с магнитной стойкойд. Удалите и выбросьте супернатант.
- Объединить 40 мкг биотинилированных поверхностных белков клеток, разведенных до 300 мкл в 1х PBS с промытыми магнитными шариками. Инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре при перемешивании.
- Соберите бусины с магнитной подставкой, удалите и выбросьте супернатант.
- Добавить 300 мкл TBS, 0,1% Tween-20 в пробирку, осторожно перемешивая для повторного суспендирования гранул. Соберите бусинки, удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите эту операцию промывки дважды.
- Добавьте 100 мкл 0,1 М глицина pH 2,0 к магнитным гранулам и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин. Соберите гранулы и удалите супернатант, содержащий элюированные биотинилированные поверхностные белки.
- Визуализируйте изолированные поверхностные белки на 4-20% гель Tris-MOPS SDS-PAGE.
7. Оценка биотинилированного поверхностного белка
- Dot Blot
- Отрежьте полосу нитроцеллюлозы размером 7 см х 3 см.
- Примените 10 мкг общего тика гу(От 1,8 выше) и 10 мкг биотинилированного поверхностного белка к мембране. Разрешить сушку в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Перенесите в контейнер и погрузите в 100 мл блокирующего буфера. Инкубируйте при комнатной температуре с перемешиванием в течение часа. Отменить блокирующий буфер.
- Промыть нитроцеллюлозную мембрану в 100 мкл PBS, 0,05% Tween-20 в течение 5 мин при перемешивании. Откажитесь от промывочного буфера и повторите промывки три раза.
- Инкубируйте в 1/5000 пероксидазы стрептавидин-хрена (HRP) в 100 мкл PBS, 0,05% Tween-20 в течение 2 часов при перемешивании при комнатной температуре и отбрасывают любой оставшийся раствор.
- Промыть нитроцеллюлозную мембрану в 100 мкл PBS, 0,05% Tween-20 в течение 5 мин при перемешивании. Удалите промывочный буфер и повторите промывку три раза.
- Для обнаружения растворите 1 таблетку 4-хлор-1-наптола в 10 мл ледяного метанола. Добавьте 4 мл метанола в 20 мл TBS. Добавьте 10 мкл свежего 30% перекиси водорода и немедленноПрименяются к нитроцеллюлозной мембране.
- Инкубируйте при перемешивании при комнатной температуре, пока субстрат не образует нерастворимый синий конечный продукт. Это может занять от 2 до 15 минут.
- Откажитесь от раствора для обнаружения и промойте мембрану три раза в 100 мкл mqH 2 O.
- Анализ ELISA
- Разбавьте 200 нг каждого образца 400 мкл 100 мМ буфера для карбонатного покрытия и слоем 2 полосы первого ряда (A #) пластины ELISA (плоские дно)
- Добавьте 100 мкл 100 мМ буфера для карбонатного покрытия во все другие соответствующие лунки в рядах (BH).
- Подготовьте серийные разведения каждого образца путем пипетирования 100 мкл из каждой лунки в ряду А и переноса в ряд В. Смешайте осторожно путем пипетирования и избегайте образования пузырьков. Повторите разведения вниз по каждой строке, отбросив окончательные 100 мкл от каждой лунки в ряду H.
- Накройте пластину парафильмом и инкубируйте при 4 ° C в течение ночи.
- Вымойте плитуС 200 мкл PBS, 0,05% Tween-20 на лунку три раза.
- Добавьте 200 мкл блокирующего буфера в покрытые лунки, накройте Parafilm и инкубируйте при 4 ° C в течение ночи.
- Разбавьте 1/15 000 стрептавидин-HRP в блокирующем буфере и добавьте 100 мкл в каждую лунку планшета. Накрыть парафильмом и инкубировать при 4 ° C в течение ночи.
- Промойте планшет в 200 мкл PBS, 0,05% Tween-20 на лунку пять раз.
- Чтобы обнаружить, добавьте 100 мкл реагента ТМБ на лунку. После достаточного развития цвета, обычно между 10-15 мин, добавьте 100 мкл 1 М фосфорной кислоты, чтобы остановить реакцию.
- Прочтите поглощение каждой лунки при λ = 450 нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эпителиальные клетки были выделены из тканей кишечника R. microplus в соответствии с схемой, представленной на рисунке 1 . Репрезентативные снимки флуоресцентной микроскопии эпителиальных клеток кишечника, полученные с использованием этого протокола, показаны на фиг.2А И 2В. Поскольку изоляция клеток проводится на полупоглощенном R. microplus, клетки появляются как сингулярная, сферическая, гладкая морфология поверхности и постоянный размер всей выборки. Различия в размерах и типе популяций клеток кишки становятся более очевидными после того, как тик продолжает становиться полностью насыщенным взрослым.
Флуоресцентное окрашивание ядра изолированных эпителиальных клеток с помощью DAPI помогает визуализировать клетки. Плохая изоляция визуализируется так, чтобы содержать неполную диссоциацию эпитаКлеток элиции с различными популяциями клеток, идентифицированных с помощью различных размеров и морфологии клеток ( рис. 2C и 2D )
Используя этот протокол, приблизительно 1,1 × 10 7 клеток в расчете на 1 мл из 50 клеточных кишечных расщеплений с жизнеспособностью 75-80% были успешно изолированы от кишечника R. microplus . Перекрестное загрязнение от белков хозяина ( рис. 3А ) можно свести к минимуму путем адекватного ополаскивания клещей кишки до тех пор, пока они не станут белыми, что приведет к белому / прозрачному градиенту Перколла ( Фиг. 3В ).
Поверхностные белки выделяли путем биотинилирования поверхностных белков, разрушения клеточных мембран и очистки биотинилированных поверхностных белков магнитными стрептавидиновыми шариками. В общей сложности 20-24 мкг очищенной биотиныБелковые поверхностные белки могут быть выделены для приложений с нисходящим потоком от первоначального вскрытия клещей размером 50x, использующих этот протокол. Сравнение белков с помощью SDS-PAGE ( фиг. 4A ), серебряное пятно ( фиг. 4B ), Dot-блот ( фиг. 5 ) и ELISA ( фиг. 6 ) показывают, что описанная методика успешно очищает биотинилированные поверхностные белки от эпителиальных клеток, выделенных из R. microplus tick потрошить.
Рисунок 1 : Схематическое представление для выделения биотинилированных белков, присутствующих на поверхности клеток микросферы R. microplus . Пожалуйста, clIck здесь, чтобы просмотреть большую версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Визуализация флуоресцентного микроскопа (100x) эпителиальных клеток миокарда R. microplus, окрашенных DAPI. Программное обеспечение использовалось для проведения флуоресцентного наложения. A & B). Изображают эпителиальные клетки, успешно выделенные из средней кишки R. microplus . C / D) Эпителиальные клетки, выделенные из кишечника R. microplus, зараженные более крупными тканями тика.
Рисунок 3 : градиент Percoll, содержащий DMEM: 20% Percoll: 40% Percoll. Уровни эпителиальных клеток были образованы между DMEM: 20% PErcoll и 20: 40% Percoll. ( A ) Рассеивать кишечник без надлежащей промывки. ( B ) Разбивка кишечника с достаточной степенью очистки. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4 : Электрофоретическое разделение биотинилированных поверхностных белков выполняется на 4-20% гель Tris-MOPS при 140 В в течение 55 мин при использовании 10 мкг образца. (L) , PageRuler предварительно окрашенные белковые лестницы (1) немеченый Р. MicroPlus весь образец кишки (2) биотинилированные белки , извлеченный из Р. MicroPlus всей кишки в соответствии с шагом 6. (3) Белки из эпителиальных клеток , выделенных из немеченой R. MicroPlus кишки (4 ) Биотинилированные белки, экстрагированные из R. microplusЭпителиальных клеток согласно шагу 6. ( A ) SDS-PAGE, окрашенное синим комасси ( B ) Серебряное пятно.
Рисунок 5 : Точечный анализ. Стрептавидин-HRP конъюгированный разведенный 1/5000. ( A ) В общей сложности 10 мкг экстракта белкового белка кишки ( B ) Биотинилированные поверхностные белки, экстрагированные из очищенных эпителиальных клеток (10 мкг).
Рисунок 6 : Оценка жизнеспособности биотинилированных поверхностных белков с использованием ELISA. ELISA поверхностных белков был разработан конъюгированным антителом Strep-HRP, разбавленным 1/15 000, против различных концентраций биотинилированного тикаK кишечных белков (от 0,7 нг до 100 нг). В качестве отрицательного контроля над ELISA использовали немаркированные белки кишечного белка и бычий сывороточный альбумин (BSA). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Население крупного рогатого скота представляет собой серьезную проблему для крупного рогатого скота в тропических и субтропических регионах мира, причем наиболее распространенный метод контроля зависит от использования акарицидов 1 , 4 . Bm86 ранее был идентифицирован в эпителиальной поверхности кишечника тика в качестве защитного антигена против заражения R. microplus 10 с ограниченным успехом в качестве стратегии вакцинации из-за изменения географической последовательности Bm86 и требования для регулярного повышения 4 .
Предыдущие публикации, посвященные методам эпителиальной изоляции, в основном были сосредоточены на позвоночных животных или насекомых 9 , 11 , 12 , 13 , 14 . Например, ранние попытки фракционирования изолировать среднюю кишкуИспользуя методы млекопитающих, обнаружили, что одна и та же методология не может быть применена к насекомым из-за различной структуры клеток и организаций 12 . Кроме того, методы млекопитающих основаны на использовании либо дипазы, либо коллагеназы, чтобы ферментативно переваривать белки соединения клеток-клеток 9 , 13 . Дипаза и коллагеназа значительно влияют на клеточные поверхности, связанные с белками, и поэтому методы, зависящие от их использования, не подходят для исследований белка на клеточной поверхности 15 . В настоящее время изоляция клеток среднего насекомого сосредоточена на двух методах. Первый использует механическое разрушение средней кишки через ультразвук с последующим разделением на непрерывный линейный градиент сахарозы 8 , 11 , 12 , 14 . Эта механическая техника дает образцы, почти не содержащие загрязнений,Ver дает низкий выход микровиллерных мембран 14 . Второй метод основан на нарушении Tris мембран для освобождения микровиллерных мембран 8 .
Методика, изложенная в этой статье, позволяет выделять эпителиальные клетки, биотинилирование поверхностных белков и их изоляцию 16 , позволяя проводить дальнейшие исследования с помощью последующих приложений, таких как масс-спектрометрия или FACS. Описанный здесь способ использует хелатирующий агент EDTA и восстановитель TCEP. EDTA функционирует для секвестрации ионов кальция, ингибирования кадгеринов, разрушения связанных с кадгерином клеточных клеточных переходов, в то время как TCEP уменьшает дисульфидные связи, которые придают вязкость богатой гликанами слизистой подобной перитрофической матрицы, которая отделяет просвет кишечника от эпителия. Эпителий восстанавливается после механического разрушения тканей путем встряхивания с последующим центрифугированием с разрывом градиента в денситномY градиент центрифугирования. Эпителиальные клетки выделяют между градиентом центрифугирования плотности DMEM: 20% и 20%: 40% градиентом плотности центрифугирования.
Использование более высокой температуры при диссоциации эпителиальных клеток приведет к тому, что крупные ткани будут диссоциировать из кишечника, что приведет к неспособности выделить эпителиальные клетки. Обеспечение своевременного проведения диссоциации эпителиальных клеток после вскрытия клещей; Использование ледяных буферов и предотвращение высоких скоростей центрифугирования имеет решающее значение для сохранения живых жизнеспособных клеток. Несмотря на это, вытеснение более крупных клеток из базальной пластинки может обеспечить некоторое загрязнение. Кроме того, эпителий средней кишки клеща изменяется в значительной степени в зависимости от времени от последней еды 18 , 19 , 20 .
Таким образом, этот протокол был разработан и доступен на R. microplus рис. 1 ) имеют одинаковую природу.
В заключение, методы, используемые в этом исследовании, успешно изолировали эпителиальные клетки от всего кишечника R. microplus . Для дальнейшего анализа и исследований были получены белки с поверхности эпителиальных клеток R. microplus . Наконец, разработанный протокол продемонстрировал потенциальный выход эпителиальных клеток из кишечника клещей и эффективность биотинилированных поверхностных белков клетки. Разработанный протокол может быть использован в любом тике видов экономической значимости в попытке исследовать клещей: взаимодействие хозяина путем изучения мембранного белка comПоложение кишечника.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить биозащищенности Tick колонию (Квинсленд Департамент сельского хозяйства и рыболовство, Австралия) для предоставления Rhipicephalus MicroPlus клещи , используемой для данного исследования, и Лукас Karbanowicz за помощью видеосъемки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM Carbonate Buffer | 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6 | ||
| 16 mL centrifuge tubes with sealing cap | Thermo Scientific | 3138-0016 | Cool in ice prior to gradient |
| 250 µM cell strainer | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA | Sigma | T0440 | Stored at 4C |
| 30% Hydrogen Peroxide | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20% Tris-MOPS Gel | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol tablet | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning Blue | 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube. | |
| 70 µM cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 filter paper | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | Olympus | 2.2.1.195 | Cell imagery software |
| Duct Tape | Home Handyman | 48mm x 25mm Duct Tape | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM - ice cold for protocol |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| Forceps | Dumont | #9 Dumont - Switerzland | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol for molecular biology >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| Hand-Held Counter | Officeworks | JA0376230 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – ice cold for protocol |
| Hemacytometer | Optik Lakor | - | - |
| L-Glutathione oxidized | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| Magnetic Separation Stand | Novagen | - | 4-Tube Magnetic Separation Rack |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | Integral Water Purification System for Ultrapure Water |
| Nitrocellulose Membrane | Life Sciences | 66485 | 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane |
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| Peristaltic Pump | Masterflex | 7518-10 | |
| Phosphoric Acid | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer | Thermo-Scientific | 37573 | Stored at 4C. Blocking Buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – stored at -20 °C |
| Quick Start Bradford Dye Reagent 1x | Biorad | 500-0205 | For Bradford Assay |
| Quick Start BSA Standards | Biorad | 500-0207 | BSA standards for Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM Staining Kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue - Ultra Fast Mini | UHU | UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | Thermo Fisher | 20490 | |
| Triton X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| Vortex Mixer | Ratek | VM1 | |
| Water Bath | Grant | GD100 |
References
- Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
- De Rose, R., et al. Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).
- García-García, J. C., et al. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).
- Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play. Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).
- Kearney, S. Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , AgNote No. K58. (2013).
- Foil, L. D., et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).
- Rodriguez, M., et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).
- Rodriguez, M., et al. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).
- Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases. Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).
- Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).
- Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure. Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).
- Koefoed, B. M. A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells. Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).
- Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. Plasma membranes from insect midgut cells. An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).
- Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Stem Cells. 879, 479-490 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Karhemo, P. R., et al. An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis. J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).
- Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. Current Themes in Tropical Science Volume 1. , Pergamon Press. 201-205 (1982).
- Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. "Biology of Ticks". 1, Two, Oxford University Press. (2014).
- Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. "An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure" (English Translation). , Entomology Society of America Entomological Society of America. (1983).
