Summary
Een gemodificeerde dichtheidscentrifugatiegradient gebaseerde methodologie werd gebruikt om epitheelcellen van Rhipicephalus microplus gutweefsel te isoleren. Oppervlakte gebonden eiwitten werden biotinyleerd en gezuiverd door streptavidine magnetische kralen voor gebruik in downstream toepassingen.
Abstract
Rhipicephalus microplus - de veestok - is de belangrijkste ectoparasiet in termen van economische impact op vee als vector van verschillende pathogenen. Er is gewerkt aan de veestokcontrole om de schadelijke effecten ervan te verminderen, met de nadruk op de ontdekking van vaccinekandidaten, zoals BM86, gelegen op het oppervlak van de epitheelcellen. Huidig onderzoek richt zich op het gebruik van cDNA en genomische bibliotheken, om te screenen voor andere vaccin kandidaten. De isolatie van tikgutcellen vormt een belangrijk voordeel bij het onderzoeken van de samenstelling van oppervlakte-eiwitten op het membraan van de tikkeldarmcellen. Dit papier vormt een nieuwe en haalbare methode voor het isoleren van epitheliale cellen, uit de tikgutinhoud van halfgegraveerde R. microplus. Dit protocol maakt gebruik van TCEP en EDTA om de epitheelcellen uit de subepitheliale ondersteunende weefsels te ontlasten en een discontinuous density centrifugatiegradieNt om epitheelcellen van andere celsoorten te scheiden. Cel-oppervlakte-eiwitten werden biotinyleerd en geïsoleerd uit de epitheelcellen van de tikgut, met behulp van streptavidine-gekoppelde magnetische kralen, die toestaan voor downstream toepassingen in FACS of LC-MS / MS-analyse.
Introduction
Rhipicephalus microplus , de veestok, is de meest significante ectoparasiet in termen van economische impact op de veeindustrie van tropische en subtropische regio's, aangezien het vectoren boviene tik koorts (babesiosis), anaplasmose en paardenpiroplasmosis 1 , 2 , 3 , 4 is . Er zijn inspanningen gedaan voor veestokcontrole om het schadelijke effect te verminderen, maar conventionele methoden zoals het gebruik van chemische acariciden hebben impliciete nadelen, zoals de aanwezigheid van chemische residuen in melk en vlees, en de toename van de prevalentie van chemisch resistente tegels 5 , 6 , 7 . Bijgevolg is de ontwikkeling van alternatieve methoden voor tikbesturing onderzocht, zoals het gebruik van natuurlijk resistentiebeest, biologische bestrijding (biopesticiden) en vaccinInen 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .
In het nastreven van eiwitten die kunnen worden gebruikt als vaccin kandidaten, is het huidige onderzoek gericht op de tikgut. De midgutmuur is gebouwd uit een enkele laag epitheliale cellen die op een dunne basale lamina rusten, waarbij de buitenkant van de basale lamina een netwerk van spieren vormt. Licht- en elektronmicroscoopwaarnemingen wijzen erop dat de midgut bestaat uit drie typen cellen: reserve (ongedifferentieerd), secretie en spijsvertering. Het aantal celtypes varieert aanzienlijk afhankelijk van de fysiologische fase. Secretory en spijsverteringscellen zijn afkomstig van reservecellen 18 , 19 , 20 .
De constructie van cDNA bibliothekenOm de samenstelling van de tikgoot te onderzoeken heeft geleid tot de identificatie van antigeen eiwitten, zoals Bm86, als potentiële vaccin kandidaten 2 , 3 , 4 . Het glycoproteïne Bm86 is gelokaliseerd op het oppervlak van bosluiscellen en veroorzaakt een beschermende immuunrespons tegen de veekenteken ( R. microplus ) bij gevaccineerde vee. Anti-Bm86 IgG's die worden geproduceerd door de geïmmuniseerde gastheer worden ingehaald door de tik, herken dit antigeen op het oppervlak van tikgutcellen, en versteur vervolgens de tikweefselfunctie en integriteit. Vaccins op basis van Bm86 antigenen hebben effectieve controle van R. microplus en Rhipicephalus annulatus getoond , door het aantal, gewicht en voortplantingscapaciteit van ingewikkelde vrouwtjes te verminderen, wat resulteert in een verminderde larve-besmetting in daaropvolgende tikgeneraties 4 . Bm86-gebaseerde vaccins zijn echter niet effectief tegen alle tikstadia en hebbenHeeft onbevredigende effectiviteit aangetoond tegen sommige geografische stammen van R. microplus , waardoor de rundvlees- en zuivelindustrie deze vaccins 2 , 4 slecht heeft aangenomen.
Het vermogen om epitheelcellen uit de tikgut te isoleren is een belangrijke innovatie die de voortgang van het onderzoek mogelijk maakt om eiwitmembraansamenstelling te bepalen, waaronder morfologie en fysiologie onder verschillende omgevingsomstandigheden. De hier beschreven werkwijze maakt gebruik van het chelaatmiddel ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en het reductiemiddel tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) om het epithelium uit zijn subepitheelondersteunende weefsels 10 te ontlasten. Het epithelium wordt hersteld na mechanische verstoring van de weefsels door schudden, gevolgd door discontinuous gradient centrifugatie in Percoll. Dit papier beschrijft een haalbare en nieuwe techniek voor het isoleren van tikgut epiTheliale cellen. Biotinyleerde celoppervlakte-eiwitten, geïsoleerd uit het oppervlak van deze epitheliale cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in downstream toepassingen, zoals FACS en / of LC-MS / MS-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissectie van de Gut Epithelium van R. microplus
- Verzamel semi-engorged bosluizen van vee op de dag van het experiment. Dissect fluitjes binnen 24 uur na verwijdering van de gastheer.
- Houd een strip tape vast aan de bodem van de 92 mm x 16 mm Petri-schotel. Voeg een druppel superlijm aan de band toe. Plaats de vinkje, de ventrale zijde van de superlijm, laat het gedurende 2 minuten drogen.
- Giet 100 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in de petrischaal, of tot de vinkje helemaal ondergedompeld is.
- Gebruik een maat 11 scalpel, snijd van de bovenkant van de ogen naar de bodemfeestjes, aan weerszijden van de tik.
- Verwijder met behulp van steriele tang de scutum en alloscutum volledig om de inwendige organen bloot te stellen.
- Verwijder de fijne witte draadachtige organen (trachea) en andere membranen om vervuiling te voorkomen.
- Verwijder de darm met behulp van pincet, door het bovenste gebied te knijpen en te trekken van dekarkas. Verwijder eventuele resterende darmweefsels, zodat er geen andere weefsels zijn gescheiden.
- Bewaar de darm in ijskoude Hank's Gebalanceerde Zoutoplossing (HBSS) zonder calciumchloride en magnesiumsulfaat met proteïne-inhibitorcocktail (PIC). Vries de darm in droogijs en houd deze bij -20 ° C op.
Opmerking: Om te helpen bij de darmdissectie en de details van de inwendige organen, raadpleeg hoofdstuk 3.1 van D. Sonenshine, "Biology of Ticks" 19 .
2. Epitheliale celdissociatie
- Giet de gedissende darm op een 70 μm celzeef in een 50 ml buis.
- Spoel het darmweefsel met 50 ml ijskoude HBSS met PIC tot de oplossing helder loopt, en de darm neemt een witte / heldere uitstraling op.
- Rein suspenderen in 30 ml ijskoude HBSS met PIC, meng zachtjes en centrifugeer bij 500 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten om de darm te pelletiseren. Verwijder de supernatant en herhaal het wasproces drie keer.
- Filter de suspensie door een 250 μm celsilinder, vortex de doorstroming en filter door een 70 μm celsilinder die de resterende doorstroming verzamelt.
- Centrifugeer de suspensie bij 500 xg bij 4 ° C gedurende 20 minuten om de enkele cellen te pelletiseren.
3. Isolatie van enkele epitheelcellen met behulp van een dichtheidscentrifugatiegradiënt
- Bereid de dichtheidscentrifugatiegradiënt ( bijv . Percoll) door door een AP15 voorfilterpapier te filteren. Bereid 40% en 20% Percoll in MqH 2 0 (v / v) en afkoel 1 uur voor 4 uur bij 4 ° C voordat het gradiënt wordt gelegd.
- Gebruik van een peristalticumPomp ingesteld op de laagste snelheid, laag 3 ml 40% dichtheidscentrifugatiegradiënt in een 16 ml ultracentrifugebuis, waardoor het gedurende 15 minuten op ijs kan liggen. Snelheid van de pomp moet leiden tot een <1 mL per min flow rate.
- Gebruik de peristaltische pomp om de buis naar een hoek van 45 ° te kantelen om de 20% dichtheidscentrifugatiegradiënt op de 40% laag te laten lagen. Snelheid van de pomp moet leiden tot <1 mL per min flow rate. Laat de lagen gedurende 15 minuten op ijs zetten.
- Gebruik de peristaltische pomp bij <1 ml per minuut stromingssnelheid naar laag 3 ml DMEM-medium dat tikgootcellen bevat over de 20-40% dichtheidscentrifugatiegradiënt.
- Programmeer de centrifuge voor maximale versnelling en minimale vertraging. Centrifuge bij 600 xg gedurende 10 minuten. Verzamel tussenfasen tussen de DMEM: 20% dichtheidscentrifugatiegradiënt en de 20%: 40% dichtheidscentrifugatiegradiënten om epitheliale enkele cellen te isoleren. Bewaar verzamelde interfasen bij 4 ° C voor latere analyses.
4. Beoordeling van celisolatie
- hemacytometer
- Maak de hemacytometer glijbaan schoon met alcohol.
- Schakel de cellen op door de cellen op en neer zachtjes te pipetteren. Pipette 100 μL van de cel suspensie en plaats in een 1,5 ml microcentrifuge buis.
- Voeg 400 μl 0,4% Trypan Blue toe. Meng het voorzichtig door de buis te flikkeren.
- Pipet 100 μL van de Trypan Blue-behandelde cel suspensie om beide kamers van de hemocytometer langzaam te vullen.
- Plaats de hemocytometer onder een lichtmicroscoop, met de nadruk op de roosterlijnen van de hemocytometer met een 10X-doelstelling.
- Met behulp van een handtekeningsteller tellen u de levende niet-gestippelde cellen in een set van 16 vierkanten. Tabel de blauwe dode cellen in hetzelfde vierkant. Ga door met tellen tot vier sets van 16 vierkanten worden geteld.
- Bereken de totale cellen per ml met behulp van de formule:
47eq1.jpg "/> - Bereken het percentage levensvatbaarheid van de cel door de formule te gebruiken:
- Cellisolatie Visualisatie
- Verdun 1 μl van de geïsoleerde cellen in 9 μl HBSS in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Flip de microcentrifugebuis voorzichtig om te mengen.
- Pipetteer 5 μL geïsoleerde cellen in HBSS in het midden van een glazen glijbaan. Breng drie druppels monteringsmedium aan met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI).
- Incubeer de dia bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Plaats voorzichtig een deklaag over het preparaat, vermijd luchtbellen.
- Visualiseer cellen gemarkeerd met DAPI bij excitatie 360 nm en emissie bij 460 nm onder een fluorescerende microscoop.
5. Biotinylatie van de celoppervlakteproteïne
- Biotinylaat 100 μL epitheelcellen met een cel met behulp van Biotin (Type A) ConjugatieKit, bij een molverhouding van 1: 1 oppervlakte-eiwit om te conjugeren, volgens de instructies van de fabrikant
- Voor cellysis, voeg 100 μl PBS, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 100 μM geoxideerde glutathion en PIC aan de biotinyleerde cellen toe. Incubeer op ijs gedurende 1 uur met zacht mengend elke 10 minuten.
- Centrifugeer de biotinyleerde cellen bij 20.000 xg bij 4 ° C gedurende 20 minuten om onoplosbaar materiaal te pelletiseren. Verzamel de supernatant die cytoplasmatische, en biotinyleerde membraaneiwitten bevat.
- Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test.
6. Isolatie van Biotinyleerde Oppervlakte Proteïnen
- Voeg 50 μL Streptavidin Magnetische Kralen in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Plaats de buis in een magnetische stand, waarbij de kralen tegen de zijde van de buis worden verzameld. Verwijder en wis de supernatant.
- Voeg 1000 μl TBS, 0,1% Tween-20 aan de buis toe. Meng het voorzichtig en verzamel de kralen met de magnetische stand. Verwijder en wis de supernatant.
- Combineer 40 μg biotinyleerde celoppervlakte-eiwitten, verdund tot 300 μl in 1x PBS met gewassen magnetische kralen. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder roeren.
- Verzamel de kralen met een magnetische stand, verwijder en wis de supernatant.
- Voeg 300 μL TBS, 0,1% Tween-20 aan de buis toe, meng zachtjes om de kralen opnieuw op te schudden. Verzamel kralen, verwijder en verwijder de supernatant. Herhaal deze wasstap twee keer.
- Voeg 100 μl van de 0,1 M glycine pH 2,0 aan de magnetische kralen toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verzamel kralen en verwijder supernatant die geëlueerde biotinyleerde oppervlakte-eiwitten bevat.
- Visualiseer geïsoleerde oppervlak eiwitten op een 4-20% Tris-MOPS SDS-PAGE gel.
7. Beoordeling van biotinylated oppervlakteproteïne
- Dot Blot
- Knip een 7 cm x 3 cm strip nitrocellulose membraan.
- Breng 10 μg totaal tick tick aanT inhoud (vanaf 1.8 hierboven) en 10 μg biotinylated oppervlakte-eiwit aan het membraan. Laat drogen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Overbrengen naar een container en onderdompelen in 100 ml blokkerende buffer. Incubeer bij kamertemperatuur onder roeren gedurende een uur. Wis blokkerende buffer weg.
- Was nitrocellulosemembraan in 100 μL PBS, 0,05% Tween-20 gedurende 5 minuten met roeren. Gooi de wasbuffer weg en herhaal de was driemaal.
- Incubeer in 1/5000 Streptavidine-Peperwortelperoxidase (HRP) in 100 μL PBS, 0,05% Tween-20 gedurende 2 uur onder roeren bij kamertemperatuur en wis eventuele resterende oplossing.
- Was nitrocellulosemembraan in 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 gedurende 5 minuten met roeren. Gooi de wasbuffer weg en herhaal de was driemaal.
- Ontleed 1 tablet 4-chloor-1-nafthol in 10 ml ijskoude methanol voor detectie. Voeg 4 ml methanol voorraad toe aan 20 ml TBS. Voeg 10 μL vers 30% waterstofperoxide en immedia toeToepasselijk op nitrocellulose membraan.
- Incubeer met roering bij kamertemperatuur tot het substraat een onoplosbaar blauw eindproduct produceert. Dit kan tussen 2-15 minuten duren.
- Gooi detectieoplossing en was het membraan driemaal in 100 pl MQH 2 O.
- ELISA-analyse
- Verdun 200 ng van elk monster met 400 μl 100 mM carbonaatcoatingbuffer en laag 2 lanen van de eerste rij (A #) van de ELISA-plaat (platte boorputjes)
- Voeg 100 μl 100 mM carbonaat coating buffer toe aan alle andere corresponderende putten in rijen (BH).
- Bereid de seriële verdunningen van elk monster door 100 μL van elke put in rij A te pipetteren en over te zetten in rij B. Meng zachtjes door pipetten en vermijd bellen produceren. Herhaal de verdunningen onder elke rij, waarbij de laatste 100 μL van elke put in rij H. wordt verwijderd.
- Bedek de plaat met parafilm en incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Was de platE met 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 per putje drie keer.
- Voeg 200 μL blokkerende buffer toe aan de gecoate putten, bedek met Parafilm en incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Verdun 1 / 15.000 Streptavidine-HRP in blokkerende buffer en voeg 100 μL toe aan elke putje van de plaat. Bedek met parafilm en incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Was de plaat vijf keer in 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 per putje.
- Om op te sporen, voeg 100 μL TMB-reagens per put toe. Na voldoende kleurontwikkeling, meestal tussen 10-15 minuten, voeg 100 μL 1 M fosforzuur toe om de reactie te stoppen.
- Lees de absorptie van elke bron bij λ = 450 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Epitheelcellen werden geïsoleerd uit de darmweefsels van R. microplus volgens de schematische voorstelling in Figuur 1 . Representatieve fluorescentiemicroscopiebeelden van epitheelcellen van tikgut, bereid met gebruikmaking van dit protocol, worden getoond in Figuur 2A En 2B. Aangezien de celisolatie wordt uitgevoerd op halfgegraveerde R. microplus, verschijnen cellen als enkelvoudige, bolvormige, gladde oppervlakmorfologie en een consistente grootte door het monster. Verschillen in de grootte en het type van de darmcellenpopulaties zijn duidelijker wanneer de tik oploopt om volwassen volwassenen te worden.
Fluorescerende kleuring van de kern van geïsoleerde epitheelcellen met DAPI helpt de cellen te visualiseren. Slechte isolaties worden gevisualiseerd om onvolledige dissociatie van epith te bevattenEliale cellen met verschillende celpopulaties geïdentificeerd door middel van de wisselende celgroottes en morfologieën ( Figuur 2C en 2D )
Met behulp van dit protocol werden ongeveer 1,2 x 10 7 cel per / ml van 50 tikkendarmdissecties, met 75-80% levensvatbaarheid, succesvol geïsoleerd uit R. microplus tikgut. Kruisverontreiniging van gastheerproteïnen ( Figuur 3A ) kan worden geminimaliseerd door de tikgoten adequaat te spoelen tot ze een witte uitstraling hebben die resulteert in een witte / heldere Percollgradiënt ( Figuur 3B ).
Oppervlakte gebonden eiwitten werden geïsoleerd door biotinylering van oppervlak gebonden proteïnen, vernietiging van cellulaire membranen en de zuivering van biotinyleerde oppervlak eiwitten met magnetische streptavidine kralen. In totaal 20-24 μg gezuiverd biotinyGelegeerde oppervlakteproteïnen kunnen worden geïsoleerde voor downstream toepassingen van een initiële dissectie van 50x tikgoten met gebruikmaking van dit protocol. Vergelijking van eiwitten door SDS-PAGE ( Figuur 4A ), Zilvervlek ( Figuur 4B ), Dot blot ( Figuur 5 ) en ELISA ( Figuur 6 ) geven aan dat de beschreven methodologie succesvol gezuiverde biotinyleerde oppervlakte-eiwitten uit epitheliale cellen geïsoleerd uit R. microplus tick darm.
Figuur 1 : Schematische weergave om biotinyleerde eiwitten te isoleren die aanwezig zijn in het oppervlak van de R. microplus midgutcellen. Gelieve clIk zie hier een grotere versie van deze figuur.
Figuur 2 : Fluorescentiemicroscoopvisualisatie (100x) van de R. microplus midgut epitheliale cellen gekleurd met DAPI. De software werd gebruikt om de fluorescentie overlay te voeren. A & B) vertegenwoordigen epitheliale cellen die succesvol geïsoleerd zijn van de R. microplus midgut. C / D) Epitheliale cellen geïsoleerd uit de R. microplus- darm besmet met grotere teekweefsels.
Figuur 3 : Percollgradiënt die DMEM bevat: 20% Percoll: 40% Percoll. De epitheliale cellagen werden gevormd tussen de DMEM: 20% PErcoll en de 20: 40% Percoll. ( A ) Kruipdissectie zonder voldoende wasstap. ( B ) Tick de darmdissectie met een adequate wasstap. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4 : Elektroforetische scheidingen van biotinyleerde oppervlakte-eiwitten lopen op 4-20% Tris-MOPS gel, bij 140 V gedurende 55 minuten met 10 μg monster gebruikt. (L) PageRuler Voorgekleurde proteïneladder (1) Niet-gemerkt R. microplus hele darm monster (2) Gebiotinyleerde eiwitten geëxtraheerd uit R. microplus hele darm vanaf stap 6 (3) Proteïnen uit epitheliale cellen gewonnen uit ongelabelde R. microplus gut (4 ) Biotinyleerde eiwitten geëxtraheerd uit R. microplusEpitheliale cellen zoals in stap 6. ( A ) SDS-PAGE gekleurd door Comassie blue ( B ) Silver stain.
Figuur 5 : Dot blot analyse. Streptavidine-HRP geconjugeerd verdund 1/5000. ( A ) In totaal 10 μg ruw tikgoot eiwit extract ( B ) Biotinyleerde oppervlakte eiwitten geëxtraheerd uit gezuiverde epitheelcellen (10 μg).
Figuur 6 : Beoordeling van biotinylated oppervlakte-eiwitten levensvatbaarheid gebruikmakend van ELISA. ELISA van oppervlakte-eiwitten werd ontwikkeld door Strep-HRP geconjugeerd antilichaam verdund 1 / 15.000 tegen verschillende concentraties biotinylated ticK gut eiwitten (van 0,7 ng tot 100 ng). Niet-gelabelde tikgootproteïnen en boviene serumalbumine (BSA) werden gebruikt als negatieve controle van de ELISA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Veebesmettingen zijn een belangrijk probleem voor de veeindustrie in tropische en subtropische gebieden van de wereld, met de meest voorkomende methode van controle afhankelijk van het gebruik van acariciden 1 , 4 . Bm86 werd eerder geïdentificeerd binnen het epitheelvlak van de tikgut als beschermend antigeen tegen R. microplus infestatie 10 , met beperkt succes als een vaccinestrategie door Bm86 geografische sequentievariatie en de vereiste regelmatige boosting 4 .
Vorige publicaties die zich concentreren op epitheliale isolatie methodologieën waren hoofdzakelijk gericht op gewervelde dieren of insecten soorten 9 , 11 , 12 , 13 , 14 . Bijvoorbeeld, vroege fractionering probeert om midgut te isolerenDoor middel van zoogdiertechnieken, bleek dat dezelfde methode niet op insecten kon worden toegepast door de verschillende celstructuur en organisaties 12 . Bovendien vertrouwen zoogdiertechnieken op het gebruik van ofwel dipase of collagenase, om de cel-cel-verbindingsproteïnen 9 , 13 enzymatisch te verteren. Dipase en collagenase beïnvloeden celgebonden eiwitten aanzienlijk en daarom zijn technieken die afhankelijk zijn van hun gebruik niet geschikt voor eiwitstudies op het celoppervlak 15 . Insect midgut cel isolaties richten momenteel op twee technieken. De eerste maakt gebruik van mechanische verstoring van de midgut door middel van ultrageluid, gevolgd door scheiding over een continue lineaire sukrose gradiënt 8 , 11 , 12 , 14 . Deze mechanische techniek produceert een monstername vrijwel vrij van verontreinigingen, howeVer produceert een lage opbrengst van microvillarmembranen 14 . De tweede techniek vertrouwt op de ontwrichting van membranen van Tris om microvillar membranen 8 vrij te geven .
De techniek die in dit document wordt omschreven maakt het mogelijk de isolatie van epitheelcellen, biotinylatie van oppervlakte-eiwitten en hun isolatie 16 toe te staan , waardoor verdere studies door stroomafwaartse toepassingen zoals massaspectrometrie of FACS mogelijk zijn. De hier beschreven werkwijze maakt gebruik van het chelaatmiddel EDTA en het reductiemiddel TCEP. EDTA functioneert om calciumionen te sequesteren, cadherinen te remmen, cadherine-gemedieerde cel-celverbindingen te breken terwijl TCEP de disulfidebindingen vermindert die de viscositeit van de glycanrijke mucusachtige peritrofe matrix verschaft die het darmlumen van het epithelium scheidt. Het epithelium wordt hersteld na mechanische verstoring van de weefsels door schudden, gevolgd door discontinuous gradient centrifugatie in de dichtheidY centrifugatiegradiënt. Epitheliale cellen worden geïsoleerd tussen de DMEM: 20% dichtheidscentrifugatiegradiënt en 20%: centrifugeringsgradiëntlagen met 40% dichtheid.
Gebruik van een hogere temperatuur tijdens epitheliale cel dissociatie zal ervoor zorgen dat grote weefsels dissociëren van de darm, wat leidt tot het niet-isoleren van epitheelcellen. Het verzekeren dat epitheliale cel dissociatie onmiddellijk wordt uitgevoerd na tick dissectie; Het gebruik van ijskoude buffers en het vermijden van hoge centrifugatiesnelheden is cruciaal bij het behoud van levende levensvatbare cellen. Desondanks kan de afschaffing van grotere cellen uit de basale lamina enige vervuiling veroorzaken. Bovendien verandert het midgutepitheel van het kruis dramatisch afhankelijk van de tijd van de laatste bloedmaaltijd 18 , 19 , 20 .
Als zodanig is dit protocol ontworpen en geopend op R. microplus Figuur 1 ) van een uniforme aard.
Ten slotte hebben de methoden in deze studie succesvolle geïsoleerde epitheliale cellen uit de gehele darm van R. microplus gebruikt . Proteïnen uit het oppervlak van R. microplus epitheelcellen werden verkregen voor verdere analyse en studies. Tenslotte heeft het ontwikkelde protocol de potentiële opbrengst van epitheelcellen van de tikgut aangetoond en de efficiëntie van biotinyleerde oppervlakte-eiwitten van de cel aangetoond. Het ontwikkelde protocol kan gebruikt worden in elke tiksoort van economische betekenis in een poging om tik te onderzoeken: gastheerinteracties door het membraanproteïne com te bestuderenPositie van de darm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen de Biosecurity Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fisheries, Australië) bedanken voor de levering van Rhipicephalus microplus- ticks die voor deze studie werden gebruikt, en Lucas Karbanowicz voor assistentie bij videofilms.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM Carbonate Buffer | 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6 | ||
| 16 mL centrifuge tubes with sealing cap | Thermo Scientific | 3138-0016 | Cool in ice prior to gradient |
| 250 µM cell strainer | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA | Sigma | T0440 | Stored at 4C |
| 30% Hydrogen Peroxide | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20% Tris-MOPS Gel | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol tablet | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning Blue | 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube. | |
| 70 µM cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 filter paper | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | Olympus | 2.2.1.195 | Cell imagery software |
| Duct Tape | Home Handyman | 48mm x 25mm Duct Tape | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM - ice cold for protocol |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| Forceps | Dumont | #9 Dumont - Switerzland | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol for molecular biology >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| Hand-Held Counter | Officeworks | JA0376230 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – ice cold for protocol |
| Hemacytometer | Optik Lakor | - | - |
| L-Glutathione oxidized | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| Magnetic Separation Stand | Novagen | - | 4-Tube Magnetic Separation Rack |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | Integral Water Purification System for Ultrapure Water |
| Nitrocellulose Membrane | Life Sciences | 66485 | 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane |
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| Peristaltic Pump | Masterflex | 7518-10 | |
| Phosphoric Acid | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer | Thermo-Scientific | 37573 | Stored at 4C. Blocking Buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – stored at -20 °C |
| Quick Start Bradford Dye Reagent 1x | Biorad | 500-0205 | For Bradford Assay |
| Quick Start BSA Standards | Biorad | 500-0207 | BSA standards for Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM Staining Kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue - Ultra Fast Mini | UHU | UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | Thermo Fisher | 20490 | |
| Triton X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| Vortex Mixer | Ratek | VM1 | |
| Water Bath | Grant | GD100 |
References
- Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
- De Rose, R., et al. Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).
- García-García, J. C., et al. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).
- Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play. Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).
- Kearney, S. Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , AgNote No. K58. (2013).
- Foil, L. D., et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).
- Rodriguez, M., et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).
- Rodriguez, M., et al. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).
- Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases. Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).
- Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).
- Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure. Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).
- Koefoed, B. M. A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells. Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).
- Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. Plasma membranes from insect midgut cells. An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).
- Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Stem Cells. 879, 479-490 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Karhemo, P. R., et al. An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis. J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).
- Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. Current Themes in Tropical Science Volume 1. , Pergamon Press. 201-205 (1982).
- Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. "Biology of Ticks". 1, Two, Oxford University Press. (2014).
- Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. "An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure" (English Translation). , Entomology Society of America Entomological Society of America. (1983).
