Laboratorieteknikker anvendt til at opretholde og differentiere biotyper af<em> Vibrio cholerae</em> Kliniske og miljømæssige isolater
Summary
Dette manuskript beskriver egnede Vibrio cholerae vedligeholdelsesteknikker ud over en række biokemiske analyser, der kollektivt anvendes til hurtig og pålidelig differentiering mellem klinisk og miljømæssig V. Kolerae-biotyper i en laboratorieindstilling.
Abstract
Den vandgram-negative bakterie Vibrio cholerae er det etiologiske middel af den smitsomme gastrointestinale sygdomskolera. På grund af den globale forekomst og sværhedsgrad af denne sygdom, V. Cholerae er blevet grundigt studeret i både miljø- og laboratorieindstillinger, hvilket kræver egentlig vedligeholdelses- og dyrkningsteknikker. Klassisk og El Tor er to hovedbiotyper, der komponerer V. Cholerae O1 serogruppe, der hver især viser unikke genotypiske og fænotypiske egenskaber, der tilvejebringer pålidelige mekanismer til biotype karakterisering og kræver forskellige dyrkningsbetingelser for virulens. Uanset biotype af årsagsspændingen for en given infektion eller udbrud indebærer standardbehandling af sygdommen rehydreringsterapi suppleret med et regime af antibiotika. Imidlertid kan biotypeklassificering være nødvendig for laboratorieundersøgelser og kan have bredere virkninger på det biomedicinske område.I begyndelsen af 2000 blev kliniske isolater identificeret, der udviser genotypiske og fænotypiske træk fra både klassiske og El Tor-biotyper. De nyligt identificerede hybrider, der betegnes El Tor-varianter, har forårsaget klinisk og miljømæssig isolatbiotypeidentifikation til at blive mere kompleks end tidligere traditionelle single-assayidentifikationsprotokoller. Ud over at beskrive V. Cholerae generelle vedligeholdelses- og dyrkningsteknikker beskriver dette manuskript en række genspecifikke ( ctxB og tcpA ) PCR-baserede genetiske skærmbilleder og fænotypiske analyser (polymyxin B-resistens, citratmetabolisme, proteolytisk aktivitet, hæmolytisk aktivitet, motilitet og glukosemetabolismen via Voges- Proskauer assay) kollektivt brugt til at karakterisere og / eller skelne mellem klassiske og El Tor biotyper. Sammen giver disse analyser en effektiv systematisk tilgang til at blive anvendt som et alternativ eller endvidere til dyre, arbejdskrævende eksperimenter i karakterenTion af V. Kolerae kliniske (og miljømæssige) isolater.
Introduction
Kolera er en sygdom i den distale tyndtarmen forårsaget af forbruget af forurenet mad eller vand, der indeholder den vandige Gram-negative bakterie Vibrio cholerae . Symptomer på kolera omfatter opkastning og ukontrollabel vandig diarré, hvilket fører til alvorlig dehydrering, som hvis den ikke behandles ordentligt, vil resultere i døden. V. Cholerae kan opdeles i over 200 serogrupper baseret på strukturen af celleoverflade-lipopolysaccharid-O-antigenet. Imidlertid har kun 2 serogrupper, O1 og O139, vist epidemi eller pandemisk potentiale 1 , 2 . Desuden er serogruppe O139 primært isoleret til Sydøstasien 3 , 4 , mens serogruppe O1 er distribueret over hele verden. Desuden kan O1 serogruppen opdeles i 2 hovedbiotyper: klassisk og El Tor. Den klassiske biotype var ansvarlig for de første 6 kolera pandæmierS mellem 1817 og 1923. Den igangværende syvende pandemi er et resultat af El Tor-biotypen, som globalt har fordrevet den klassiske biotype i miljøet 5 , 6 , 7 . For nylig er der opstået stammer, som indeholder kendetegnende karakteristika for både klassiske og El Tor-biotyper 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 og er siden blevet betegnet El Tor-varianter 13 , 17 . Nogle El Tor varianter har vist forhøjede virulence evner med hurtigere og alvorlig sygdomsprogression end tidligere observeret og understregerBehovet for en mere omfattende tilgang til agentidentifikation og sygdomsforebyggelse og behandling 8 , 9 , 18 . Selvom biotypeidentifikation ikke umiddelbart diker behandling, kan yderligere fremskridt inden for vaccineudvikling og fremtidige terapeutiske midler drage fordel af biotypeforskel.
Den første serie af protokoller, der er angivet her, vil gøre det muligt for efterforskerne at opretholde V korrekt. Koleraestammer i en laboratorieindstilling. Konsistens og efterfølgende analyse kræver lagerforberedelse og vækst af isolater, som ikke er biotypeafhængige. For at optimere inducerende virulensgenekspression er der imidlertid behov for uafhængige biotype-specifikke dyrkningsteknikker 19 . Derudover er forberedelse til forskellige genetiske og biokemiske analyser skitseret i dette manuskript.
Kollatoksin (CT) og toksin co-reGuleret pilus (TCP) er to hovedvirulensfaktorer styret af master regulator ToxT i begge biotyper af V. Cholerae O1 serogruppe 20 . CT er et todelt toksin bestående af fem CtxB Underenheder omkring en enkelt CtxA underenhed, og er ansvarlig for det hurtige elektrolyttab forbundet med kolera. TCP er en type IV pilus kodet af tcp operonen ( tcpABQCRDSTEF ), og er involveret i vedhæftning og kolonisering af den distale tyndtarmen. TcpA er det første gen af tcp operonen, som koder for de enkelte pilinunderenheder, der er afgørende for opbygningen af pilus 8 . Gensekvensen for ctxA er helt konserveret mellem klassiske og El Tor-biotyper, medens ctxB og tcpA adskiller sig over de to biotyper, men bevares inden for hver biotype 8 . CtxB er fuldstændigt konserveret mellem biotyper undtagen ved to basisposi(115 og 203). I El Tor-biotypen ligger thym i basepositioner 115 og 203, mens den klassiske biotype indeholder cytosin ved disse baser. TcpA er helt konserveret inden for hver biotype, men adskiller sig ved flere baser mellem biotyper. Disse genetiske skelner tjener som primære biotypeidentifikationsmarkører, og efter sekventering af polymerasekædereaktionsprodukt (PCR) amplifikationsprodukt, der indbefatter disse steder, kan isolationssekvenser sammenlignes med vildtype (WT) klassisk O395 eller WT El Tor N16961 for at bestemme biotype baggrunden Af henholdsvis CT og TCP i et givet V. cholerae- isolat.
Talrige protokoller er blevet udviklet til at karakterisere de fænotypiske sondringer mellem de klassiske og El Tor biotyper 21 , 22 , 23 . Polymyxin B er et peptidantibiotikum, der kompromitterer integriteten af den ydre cellemembran i gram-negativ bacTeria og polymyxin B-resistens kan visualiseres gennem polymyxin B-resistensassayet 21 . Citrat er et primært substrat af Krebs cyklus, og evnen til at metabolisere citrat som en eneste carbonkilde kan bestemmes ved anvendelse af citratmetabolismassayet 22 . HapR koder for en global regulator og master quorum-sensing regulator i V. cholerae, HapR, der binder til forskellige promotor regioner og regulerer gen og operon udtryk 24 . Nogle patogene stammer af V. cholerae har en naturligt forekommende rammeforskydningsmutation i hapR- genet, som har forårsaget denne tæthedafhængige regulering af virulensgenekspression at gå tabt 24 , 25 . Måling af HapR-reguleret proteaseaktivitet ved anvendelse af mælkeagarmedier gør det muligt for forskeren at identificere, om et bestemt isolat indeholder en funktionel HapR 23 . DetHæmolyse assay tests for en stamme evne til at udskille hæmolytiske enzymer, der lyser røde blodlegemer; Graden af hæmolyse kan visualiseres på blodagarpladerne 23 . Motilitet er ofte forbundet med virulens i V. cholerae og kan analyseres ved anvendelse af motilitetsagarplader 23 . Voges-Proskauer-analysen tester for en stamme evne til at fermentere glucose som en eneste carbonkilde og producere biproduktet acetoin 21 . Med fremkomsten af El Tor-varianter er det vanskeligt at forudsige resultaterne af et givet fænotypisk assay uden omfattende genotypisk screening og før afledning af biotype-baggrunden af V. Cholerae-isolater, anbefales det at udføre denne samling af analyser 23 og sammenligne resultaterne med referencestammer som i tabel 2 .
Her har vi avanceret en række protokoller, der kollektivt udnytter aforemetNtioned genotypiske og fænotypiske analyser for en mere omfattende tilgang til karakterisering af V. Cholerae biotyper. Desuden har vi beskrevet de genotypiske og fænotypiske sondringer af kendt V. Cholerae El Tor-varianter (MQ1795 og BAA-2163) i sammenligning med almindeligt anvendte biotype-referencestammer (WT klassisk O395, WT El Tor C6706 og WT El Tor N16961; Tabel 1 ). Fremkomsten af El Tor-varianter har fremlagt udfordringer for pålideligheden af tidligere anvendte enkeltassaybiotype karakteriseringsprotokoller; Dette multiple assay identifikationssystem vil dog muliggøre mere pålidelig karakterisering af klinisk og miljømæssig V. Kolerae isolater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Af de over 200 identificerede V. Kolerae serogrupper, kun O1 og O139 har epidemisk potentiale. O1 serogruppen kan opdeles i to biotyper: klassisk og El Tor. Imidlertid er hybridstammer, betegnet El Tor-varianter 13 , 17 , fremkommet, der besidder El Tor-biotype-baggrunden, og har klassiske karakteristika 8 , 9 , 10 , 11 ,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning understøttet af New Hampshire-INBRE gennem en institutionel udviklingspris (IDeA), P20GM103506, fra National Institute of General Medical Sciences of the NIH.
Materials
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
| 60% Glycerol | Calbiochem | 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade—CAS-56-81-5—Calbiochem,EMD_BIO-356352 |
| Agar | Becto, Dickinson and Co. | 214030 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agar with brain-heart infusion | Becto, Dickinson and Co. | 237500 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agarose | Peqlab | 732-2789 | https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+ |
| Anhydrous K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID |
| Blood Agar Plates | Remel | R01200 | Store at 4 °C; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID |
| Bromothymol Blue | Fisher Scientific | B388-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID |
| Cirtric acid ·H2O | Fisher Scientific | S72836-3 | https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363 |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit | New England Biolabs | N0446S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID |
| DNA Clean & Concentrator™ -25 Kit | Zymo Research | D4007 | http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit |
| GelGreen Nucleic Acid Stain | Biotium | 41005 | https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10000x-in-water/ |
| Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-208100 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100 |
| Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit | Qiagen | 158567 | https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation |
| HCl | Fisher Scientific | A144-212 | Corrosive; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID |
| KOH | Fisher Scientific | P250-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID |
| Le Loop | Decon Labs Inc. | MP190-25 | http://deconlabs.com/products/leloop/ |
| Le Stab | Decon Labs Inc. | MP186-5 | http://deconlabs.com/products/lestab/ |
| MgSO4·7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio Rad Labs | 1704406 | http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373 |
| MR-VP Broth | Difco | 216300 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID |
| NaNH4HPO4·4H2O | Fisher Scientific | S218-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID |
| NanoDrop Lite Spectrophtometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR |
| Nonfat dry milk | Nestle Carnation | N/A | N/A |
| Peptone | Becto, Dickinson and Co. | 211677 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Petri Dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712 |
| Petri Dishes (150 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875714 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID |
| Polymyxin B sulfate salt | Sigma-Aldrich | P1004-10MU | Store at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| Taq Reaction Buffer | New England Biolabs | M0273S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch™ | Bio Rad Labs | 1840148 | http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME |
| Triphenyltetrazolium chloride | Alfa Aesar | A10870 | https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/ |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID |
| Tris∙HCl | Calbiochem | 9310 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/OmniPur-TRIS-Hydrochloride—CAS-1185-53-1—Calbiochem,EMD_BIO-9310-OP |
| Tryptone | Becto, Dickinson and Co. | 211705 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Yeast Extract | Becto, Dickinson and Co. | 212750 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| α-napthol | MP Biomedicals | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |
References
- Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
- Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups. Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).
- Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).
- Albert, M. J., et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal. Lancet. 342 (8868), 387 (1993).
- Barua, D., Barua, D., Greenough III, W. B. History of Cholera. Cholera. , 1-36 (1992).
- Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A., Faruque, S. M., Nair, G. B. Population Genetics of Vibrio cholerae. Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. , 29-47 (2008).
- Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).
- Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).
- Ghosh-Banerjee, J., et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).
- Ansaruzzaman, M., et al. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).
- Ansaruzzaman, M., et al. Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique. Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).
- Lan, R., Reeves, P. R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).
- Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).
- Nair, G. B., et al. Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).
- Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y., Faruque, S. M., Nair, G. B. Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1. Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. , 179-190 (2008).
- Safa, A., et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).
- Nusrin, S., et al. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic. J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).
- Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate. mSphere. 1 (5), e00253 (2016).
- Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).
- DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).
- Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).
- Vogel, H. J., Bonner, D. M. Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).
- Son, M. S., Taylor, R. K. Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor. Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).
- Kovacikova, G., Skorupski, K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).
- Wang, Y., et al. The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains. Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae. Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).
