Summary

Лабораторные методы, используемые для поддержания и дифференциации биотипов<em> Vibrio cholerae</em> Клинические и экологические изоляты

Published: May 30, 2017
doi:

Summary

В этой рукописи описываются правильные методы обслуживания Vibrio cholerae в дополнение к серии биохимических анализов, которые в совокупности используются для быстрой и надежной дифференциации между клиническим и экологическим V. Биотипы холеры в лабораторных условиях.

Abstract

Водная грамотрицательная бактерия Vibrio cholerae является этиологическим агентом холеры инфекционных желудочно-кишечных заболеваний. Из-за глобальной распространенности и тяжести этого заболевания, V. Cholerae широко изучается как в окружающей среде, так и в лабораторных условиях, требуя надлежащего обслуживания и методов культивирования. Классический и El Tor – два основных биотипа, которые составляют V. Cholerae O1, каждая из которых демонстрирует уникальные генотипические и фенотипические характеристики, которые обеспечивают надежные механизмы биотипической характеристики и требуют различной вирулентности, вызывающей условия культивирования. Независимо от биотипа причинного штамма для любой данной инфекции или вспышки, стандартное лечение заболевания включает в себя регидратационную терапию, дополненную режимом антибиотиков. Однако классификация биотипов может потребоваться для лабораторных исследований и может иметь более широкие последствия в биомедицинской области.В начале 2000-х годов были идентифицированы клинические изоляты, которые проявляют генотипические и фенотипические признаки как от классических, так и от биотипов El Tor. Недавно идентифицированные гибриды, называемые вариантами El Tor, вызвали идентификацию биотипа клинической и экологической изоляции, чтобы стать более сложными, чем предыдущие традиционные протоколы идентификации одного теста. В дополнение к описанию V. Холеры общего обслуживания и методов культивирования, эта рукопись описывает серию генетических экранов на основе гена ( ctxB и tcpA ) на основе ПЦР и фенотипические анализы (устойчивость к полимиксину B, метаболизм цитрата, протеолитическая активность, гемолитическая активность, подвижность и метаболизм глюкозы через Voges- Proskauer assay), все вместе используемые для характеристики и / или различия между классическими и El Tor биотипами. Вместе эти анализы обеспечивают эффективный систематический подход, который будет использоваться в качестве альтернативы или, кроме того, для дорогостоящих трудоемких экспериментов в характеристикеV. Холеры клинических (и экологических) изолятов.

Introduction

Холера – это заболевание дистального тонкого кишечника, вызванное потреблением загрязненной пищи или воды, содержащей водную грамотрицательную бактерию Vibrio cholerae . Симптомы холеры включают рвоту и неконтролируемую водянистую диарею, что приводит к серьезному обезвоживанию, которое, если его не лечить должным образом, приведет к смерти. V. Холеру можно разделить на более чем 200 серогрупп, основанных на структуре O-антигена липополисахарида клеточной поверхности. Однако только 2 серогруппы O1 и O139 продемонстрировали эпидемический или пандемический потенциал 1 , 2 . Более того, серогруппа O139 была в основном изолирована от Юго-Восточной Азии 3 , 4 , а серогруппа O1 распределена во всем мире. Кроме того, серогруппу O1 можно разделить на 2 основных биотипа: классический и El Tor. Классический биотип отвечал за первые 6 пандемий холерыС 1817 по 1923 год. Продолжающаяся седьмая пандемия является результатом биотипа Эль-Тор, который во всем мире смещает классический биотип в окружающую среду 5 , 6 , 7 . Недавно возникли штаммы, которые содержат отличительные характеристики как классических, так и биотипов El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 и с тех пор назывались вариантами El Tor 13 , 17 . Некоторые варианты El Tor продемонстрировали повышенную способность вирулентности с более быстрым и тяжелым прогрессированием заболевания, чем ранее наблюдалось, подчеркиваяНеобходимость более комплексного подхода к идентификации агентов и профилактике и лечению болезней 8 , 9 , 18 . Хотя идентификация биотипа не сразу диктует лечение, дальнейшие улучшения в развитии вакцины и будущих терапевтических агентах могут выиграть от различия биотипов.

Первая серия протоколов, перечисленных здесь, позволит исследователям правильно поддерживать V. Штаммов холеры в лабораторных условиях. Последовательность и последующий анализ требуют подготовки запасов и роста изолятов, которые не зависят от биотипа. Однако для оптимального индуцирования экспрессии генов вирулентности необходимы независимые биотипические методы культивирования 19 . Кроме того, в этой рукописи изложена подготовка к различным генетическим и биохимическим анализам.

Толерант холеры (КТ) и токсин co-reGulated pilus (TCP) – два основных фактора вирулентности, контролируемых главным регулятором ToxT в обоих биотипах V. Cholerae O1 серогруппа 20 . CT – двудольный токсин, состоящий из пяти CtxB Субъединиц, окружающих одну субъединицу CtxA, и отвечает за быструю потерю электролита, связанную с холерой. TCP является типом IV пилота, закодированным операндом tcp ( tcpABQCRDSTEF ), и участвует в прикреплении и колонизации дистального тонкого кишечника. TcpA является первым геном оперона tcp , который кодирует отдельные субъединицы пилина, необходимые для построения пилюса 8 . Последовательность генов для ctxA полностью сохраняется между классическими и биотипами El Tor, тогда как ctxB и tcpA различаются по двум биотипам, но сохраняются в каждом биотипе 8 . CtxB полностью сохраняется между биотипами, за исключением двух базовых позиций(115 и 203). В биотипе El Tor тимин находится в базовых положениях 115 и 203, тогда как классический биотип содержит цитозин на этих основаниях. TcpA полностью сохраняется в каждом биотипе, но отличается на нескольких основаниях между биотипами. Эти генетические различия служат в качестве первичных идентификационных маркеров биотипа, и после секвенирования продукта амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающего эти сайты, изолятные последовательности можно сравнить с классическим классическим O395 дикого типа (WT) или WT El Tor N16961 для определения фона биотипа CT и TCP, соответственно, в данном изоляте V. cholerae .

Разработаны многочисленные протоколы для описания фенотипических различий между классическими и биотипами El Tor 21 , 22 , 23 . Полимиксин В представляет собой пептидный антибиотик, который ставит под угрозу целостность наружной клеточной мембраны в грамотрицательном бакеТерия и полимиксина В можно визуализировать с помощью анализа резистентности к полимиксину В 21 . Цитрат является основным субстратом цикла Креба, и способность метаболизировать цитрат в качестве единственного источника углерода может быть определена с использованием анализа метаболизма цитрата 22 . HapR кодирует глобальный регулятор и главный регулятор кворума в V cholerae, HapR, который связывается с различными областями промотора и регулирует экспрессию гена и оперона 24 . Некоторые патогенные штаммы V. cholerae имеют естественную мутацию смены кадров в гене hapR , что привело к потере этой зависимой от плотности регуляции экспрессии гена вирулентности 24 , 25 . Измерение активности протеазы, регулируемой HapR, с использованием молочных агаровых сред позволяет исследователю определить, содержит ли конкретный изолят функциональный HapR 23 .Анализы гемолиза для определения способности штамма выделять гемолитические ферменты, которые лизят эритроциты; Степень гемолиза может быть визуализирована на пластинах 23 агара. Подвижность часто ассоциируется с вирулентностью у V. cholerae и может быть проанализирована с использованием пластинчатых агаровых пластин 23 . Анализ Voges-Proskauer проверяет способность штамма ферментировать глюкозу в качестве единственного источника углерода и продуцировать ацетоин побочного продукта 21 . С появлением вариантов El Tor трудно предсказать результаты любого данного фенотипического анализа без обширного генотипического скрининга и до выведения биотипического фона V. Холеры, рекомендуется выполнить эту сборку анализов 23 и сравнить результаты с ссылочными штаммами, как в таблице 2 .

В этой связи мы разработали ряд протоколов, совместно использующих aforemeГенотипических и фенотипических анализов для более полного подхода к характеристике V. Холерные биотипы. Кроме того, мы описали генотипические и фенотипические различия известных V. Cholerae El Tor (MQ1795 и BAA-2163) по сравнению с обычно используемыми ссылочными штаммами биотипов (классический WT классический O395, WT El Tor C6706 и WT El Tor N16961, таблица 1 ). Появление вариантов El Tor показало проблемы надежности ранее использованных протоколов характеризации биотипа одного анализа; Однако эта система идентификации с множественным анализом позволит обеспечить более надежную характеристику клинического и экологического V. Изолятов холеры .

Protocol

Примечание: соображения времени для каждого анализа должны быть сделаны, поскольку отдельные медийные препараты требуют разного времени. Например, твердые агаровые пластины должны быть достаточно охлаждены и сушатся (1-2 дня). Дополнительные соображения времени ( то есть рост куль…

Representative Results

Для правильного обслуживания и использования любого бактериального штамма рекомендуется знать время удвоения напряжения (-ов), которое представляет интерес. Здесь различные темпы роста обычно используемых V. Штаммы холеры были продемонстрированы с помощью…

Discussion

Из более чем 200 идентифицированных V. Холерные серогруппы, только O1 и O139 имеют эпидемический потенциал. Серогруппу O1 можно разделить на два биотипа: классический и El Tor. Однако появились гибридные штаммы, названные вариантами El Tor 13 , 17 , которые обладаю…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследования, поддержанные New Hampshire-INBRE через премию за институциональное развитие (IDeA), P20GM103506, из Национального института общих медицинских наук NIH.

Materials

1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder
60% Glycerol Calbiochem 356352 http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade—CAS-56-81-5—Calbiochem,EMD_BIO-356352
Agar Becto, Dickinson and Co. 214030 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch
Agar with brain-heart infusion Becto, Dickinson and Co. 237500 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch
Agarose Peqlab 732-2789 https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+&currentLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+
Anhydrous K2HPO4 Fisher Scientific P288-500 https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID
Blood Agar Plates Remel R01200 Store at 4 °C;  http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar
Boric Acid Fisher Scientific A73-500 https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID
Bromothymol Blue Fisher Scientific B388-10 https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID
Cirtric acid ·H2O Fisher Scientific S72836-3 https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit New England Biolabs N0446S Store at -20 °C;  https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset
Disodium EDTA Fisher Scientific S311-500 https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID
DNA Clean & Concentrator™ -25 Kit Zymo Research D4007 http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit
GelGreen Nucleic Acid Stain Biotium 41005 https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10000x-in-water/
Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer Thermo Scientific 840-208100 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100
Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit Qiagen 158567 https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation
HCl Fisher Scientific A144-212 Corrosive;  https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID
KCl Fisher Scientific P217-500 https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500 https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID
KOH Fisher Scientific P250-500 https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID
Le Loop Decon Labs Inc. MP190-25 http://deconlabs.com/products/leloop/
Le Stab Decon Labs Inc. MP186-5 http://deconlabs.com/products/lestab/
MgSO4·7H2O Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System Bio Rad Labs 1704406 http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373
MR-VP Broth Difco 216300 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch
Na2HPO4 Fisher Scientific S374-500 https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID
NaCl Fisher Scientific S271-10 https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID
NaHCO3 Fisher Scientific S233-500 https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID
NaNH4HPO4·4H2O Fisher Scientific S218-500 https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID
NanoDrop Lite Spectrophtometer Thermo Scientific ND-LITE-PR https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR
Nonfat dry milk Nestle Carnation N/A N/A
Peptone Becto, Dickinson and Co. 211677 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch
Petri Dishes (100 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712
Petri Dishes (150 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875714 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID
Polymyxin B sulfate salt Sigma-Aldrich P1004-10MU Store at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&region=US
Taq DNA Polymerase New England Biolabs M0273S Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Taq Reaction Buffer New England Biolabs M0273S Store at -20 °C;  https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch™  Bio Rad Labs 1840148 http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME
Triphenyltetrazolium chloride Alfa Aesar A10870 https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/
Tris Base Fisher Scientific BP152-1 https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID
Tris∙HCl Calbiochem 9310 http://www.emdmillipore.com/US/en/product/OmniPur-TRIS-Hydrochloride—CAS-1185-53-1—Calbiochem,EMD_BIO-9310-OP
Tryptone Becto, Dickinson and Co. 211705 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch
Yeast Extract Becto, Dickinson and Co. 212750 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch
α-napthol MP Biomedicals 204189 http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189

References

  1. Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
  2. Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups. Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).
  3. Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).
  4. Albert, M. J., et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal. Lancet. 342 (8868), 387 (1993).
  5. Barua, D., Barua, D., Greenough III, W. B. History of Cholera. Cholera. , 1-36 (1992).
  6. Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A., Faruque, S. M., Nair, G. B. Population Genetics of Vibrio cholerae. Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. , 29-47 (2008).
  7. Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).
  8. Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).
  9. Ghosh-Banerjee, J., et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).
  10. Ansaruzzaman, M., et al. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).
  11. Ansaruzzaman, M., et al. Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique. Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).
  12. Lan, R., Reeves, P. R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).
  13. Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).
  14. Nair, G. B., et al. Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).
  15. Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y., Faruque, S. M., Nair, G. B. Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1. Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. , 179-190 (2008).
  16. Safa, A., et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).
  17. Nusrin, S., et al. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic. J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).
  18. Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate. mSphere. 1 (5), e00253 (2016).
  19. Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).
  20. DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).
  21. Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).
  22. Vogel, H. J., Bonner, D. M. Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).
  23. Son, M. S., Taylor, R. K. Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor. Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).
  24. Kovacikova, G., Skorupski, K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).
  25. Wang, Y., et al. The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains. Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).
  26. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
  27. Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae. Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).

Play Video

Cite This Article
Brumfield, K. D., Carignan, B. M., Ray, J. N., Jumpre, P. E., Son, M. S. Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates. J. Vis. Exp. (123), e55760, doi:10.3791/55760 (2017).

View Video