Summary
Polyuretan kateter innsetting i aorta lumen og Sutur ligation av aorta indusere kronisk hypoksi på grunn av hypoperfusion av adventitial vasa vasorum. Denne artikkelen beskriver en roman dyr modell av abdominalt aortaaneurisme (AAA) med egenskaper som ligner på de av AAA hos mennesker.
Abstract
Adventitial vasa vasorum (VV) gir oksygen og næring til aorta veggen. Oksygenmangel i aorta veggen kan forårsake forstørret abdominal aorta aneurismer (AAAs). Denne artikkelen introduserer og beskriver en standardprotokoll som brukes til å indusere AAAs gjennom adventitial VV hypoperfusion laget med en kombinasjon av polyuretan kateter innsetting i aorta lumen og Sutur ligation av infrarenal abdominal aorta.
Protokollen innebærer bruk av mannlig rotter veier 300-400 g, som tilbys mat og vann ad libitum. Etter laparotomy med en ventrale midtlinjen abdominal snitt, er peeling av aorta utført, som blokkerer blodstrømmen fra perivascular vev. Aortotomy med et lite innsnitt ved nyre arterien grenene er utført, og en polyuretan kateter settes bruker en 18-gauge iboende nål. Etter reparasjon innsnitt, stramt ligation av aorta over kateter blokker VV blodet flyte fra den proksimale retningen gjennom aorta veggen uten å forstyrre aorta blodstrømmen. Denne teknikken kan indusere en AAA med progressiv aorta dilatasjon.
Den største fordelen ved denne modellen er at VV hypoperfusion fører vev hypoksi og utvikling av en infrarenal AAA, som har morfologiske og patologisk egenskaper som ligner på de av en menneskelig AAA.
Introduction
Abdominal aorta består av følgende tre lag: den indre vaskulære veggen (intima), mediale lag (media) og ytre vaskulære veggen (adventitia), og av disse, adventitia har en unik blod forsyning system kjent som vasa vasorum (VV). Aorta vev leveres med oksygen gjennom adventitial VV perfusjon og enkel oksygen diffusjon fra aorta blodet flyt1. Men geografisk har abdominal aorta minst fordelingen av VVs sammenlignet i andre deler av aorta. 2
En tidligere studie rapportert på vev oksygenmangel i menneskelig abdominalt aortaaneurisme (AAA) vegger med tykk intraluminal blodpropp (ILT)3. I tillegg har det vist seg at en adventitial VV i aneurisme vegger er okkludert arteriosklerotisk endringer på en betydelig høyere rente, som er forbundet med vev hypoksi i AAA vegger4. Basert på disse resultatene, ble en roman gnager modell av AAA opprettet ved å indusere adventitial VV hypoperfusion5. I denne modellen forårsaket VV hypoperfusion vev hypoksi og utvikling av en infrarenal AAA, som hadde morfologiske og patologisk egenskaper som ligner på de av en menneskelig AAA6. Prima eksempler var tilstedeværelsen av ILTs og akkumulering av hyperplastic adipocytter6og forårsake brudd7,8. Disse funnene er sjelden observert i forrige gnager modeller. Denne modellen kan derfor sterkt bidra til en dypere forståelse av mekanisme ansvarlig for AAA utvikling og brudd. Vi presentere og beskrive en standardprotokoll som brukes til å indusere AAAs gjennom adventitial VV hypoperfusion, og vi forklare hvordan å indusere oksygenmangel i aorta veggen med kirurgiske teknikker.
Protocol
dyr omsorg og eksperimenter ble utført i henhold til veiledning av Hamamatsu universitet skolen av medisin dyr omsorg komiteen ved Center for dyr omsorg.
1. kirurgisk prosedyre for å lage modellen
Merk: plassere de kirurgiske instrumentene i en perle sterilisere for 10 s preoperatively. Bruke sterilt hansker intraoperatively.
- Bruk hannrotter veier 300-400 g. tillate rotter tilgang til mat og vann ad libitum.
- Bedøve rotte med isoflurane innånding (2.0-3.0 mL/L). Bekreft riktig anesthetization tå knipe.
- Barbere håret på bakkroppen med en elektrisk barberhøvel, og skrubb magen med alkohol og en povidon-jod løsning.
- Sett rotta i supine posisjon på operasjonsbordet. Bruke vet salve på rotte ' s øyne å hindre tørrhet under anestesi.
- Utfører en laparotomy med en ventrale midtlinjen abdominal snitt med en saks. For å sikre en klar kirurgiske feltet, pakke abdominal innholdet i bukhulen med sterilt gasbind bruker en såret festepunkt.
- Koble aorta fra perivascular vev, forsiktig plukke opp og rive retroperitoneum med pinsett for å utsette aorta veggen og exfoliate infrarenal aorta retroperitoneal plass fra nivået på venstre nyre venen for bifurkasjonen fra den perivascular vev ( figur 1A).
- Ligate fartøyene forgrening fra abdominal aorta med en 5-0 silke streng blokk blod leverer på et punkt fra aortabuen som ikke begrense den aorta lumen.
- Blokkere aorta blodstrøm, plassere vaskulær klipp rett under nyre arterien og like over bifurkasjonen av aorta.
Merk: Størrelsen på klippene bør være større enn aorta diameteren til å blokkere blodstrøm helt. En midlertidig 5-0 silke streng ligatur er også tilstrekkelig for blokkering av blodstrøm i stedet for klippene. - Ligner på å opprette en prikk blødning på overflaten av aorta veggen, kuttet fremre aorta veggen med en mikro-saks 5 mm distally fra aorta klippet, ved siden av nyre arterien grener, sette inn et polyuretan kateter.
- Inn et polyuretan kateter (utvendig diameter 0.55 mm inne diameter 0.37 mm) bruker en 24-gauge indwelling p lav gjennom snittet å vaske bort blod i aorta med vann. Administrere en 1-mL sprøyte fylt med vann i polyuretan kateter, og vask bort gjenværende blodet i aorta med vann. Vanning, fjerne kateter fra aortabuen.
- Før du setter inn et polyuretan kateter (utvendig diameter 1,20 mm inne diameter 0.94 mm) bruker en 18-gauge iboende nål, kuttet av polyuretan kateter til 10 mm lange ( figur 1B).
- Sett inn kutt stykke av polyuretan kateter inn den aorta lumen fra snitt gjort i trinn 1.9. Fullstendig plassere 10 mm kateter i aorta lumen, og flytte midtpunktet i kateter tilsvarer plasseringen av innsnitt (dvs., dekke i snitt med kateter).
- Reparere innsnitt med avbrutt suturer med en 8-0 monofilament streng ( figur 1 c).
- Ligate abdominal aorta en kombinasjon av 5-0 silke strengen og polyuretan kateter ( figur 1 d).
Merk: Den aorta lumen kan vedlikeholdes av den indwelling kateter. Ligate aorta fast for å forhindre misaligning kateter plasseringen. Kirurgen ' s knute anbefales, fordi det legger en ekstra vri når du knytter første kast av knuten, danner en dobbel halvstikk knuten, og en ekstra tur gir mer friksjon og kan redusere løsne. - Etter hemorroider, fjerne vaskulær klippet på aorta bifurkasjonen og deretter fjerner vaskulær klippet nedenfor nyre arterien gjenopprette antegrade blodstrømmen. Bekrefte brutto aorta pulsering.
- Lukker abdominal snittet i to lag, peritoneum og andre lag, med en 4-0 polypropylen Sutur. Tett Sutur av såret for å hindre en stakk organ.
- Bruk aktuelle lidocaine abdominal innsnitt. Plass rotta på en varmeputen til bevissthet returnerer. Ikke la en rotte uovervåket før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Ikke returnerer rotte som har gjennomgått operasjonen selskapet av annet rotter før det er helt gjenopprettet.
- Monitor rotta tett etter operasjonen. Injisere bolus av sterilt saltvann (1,0 til 2,0 mL) subcutaneously hvis en rotten viser tegn på distress eller kroppen vekttap.
- Postoperatively, observere tid-retters utviklingen av utvidede aorta på en ultralyd echogram. Mål maksimale diameter fra innsiden kanten på ytterkanten av abdominal aorta beskrevet 5.
2. Høsting, fikse og Elastica-van Gieson (EVG) Beising
- tjueåtte dager postoperatively, administrere natrium pentobarbital ≥ 100 mg/kg intraperitoneally å avlive rotter.
- Klippes rotta ' s abdominal hulrom ventrally. Gjør den opprinnelige snittet ved hjelp av en skalpell. Høste aneurismet med saks og plassere de høstet aortas i 10% nøytralt bufret formalin for 24-48 h.
Merk: Kirurgen må være forsiktig å forhindre skade på aorta og andre organer når utsette aneurismet. En forhøyet buk organ praktiseres, indikerer AAA formasjon. figur 2 viser et bilde i vivo og ex vivo bildet; Denne representativt utvalg av AAAs er ikke utløst. - EVG flekker 9
- Løsning forberedelse
- forberede Verhoeff ' s hematoxylin ved å blande følgende i angitt rekkefølge: alkoholholdige hematoxylin 20 mL, 10% ferric chloride 8.0 mL, og Lugol ' s jod 8 mL. Bland løsningen mellom hvert tillegg. Denne løsningen kan tilberedes ferskt behov.
- Forberede Van Gieson ' s løsning ved å blande 1% syre fuchsin 1 mL og mettet pikrinsyre 45 mL. La stå over natten og bland godt. Denne løsningen er stabil i 2 uker.
- Forberede unike løsning (2% ferric chloride) ved å blande 10% FeCl 3 10 mL i 40 mL destillert vann. Denne løsningen kan tilberedes ferskt behov.
- Forberede 5% hypo ved oppløsning 5.0 g natrium tiosulfat i 100 mL destillert vann. Denne løsningen er stabil for 1 år.
- Beising prosedyren
Merk: se referanse 9 for detaljer.- Kort, hydrat delene fast parafin i høstet aortas i destillert vann for 10 min. sted i aortas i Verhoeff ' s hematoxylin for 25 min. vask med vann og dukkert 10 - 30 ganger i skille løsning (2% FeCl 3). Skyll i vann. Sett i 5% hypo i 1 vaske i vann. Plass i Van Gieson ' s løsning for 5 min.
- Dehydrate alkohol i følgende rekkefølge: 75%, 90%, 95%, 100% og 100% alkohol for 30 s hver. Så klart i xylen for 5 min, to ganger. Plass på en dekkglassvæske med resinous montering medium.
Merk: elastiske fibre vises blåsvart til svart. kjerner: blå for å blaCK; kollagen: rød; og andre vev elementer: gul.
- Løsning forberedelse
Representative Results
Beskrevet operative teknikker oppretter en roman dyr modell av en kronisk hypoksi-indusert aortaaneurisme ved hjelp av en kombinasjon av polyuretan kateter innsetting og Sutur ligation av infrarenal abdominal aorta i rotter. Rotter beskrevet i delen protokollen var euthanized 28 dager etter inngrepet. Aortas ble høstet og fotografert for å visualisere aneurisme formasjon. Figur 2 viser utviklingen av fusiform AAA. Øvre og nedre endene av aorta i ex vivo har en normal diameter uten dilatasjon. Aorta diameter ble målt ved hjelp transabdominal ultrasonography (Figur 3). Diameteren generelt når maksimumsstørrelsen på ca 14 dager etter prosedyren; etter det forblir uendret eller øker litt. Figur 4 viser histopathological bildet av aneurismet på maksimal diameter etter EVG flekker. Bildet av vev på dag 28 (aneurisme) viste fremtredende nedbrytning av elastiske fibre forhold dag 0.
Figur 1: Kirurgiske prosedyrer å indusere et abdominalt aortaaneurisme (AAA).
(A) infrarenal aorta er skrubbet fra de omkringliggende vev. (B) en polyuretan kateter kutte 10 mm lange settes gjennom et lite innsnitt i aorta. (C) snitt repareres med en 8-0 monofilament Sutur og blodstrøm gjenopprettes. (D) aorta er samskrevet med en 5-0 silke Sutur over den innsatte kateter. Skala bar = 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Postoperative representant resultater.
Makroskopisk syn på postoperativ dag 28 viser utviklingen av fusiform abdominale aortaaneurismer. Forhøyet margin på retroperitoneum tilsvarer den ytre kanten av aneurismet (brutte linjer, venstre). Øvre og nedre endene av aorta i ex vivo er normalt (høyre). Skala bar = 3 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Maksimum aorta diameter målt ved hjelp av transabdominal ultrasonografi.
Aorta diameter stadig økt denne rotte modell. Aorta diameter presenteres som en gjennomsnittlig ± standardavvik (n = 12). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representant bilder av aneurisme vev med Elastica van Gieson flekker.
Histologiske vurdering EVG flekker viser den degenerative elastisk lamina i media og dannelsen av en intraluminal blodpropp 28 dager etter inngrepet (høyre). Elastisk fiber fragmentering i aorta media og sparsom kollagen fiber i aorta adventitia er observert på dag 28. Dag 0 er før prosedyren (venstre). Skala bar = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Under fysiologiske forhold, er den indre lag av aorta veggen næret av diffusjon fra luminal blodstrømmen, mens de ytre og den midterste lag er næret av VV, som penetrere fra adventitia til den mediale VV1. VV blodgjennomstrømningen i abdominal aorta veggen kan stamme fra følgende tre retninger/områder: (1) den proksimale retningen gjennom aorta veggen, (2) distale retning gjennom aorta veggen og (3) perivascular vev10. Tidligere identifisert vår histologiske analyse av menneskelig vev betydelig stenose eller okklusjon av VV i AAA veggen, antyder at VV blodgjennomstrømningen i abdominal aorta veggen kan være redusert4. Det er et svært viktig poeng i denne protokollen som en infrarenal AAA var forårsaket av en kombinasjon av polyuretan kateter innsetting og Sutur ligation av infrarenal abdominal aorta. Å nøye exfoliate vev laget, må kirurger jevnt inn et polyuretan kateter aorta og fast ligate aorta å forårsake kroniske hypoksi på grunn av hypoperfusion adventitial VV og aneurisme formasjon. Bruker disse teknikkene, blodstrøm i aorta veggen er derfor redusert og et lokalt hypoxic miljø er indusert. Blodet flyt reduksjon og hypoksi-indusert aneurisme formasjon angir at VV blodgjennomstrømningen i aorta bukveggen spiller en rolle i patogenesen AAA-formasjonen.
Spesielt en aortaaneurisme modell må oppfylle følgende vilkår: en 1.5-fold økning i vaskulær diameter i forhold til grunnlinjen, degenerasjon av tunika media og betennelse av aorta veggen. De mest populære dyr modellene har blitt konstruert ved å fremkalle inflammatorisk svar bruker stoffer som CaCl211, elastase12og angiotensin II13. Disse modellene kan ha en høy reproduserbarhet og åpenbart føre til patologisk endring, og de har blitt brukt i forskningsstudier. I vår modell vurdert vi aorta diameter med ultrasonography hver 7 dager fra før prosedyren ble utført til dag 28 etter prosedyren (Figur 3). Resultatene viste at aorta diameter moderat økt over 28 dager, som indikerer at denne endringen i diameter er lik som i forrige gnager modeller. Brutto observasjon av skjemaet vaskulær indikerte en glatt fusiform figur (figur 2). På dag 28, vi ofret rotter og utført histopathological analyse av aorta vev som ble gjenopprettet. Rive og forsvinningen av elastisk og kollagen fibrene tunika media og adventitia ble observert (Figur 4). Videre var inflammatoriske celler, som makrofager, tilstede fra tunika adventitia til tunika media.
Foreløpig er behandlingstilbud tilgjengelig for AAAs begrenset til kirurgisk reparasjon og endovascular stent pode, med dødelighet av 30-50% hos pasienter med AAA ruptur14. Imidlertid er ingen stoffet godkjent for klinisk bruk å behandle AAAs. Det er debatt at det er avvik i patologisk funnene mellom mennesker og etablerte dyremodeller brukt i AAA forskning. Likheter i patogenesen mellom menneskelig AAA og AAA dyremodeller er avgjørende for utviklingen av farmakologiske behandlinger. Om effektiviteten av gnager modeller ligner våre rotte modell morphologically mennesker i intraluminal blodpropp5 og adipogenesis8. Videre ca 20% av rottene i denne studien hadde AAA brudd og døde innen 28 dager etter inngrepet. Aortaaneurisme brudd er den viktigste hendelsen for denne sykdommen, brudd er uvanlig med etablerte eksperimentelle AAA modeller og mekanismen har ennå ikke utredet. Derfor, denne modellen er nyttig for å forstå mekanismen av utvidelse av aorta diameter og ruptur av aneurismet.
Opprettelsen av denne modellen er nødvendig for noen kirurgiske prosedyrer. Derfor, forskere må øve oppretter denne modellen, som er en begrensning av denne modellen. I fremtiden ønsker vi å opprette en gnager modell der vi kan redusere blodstrømmen ved gradvis jevning VV veggene, som resulterer i spontan aortaaneurisme.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid for vitenskapelig forskning (B) (20291958) å N.U.; Grants-in-Aid for unge forskere (A) (25713024) til NZ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rat | Japan SLC.Inc | Slc:SD rat | Sprague–Dawley ratTM |
| povidone-iodine solution | Libatape Pharmaceutical Co., Ltd. | 4987335 111457 | |
| 5-0 silk string | Akiyama Medical MFG. CO.,LTD | JIS No.1 | |
| vascular clips | Natsume Seisakusho Co., Ltd. | C-42-S-2 | |
| polyurethane catheter (24-gauge indwelling needle) | MEDIKIT | 24G | Supercath Z4VTM, 24-gauge indwelling needle |
| polyurethane catheter (18-gauge indwelling needle) | MEDIKIT | 18G | Supercath Z3VTM, 18-gauge indwelling needle |
| 8-0 monofilament string | Ethicon Suture | c-42-S-2 | PROLENE Polypropylene Suture, Repair the incision with the suture |
References
- Wolinsky, H., Glagov, S. Comparison of abdominal and thoracic aortic medial structure in mammals. Deviation of man from the usual pattern. Circ Res. 25 (6), 677-686 (1969).
- Sano, M., et al. Lymphangiogenesis and angiogenesis in abdominal aortic aneurysm. PLoS One. 9 (3), e89830 (2014).
- Vorp, D. A., et al. Association of intraluminal thrombus in abdominal aortic aneurysm with local hypoxia and wall weakening. J Vasc Surg. 34 (2), 291-299 (2001).
- Tanaka, H., et al. Adventitial vasa vasorum arteriosclerosis in abdominal aortic aneurysm. PLoS One. 8 (2), e57398 (2013).
- Tanaka, H., et al. Hypoperfusion of the Adventitial Vasa Vasorum Develops an Abdominal Aortic Aneurysm. PLoS One. 10 (8), e0134386 (2015).
- Tanaka, H., et al. Imaging Mass Spectrometry Reveals a Unique Distribution of Triglycerides in the Abdominal Aortic Aneurysmal Wall. J Vasc Res. 52 (2), 127-135 (2015).
- Kugo, H., et al. The preventive effect of fish oil on abdominal aortic aneurysm development. Biosci Biotechnol Biochem. 80 (6), 1186-1191 (2016).
- Kugo, H., et al. Adipocyte in vascular wall can induce the rupture of abdominal aortic aneurysm. Sci Rep. 6, 31268 (2016).
- Lichtenberg, A., Cebotari, S., Tudorache, I., Hilfiker, A., Haverich, A. Biological scaffolds for heart valve tissue engineering. Methods Mol Med. 140, 309-317 (2007).
- Heistad, D. D., Marcus, M. L., Larsen, G. E., Armstrong, M. L. Role of vasa vasorum in nourishment of the aortic wall. Am J Physiol. 240 (5), H781-H787 (1981).
- Yoshimura, K., et al. Regression of abdominal aortic aneurysm by inhibition of c-Jun N-terminal kinase. Nat Med. 11 (12), 1330-1338 (2005).
- Azuma, J., Asagami, T., Dalman, R., Tsao, P. S. Creation of murine experimental abdominal aortic aneurysms with elastase. J Vis Exp. (29), (2009).
- Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice. J Vis Exp. (103), (2015).
- United Kingdom, E. T. I., et al. Endovascular versus open repair of abdominal aortic aneurysm. N Engl J Med. 362 (20), 1863-1871 (2010).
