Summary
Polyuretan katetrar in i aorta lumen och sutur ligering av aorta inducera kronisk hypoxi på grund av hypoperfusion av den adventitial vasa vasorum. Den här artikeln beskrivs en ny djurmodell av bukaortaaneurysm (AAA) med egenskaper som liknar dem av AAA hos människor.
Abstract
Den adventitial vasa vasorum (VV) ger syre och näring till aortaväggen. Hypoxi i aortaväggen kan orsaka förstorade bukaortaaneurysm (AAA). Denna artikel presenterar och beskriver ett standardprotokoll som används för att framkalla AAAs genom adventitial VV hypoperfusion skapade med en kombination av polyuretan katetrar in i aorta lumen och sutur ligering av infrarenala bukaorta.
Protokollet innebär användning av hanråttor som väger 300-400 g, som tillhandahålls mat och vatten ad libitum. Efter laparotomi med en ventrala mittlinjen buk snitt utförs exfoliering av aorta, som blockerar blodflödet från perivaskulär vävnaden. Aortotomy som involverar ett litet snitt intill den nedsatt artär grenar utförs, och en polyuretan kateter sätts med hjälp av en inneboende 18 gauge-nål. Efter reparera snittet, blockerar snäva ligering av aorta över katetern VV blodflödet i proximal riktning genom aorta väggen utan att störa aorta blodflödet. Denna teknik kan inducera en AAA med progressiv aorta dilatation.
Den största fördelen med denna modell är att VV hypoperfusion orsakar vävnadshypoxi och utvecklingen av en infrarenala AAA, som har morfologiska och patologiska egenskaper liknar dem i en mänsklig AAA.
Introduction
Bukaorta består av följande tre lager: inre kärlväggen (intima), mediala lagret (media) och yttre kärlväggen (adventitia), och av dessa adventitia har en unik blod leverera system som kallas den vasa vasorum (VV). Aorta vävnad levereras med syre genom adventitial VV perfusion och enkel syre diffusion från aorta blod flöde1. Geografiskt, har bukaorta dock minst fördelningen av VVs jämfört med i andra delar av aorta. 2
En tidigare studie rapporterade om hypoxi i mänskliga bukaortaaneurysm (AAA) väggar med tjocka intraluminal tromb (ILT)3. Det har dessutom visat att en adventitial VV i aneurysmatisk väggar är ockluderas med aterosklerotiska förändringar på en signifikant högre frekvens, som är associerade med hypoxi i AAA väggar4. Baserat på dessa fynd, skapades en roman gnagare modell AAA genom att inducera adventitial VV hypoperfusion5. I denna modell orsakade VV hypoperfusion vävnadshypoxi och utvecklingen av en infrarenala AAA, som hade morfologiska och patologiska egenskaper liknar dem i en mänsklig AAA6. Exempel var förekomsten av ILTs och ansamling av hyperplastiska adipocyter6och potential att orsaka bristning7,8. Dessa fynd har observerats i sällsynta fall i tidigare gnagare modeller. Denna modell kan därför kraftigt bidra till en djupare förståelse av mekanismen för AAA utveckling och bristning. Vi presenterar och beskriver ett standardprotokoll som används för att framkalla AAAs genom adventitial VV hypoperfusion och vi förklarar hur man framkalla hypoxi i aortaväggen använda kirurgiska tekniker.
Protocol
djurvård och experiment utfördes i enlighet med riktlinjerna i Hamamatsu universitet skola av medicin djur vård kommittén vid Center för djur vård.
1. kirurgiska ingrepp för att skapa modellen
Obs: placera de kirurgiska instrument i en pärla sterilizer för 10 s preoperativt. Använd sterila handskar intraoperatively.
- Användning hanråttor väger 300-400 g. Låt råttorna tillgång till mat och vatten ad libitum.
- Söva råtta med isofluran inandning (2,0-3,0 mL/L). Bekräfta rätt anesthetization genom tå nypa.
- Raka hår på buken med en rakapparat, och skrubba buken med alkohol och en povidon-jodlösning.
- Placera råtta i ryggläge på tabellen drift. Använda vet salva på råtta ' s ögon att förhindra torrhet under anestesi.
- Utför en laparotomi med en ventrala mittlinjen buk snitt med en sax. För att säkra en tydlig operationsområdet, packa buk innehållet inuti bukhålan med steril gasbinda använder ett sår upprullningsdon.
- Kopplas loss aorta från perivaskulär vävnad, försiktigt plocka upp och riva retroperitoneum med pincett för att exponera aortaväggen och exfoliera infrarenala aorta i retroperitoneal utrymmet från nivån på den vänster nedsatt ven till bifurkationen från den perivaskulär vävnad ( figur 1A).
- Ligate fartyg förgrening från bukaorta med en 5-0 silk sträng till block blod leverera vid en punkt från aorta som inte smala aorta lumen.
- Att blockera aorta blodflödet, plats vaskulär klipp nedanför Tumblety och precis ovanför bifurkation av aorta.
Obs: Storleken på klippen bör vara större än aorta diameter att blockera blodflödet helt. En tillfällig 5-0 silk sträng ligatur är också tillräckligt för att blockera blodflödet istället för klippen. - Liknar skapar en dot blödning på ytan av aortaväggen, skär den främre aorta väggen med en mikro-scissor 5 mm distalt från aorta klippet, intill den nedsatt artär grenar, för att infoga en polyuretan kateter.
- Infoga en polyuretan kateter (innerdiameter 0,55 mm, innerdiameter 0,37 mm) med en 24-gauge kvarliggande nål grunt genom snittet att tvätta bort blod i aorta med vatten. Administrera en 1 mL spruta fylld med vatten in i polyuretan katetern och tvätta bort återstående blodet i aorta med vatten. Efter bevattning, ta bort katetern från aorta.
- Innan du infogar en polyuretan kateter (ytterdiameter 1,20 mm, innerdiameter 0,94 mm) med en 18 gauge inneboende nål, skär polyuretan katetern till 10 mm lång ( figur 1B).
- Infoga snittet bit av polyuretan katetern i aorta lumen från snittet i steg 1,9. Helt placera 10 mm katetern i aorta lumen, och flytta mittpunkten för katetern att matcha placeringen av snittet (dvs täcka snitt med katetern).
- Reparera snittet med avbrutna suturer med hjälp av en 8-0 monofilament sträng ( figur 1 c).
- Ligera bukaorta använder en kombination av 5-0 silk sträng och polyuretan katetern ( figur 1 d).
Obs: Aorta lumen kan underhållas av kvarkateter. Ligera aorta ordentligt för att förhindra misaligning kateter position. Kirurgen ' s Knut rekommenderas, eftersom det tillför en extra twist när knyta det första kastet av Knut, bildar en dubbel överhandsknop, och en ytterligare vändning ger mer friktion och kan minska lossnande. - Efter ligering, ta bort vaskulär klippet på aorta bifurkationen, och sedan, vaskulär klippet nedanför Tumblety återställa antegrade blodflödet. Bekräfta brutto aorta pulsering.
- Nära buken snittet i två lager, bukhinnan och andra lager, med en 4-0 polypropylen sutur. Tätt sutur snittet för att förhindra en utbuktningen orgel.
- Gäller aktuell lidokain på buken snittet. Placera råtta på en värmedyna tills medvetandet återkommer. Lämna inte en råtta utan uppsikt tills den har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning. Returnerar inte en råtta som har genomgått operation för att företaget av andra råttor tills det har återhämtat sig helt. Noggrant övervaka
- råtta efter operationen. Injicera en bolus steril koksaltlösning (1,0-2,0 mL) subkutant om en råtta visar tecken på ångest eller kroppen viktminskning.
- Observera postoperativt, tidsförlopp utvecklingen av förstorad aorta på ett ultraljud echogram. Mått största diameter från insidan edge till ytterkanten av bukaorta som beskrivs 5.
2. Skörd, fastställande och Elastica-van Gieson (EVG) färgningen
- tjugoåtta dagar postoperativt, administrera natrium pentobarbital ≥ 100 mg/kg intraperitonealt till eutanasi råttorna.
- Skar upp råttan ' s buk hålrum ventralt. Gör den inledande snitt med en skalpell. Skörda aneurysmet med sax och placera de skördade artärer i 10% neutral buffrad formalin för 24-48 h.
Obs: Kirurgen måste vara noga med att förhindra skador på aorta och andra organ när utsätta aneurysmet. Ett förhöjt abdominal organ bör observeras, som anger AAA bildandet. figur 2 visar en i vivo bild och ex vivo bild; Detta representativt urval av AAAs är inte spruckit. - EVG färgning 9
- Lösning förberedelse
- Förbered Verhoeff ' s hematoxylin genom att blanda följande i angiven ordning: alkoholhaltiga hematoxylin 20 mL, 10% järnklorid 8,0 mL, och Lugols ' s jod 8 mL. Blanda lösningen mellan varje tillägg. Denna lösning kan beredas färska behövs.
- Förbered Van Gieson ' s lösning genom att blanda 1% syra fuchsin 1 mL och mättade pikrinsyra 45 mL. Låt stå över natten och blanda väl. Denna lösningen är stabil i 2 veckor.
- Förbered särskiljande lösning (2% järnklorid) genom att blanda 10% FeCl 3 10 mL i 40 mL destillerat vatten. Denna lösning kan beredas färska behövs.
- Förbered 5% hypo genom att lösa upp 5,0 g natriumtiosulfat i 100 mL destillerat vatten. Denna lösningen är stabil i 1 år.
- Färgningen förfarande
Obs: se hänvisning 9 för detaljer.- Kort, återfukta avsnitten fast paraffin av de skördade artärer i destillerat vatten för 10 min. Placera artärer i Verhoeff ' s hematoxylin för 25 min. Tvätta med vatten och doppa 10 - 30 gånger i differentiera lösning (2% FeCl 3). Skölj i vatten. Placera i 5% hypo för 1 min. tvätta i vatten. Plats i Van Gieson ' s lösning för 5 min.
- Dehydrate i alkohol i följande ordning: 75%, 90%, 95%, 100% och 100% alkohol för 30 s varje. Avmarkera i xylen i 5 minuter två gånger. Plats på ett täckglas med hartsartade monteringsmedium.
Obs: elastiska fibrer visas blåsvart till svart; atomkärnor: blå till blaCK; kollagen: röd; och andra vävnad element: gula.
- Lösning förberedelse
Representative Results
De beskrivna operationstekniker skapa en ny djurmodell av en kronisk pulsåderbråck för hypoxi-inducerad genom att använda en kombination av polyuretan katetrar och sutur ligering av infrarenala bukaorta hos råttor. De råttor som beskrivs i avsnittet protokollet var euthanized 28 dagar efter ingreppet. Artärer var skördas och avbildas för att visualisera aneurysm bildas. Figur 2 visar utvecklingen av spolformade AAA. De övre och nedre ändarna av aorta i ex vivo har en normal diameter utan dilatation. Aorta diameter mättes med hjälp av transabdominal ultraljud (figur 3). Diametern i allmänhet når maximal storlek på ca 14 dagar efter förfarandet. därefter, det är oförändrad eller ökar något. Figur 4 visar den histopatologiska bilden av aneurysmet på dess maximala diameter efter EVG färgning. Bilden av vävnaden på dag 28 (aneurysm) visade framstående degradering av elastiska fibrer jämfört med dag 0.
Figur 1: Kirurgiska ingrepp för att inducera bukaortaaneurysm (AAA).
(A) infrarenala aorta är exfolierad från den omgivande vävnaden. (B) en polyuretan kateter skär 10 mm lång sätts genom ett litet snitt i aorta. (C) snitt repareras med en 8-0 monofilament sutur och blodflödet återställs. (D) aorta är sammanskrivna med en 5-0 silk sutur över infogade katetern. Skalstapeln = 5 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Postoperativ representativa resultat.
Makroskopiska syn på postoperativ dag 28 visar utvecklingen av spolformade bukaortaaneurysm. Den förhöjda marginalen av retroperitoneum motsvarar den yttre kanten av aneurysmet (brutna linjer, vänster). Övre och nedre ändarna av aorta i ex vivo är normala (höger). Skalstapeln = 3 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Maximal aorta diameter mätt med transabdominal ultraljud.
Aorta diameter ökat stadigt i denna råtta modell. Aorta diametrar presenteras som ett medelvärde ± standardavvikelse (n = 12). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa bilder av aneurysmatisk vävnad med Elastica van Gieson färgning.
Histologisk undersökning med EVG färgning visar den degenerativa elastiska lamina i media och bildandet av en intraluminal tromb 28 dagar efter ingreppet (höger). Elastisk fiber fragmentering i aorta media och glesa kollagen fiber i aorta adventitia observeras på dag 28. Dag 0 är innan förfarandet (vänster). Skalstapeln = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Under fysiologiska betingelser, får de inre skikten av aortaväggen näring genom diffusion från luminala blodflödet, medan de yttre och mellersta skikten får näring av VV, som penetrerar den mediala VV-1från adventitia. VV blodflödet i aorta bukväggen kan härröra från följande tre riktningar/områden: (1) proximal riktning genom aortaväggen, (2) distala riktning genom aortaväggen och (3) perivaskulär vävnader10. Tidigare, vår histologisk analys av mänskliga vävnader identifierat betydande stenos eller ocklusion av det VV i AAA väggen, vilket tyder på att VV blodflödet i aorta bukväggen kan vara minskad4. Det är en mycket viktig punkt i detta protokoll som en infrarenala AAA orsakades av en kombination av polyuretan katetrar och sutur ligering av infrarenala bukaorta. För att varsamt exfoliera det vävnad skiktet, måste kirurger smidigt sätt en polyuretan kateter i aorta och fast ligera aorta för att orsaka kronisk hypoxi på grund av hypoperfusion av adventitial VV och aneurysm bildas. Använda dessa tekniker, blodflödet i aortaväggen är följaktligen minskade, och en lokal hypoxiska miljö induceras. Att blod flöde minska och hypoxi-inducerad aneurysm bildandet indikerar att VV blodflödet i aorta bukväggen spelar en roll i patogenesen av AAA bildandet.
Specifikt, ett aortaaneurysm modell måste uppfylla följande villkor: en 1,5 ökning av vaskulär diameter jämfört med utgångsvärdet, degeneration av tunica media, och inflammation av aortaväggen. De mest populära modellerna har byggts genom att inducera inflammatoriskt svar med hjälp av ämnen, såsom CaCl211, elastase12och angiotensin II13. Dessa modeller kan ha en hög reproducerbarhet och naturligtvis orsaka patologiska förändringar, och de har vanligen använts i forskningsstudier. I vår modell bedömde vi aorta diameter med ultraljud varje 7 dagar från innan förfarandet utfördes tills dag 28 efter ingreppet (figur 3). Resultaten visade att aorta diameter måttligt ökat under de 28 dagarna, som anger att denna förändring i diametern är samma som hos tidigare gnagare modeller. Brutto observation av vaskulär form anges en jämn spolformade form (figur 2). Dag 28, vi offrade råttorna och utfört histopatologisk analys av aorta vävnad som återfanns. Riva och försvinnandet av den elastiska och kollagen fibrer i tunica media och adventitia observerades (figur 4). Dessutom var inflammatoriska celler, såsom makrofager, närvarande från tunica adventitia till tunica media.
Behandlingsalternativ som är tillgängliga för AAAs för närvarande begränsat till kirurgisk reparation och endovaskulära stent ympning, med dödlighet på 30-50% hos patienter med AAA bristning14. Dock har inget läkemedel godkänts för klinisk användning att behandla AAAs. Det finns debatt att det finns avvikelser i de patologiska fynd mellan människor och etablerade djurmodeller används i AAA forskning. Likheter i patogenesen mellan mänskliga AAA och AAA djurmodeller är väsentliga för utvecklingen av farmakologiska behandlingar. Om effektiviteten av gnagare modeller är vår råtta modell morfologiskt lik människan när det gäller intraluminal tromb5 och adipogenesis8. Dessutom ca 20 procent av råttorna i denna studie hade AAA bristning och dog inom 28 dagar efter ingreppet. Även om aortaaneurysm ruptur är den mest kritiska faktorn för denna sjukdom, bristning är ovanligt med etablerade experimentella AAA modeller och mekanismen är ännu inte klarlagd. Denna modell är därför användbar för att förstå mekanismen av dilatation av aorta diameter och ruptur av aneurysmet.
Skapandet av denna modell krävs för vissa kirurgiska ingrepp. Forskare måste därför öva att skapa denna modell, som är en begränsning av denna modell. I framtiden vill vi skapa en gnagare modell där vi kan minska blodflödet genom gradvis förtjockning VV väggarna, vilket resulterar i spontana aortaaneurysm.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Grants-in-Aid för vetenskaplig forskning (B) (20291958) att N.U.; Grants-in-Aid för unga forskare (A) (25713024) till NZ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rat | Japan SLC.Inc | Slc:SD rat | Sprague–Dawley ratTM |
| povidone-iodine solution | Libatape Pharmaceutical Co., Ltd. | 4987335 111457 | |
| 5-0 silk string | Akiyama Medical MFG. CO.,LTD | JIS No.1 | |
| vascular clips | Natsume Seisakusho Co., Ltd. | C-42-S-2 | |
| polyurethane catheter (24-gauge indwelling needle) | MEDIKIT | 24G | Supercath Z4VTM, 24-gauge indwelling needle |
| polyurethane catheter (18-gauge indwelling needle) | MEDIKIT | 18G | Supercath Z3VTM, 18-gauge indwelling needle |
| 8-0 monofilament string | Ethicon Suture | c-42-S-2 | PROLENE Polypropylene Suture, Repair the incision with the suture |
References
- Wolinsky, H., Glagov, S. Comparison of abdominal and thoracic aortic medial structure in mammals. Deviation of man from the usual pattern. Circ Res. 25 (6), 677-686 (1969).
- Sano, M., et al. Lymphangiogenesis and angiogenesis in abdominal aortic aneurysm. PLoS One. 9 (3), e89830 (2014).
- Vorp, D. A., et al. Association of intraluminal thrombus in abdominal aortic aneurysm with local hypoxia and wall weakening. J Vasc Surg. 34 (2), 291-299 (2001).
- Tanaka, H., et al. Adventitial vasa vasorum arteriosclerosis in abdominal aortic aneurysm. PLoS One. 8 (2), e57398 (2013).
- Tanaka, H., et al. Hypoperfusion of the Adventitial Vasa Vasorum Develops an Abdominal Aortic Aneurysm. PLoS One. 10 (8), e0134386 (2015).
- Tanaka, H., et al. Imaging Mass Spectrometry Reveals a Unique Distribution of Triglycerides in the Abdominal Aortic Aneurysmal Wall. J Vasc Res. 52 (2), 127-135 (2015).
- Kugo, H., et al. The preventive effect of fish oil on abdominal aortic aneurysm development. Biosci Biotechnol Biochem. 80 (6), 1186-1191 (2016).
- Kugo, H., et al. Adipocyte in vascular wall can induce the rupture of abdominal aortic aneurysm. Sci Rep. 6, 31268 (2016).
- Lichtenberg, A., Cebotari, S., Tudorache, I., Hilfiker, A., Haverich, A. Biological scaffolds for heart valve tissue engineering. Methods Mol Med. 140, 309-317 (2007).
- Heistad, D. D., Marcus, M. L., Larsen, G. E., Armstrong, M. L. Role of vasa vasorum in nourishment of the aortic wall. Am J Physiol. 240 (5), H781-H787 (1981).
- Yoshimura, K., et al. Regression of abdominal aortic aneurysm by inhibition of c-Jun N-terminal kinase. Nat Med. 11 (12), 1330-1338 (2005).
- Azuma, J., Asagami, T., Dalman, R., Tsao, P. S. Creation of murine experimental abdominal aortic aneurysms with elastase. J Vis Exp. (29), (2009).
- Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice. J Vis Exp. (103), (2015).
- United Kingdom, E. T. I., et al. Endovascular versus open repair of abdominal aortic aneurysm. N Engl J Med. 362 (20), 1863-1871 (2010).
