Summary
In diesem Protokoll eingesperrte Proteinkinase A (PKA), ein zelluläres Signal Transduction Bioeffector, war auf einem Nanoparticle Oberfläche immobilisiert, mikroinjiziert in das Zytosol und aktiviert, indem die hochkonvertiert UV-Licht von Nah-Infrarot (NIR) Bestrahlung, Induktion nachgeschalteten Stress Faser Zerfall in das Zytosol.
Abstract
Großbildschirmen-Nanopartikel (UCNP)-vermittelten Photoaktivierungen ist ein neuer Ansatz für Remote Control BIOeffektoren mit viel weniger Phototoxizität und tiefere Gewebe eindringen. Die bestehenden Instrumente auf dem Markt ist jedoch nicht ohne weiteres kompatibel mit Großbildschirmen Anwendung. Daher ist es wichtig für diese Forschung, das kommerziell erhältliche Instrument ändern. In diesem Beitrag zeigen wir zuerst die Änderungen eines konventionellen Fluorimeter und Fluoreszenzmikroskop, um sie kompatibel für Photon Großbildschirmen Experimente zu machen. Dann beschreiben wir die Synthese von einem nahen Infrarot (NIR)-Käfig Protein Kinase A katalytische Untereinheit (PKA) auf einem UCNP Komplex immobilisiert ausgelöst. Parameter für die Mikroinjektion und NIR Photoaktivierungen Verfahren werden auch gemeldet. Nachdem die eingesperrte PKA-UCNP in REF52 Fibroblastenzellen mikroinjiziert ist, löst die NIR-Bestrahlung, die herkömmlichen UV-Bestrahlung deutlich überlegen ist, effizient die PKA Transduktion Signalweg in lebenden Zellen. Positive und negative Kontrolle Experimente bestätigen darüber hinaus, dass die PKA-induzierten Weg zur Auflösung von Stress Fasern speziell von NIR Bestrahlung ausgelöst wird. So bietet der Einsatz von Protein-modifizierte UCNP einen innovativen Ansatz zur Fernsteuerung Licht moduliert zellulärer Experimenten, in denen direkte Einwirkung von UV-Licht vermieden werden muss.
Introduction
Chemisch modifizierte Proteine, die photoaktiviert (z. B. PKA eingesperrt Proteine) ist entstanden als ein aufstrebendes Gebiet in der chemischen Biologie, nicht-invasiv interzelluläre biochemische Prozesse1,2 manipulieren ,3. Mit Licht, wie ein Stimulus ausgezeichnete räumlich-zeitliche Auflösung bietet, wenn Sie diese aktivieren im Käfig Proteine. UV-Licht kann jedoch unerwünschte morphologische Veränderungen, Apoptose und DNA-Schäden an Zellen4,5führen. Daher konzentrieren sich jüngste Entwicklungen in der Gestaltung von Photocaging Gruppen über die Aktivierung der Photocleavage auf längeren Wellenlänge oder zwei-Photon Erregung Phototoxizität, sowie Verringerung der tiefen Gewebe eindringen6,7zu erhöhen. Festsetzende Gruppen, die auf längeren Wellenlänge ermöglicht es uns, geeignete uncaging Wellenlängen (z.B.Kanäle) wählen gezielt zu reagieren aktivieren BIOeffektoren, wenn zwei oder mehr festsetzende Gruppen sind vorhanden-7. Angesichts dieser nützlichen Funktionen, ist entwickeln neue Rotlicht-Photocaging Gruppen sehr wichtig vorgelagerten Werk in photochemischen Methoden für biologische Studien von sondieren die Mechanismen der Reaktionen auf die Kontrolle der zellulären Aktivitäten8. Nichtsdestotrotz eine zwei-Photonen-festsetzende-Gruppe ist in der Regel auch hydrophobe aufgrund der verschmolzenen aromatischen Ring-Struktur und eine sichtbaren Lichts festsetzende Gruppe ist normalerweise organometallischen, mit aromatischen Liganden. Diese hydrophoben/aromatisch-Eigenschaft ist nicht geeignet, wenn die Bioeffector ein Protein oder Enzym, ist, wie es Ortsbild Aktivierung des Enzyms/Protein denaturiert und führt zum Verlust der Funktion, auch wenn die Konjugation und Photolyse noch auf chemischer Ebene2 arbeiten ,9.
UCNPs sind effektive Wandler, die das Anregungslicht NIR bis UV umwandeln. Diese einzigartige und faszinierende Eigenschaft der UCNPs bietet realistische Lösungen für die Herausforderungen im Zusammenhang mit Photoaktivierungen und kontrollierten Freisetzung von kleinen Molekülen, darunter Folsäure10, Cisplatin Derivate11 ausgelöst , DNA/SiRNA12, Copolymer Vesikel13und hohle Partikel14. Jedoch wurde nach bestem Wissen und Gewissen, die UCNP-gestützte Photoaktivierungen Enzyme oder Proteine nicht bisher getestet. Da gibt es keine erfolgreichen Fall mit Rotlicht oder NIR photoaktiven ein Enzym, wurden wir aufgefordert, die NIR-ausgelösten Aktivierung ein Protein/Enzym-Konstrukt bestehend aus chemisch modifizierte Käfighaltung Enzymkomplexe mit einer Silica-beschichtete durchführen, Lanthanid-dotierte UCNP15. In dieser Studie wurde die UCNP mit einem schnell reagierenden Signaltransduktion Kinase in Form der Käfighaltung PKA konjugiert. PKA steuert Glykogen-Synthese und Zytoskeletts Verordnung, die auf äußere Reize über zyklische Adenosin Phosphat (cAMP) Verordnung im Zytosol16reagiert. Wir untersuchten die Machbarkeit der Enzym-Aktivierung in zeitlicher und räumlicher Manieren in einem zellulären Experiment nach NIR Bestrahlung. Diese UCNP-gestützte Photoaktivierungen-Plattform ist eine neue Methode zur Photoactivate ein Enzym mit NIR und vermeidet unerwünschte Signal Transduction Resonanz Zellen verursacht durch konventionelle UV Bestrahlung2,4.
Es ist sehr schwierig, große BIOeffektoren zu translozieren (z. B. Proteine) in der Zellmembran, Zellaktivität zu kontrollieren. Obwohl Partikel immobilisiert Protein leichter über Endozytose in das Zytosol translozieren sein kann, kann Endozytose beschädigt oder über Endosomal Einschluss und die daraus resultierenden lysosomalen Abbau2,4abgebaut. Selbst wenn das eingesperrte Protein nach Membran Translokation noch funktionsfähig ist, möglicherweise translozierten Beträge nicht ausreichen, um die zelluläre Reaktion2,17auslösen. In scharfem Kontrast ist Mikroinjektion eine direkte und quantitativen Ansatz, große Bioeffectors an das Zytoplasma der Zelle zu liefern. Darüber hinaus erfordert UCNP immobilisiert Bioeffector hochkonvertiert Licht aktiviert werden. Die optische Messtechnik erfordert daher weitere Modifikation zu messen, visualisieren und Großbildschirmen Licht zu nutzen. In dieser Arbeit wird die Lieferung von einem Käfig PKA-UCNP-Komplex zu einer Zelle mit Mikroinjektion und die folgenden wesentlichen Änderungen der Spektroskopie und Mikroskopie für NIR Photoaktivierungen ausführlich beschrieben.
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Protocol
Hinweis: das Protokoll beschreibt eine detaillierte Instrumentierung-Modifikation für Großbildschirmen-gestützte Photoaktivierungen, ein synthetisches Verfahren generieren eingesperrt PKA-UCNP, Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) von der Kieselsäure-beschichtete UCNP und PKA-UCNP Proben, UV- und NIR Photolyse Einrichtung, Handy Vorbereitung, Mikroinjektion PKA-UCNP, eine Photoaktivierungen Studie und Stress Faser Färbung von REF52 Zellen eingesperrt.
1. Fluorimeter Setup für Großbildschirmen Spektrum Messung
- ein 4 X Objektiv neben der Küvettenhalter der Fluoreszenz-Spektrometer zu installieren, so dass der Laser mittig auf die Küvette fokussiert ist.
- Legen Sie eine abstimmbaren 0,5 - 8 W 980 nm Laserdiode 90° gegen die Objektivlinse.
Achtung: Der Betreiber muss Laser Sicherheit wissen und NIR-Laser-Schutzbrille zu tragen. - Installieren Sie einen vollständige Reflexion-Spiegel in den Lichtweg Schnittpunkt der Objektivlinse und Laser. Legen Sie eine schwarz eloxierte Metallplatte, die Erregung Fenster der Spektroskopie zu blockieren und zum Schutz der inneren Teile.
- Die Küvette Kieselsäure-beschichtete UCNP Lösung (0,2 - 0,6 mg/mL) in den Küvettenhalter legen, so dass ein helle Großbildschirmen Balken visualisiert werden und verwendet werden, kann um die besten leichte Ausrichtung für Spiegelinstallation anpassen.
- Wechseln die Spektroskopie Lumineszenz-Modus mit niedrigsten PMT Spannungseinstellung (anpassen, um eine höhere Einstellung, wenn das Signal zu schwach ist). Passen Sie den Spiegel, um die beste Ausrichtung, wo der Strahl in der Mitte der Küvette und PMT nimmt das stärkste Signal.
- Messen das Großbildschirmen Spektrum nach Angleichung an die Einstellung der gewünschten Leistung. Verwenden Sie thermische Haufen Leistungsmesser zur Erstellung einer Kalibrationskurve Laserleistung gegen den elektrischen aktuellen Messwert auf dem Laser-Netzteil. Die Laserleistung um sicherzustellen, dass die Leistung innerhalb des kalibrierten Bereichs ist ständig zu überprüfen.
2. Mikroskop-Setup
Hinweis: das folgende Setup funktioniert für Mikroskope mit einem zweistufigen Strahlengang ausgestattet. Will der Benutzer einen Anregung Lichtquelle Schalter in den hinteren Port der NIR-Laser und die Halide Lampe denselben Port nutzen zu installieren, wird der Kollimator in den rückseitigen Anschluss deutlich NIR blockieren, weil es Probe Heizung reduzieren soll. Der Benutzer muss eine schwierige Wahl machen: halten den Kollimator und leiden unter sehr niedrigen Großbildschirmen Effizienz, oder entfernen Sie den Kollimator und Opfern, die Intensität der Anregungslicht für die Epifluoreszenz.
Hinweis: eine Cutaway-Diagramm zeigt das Lichtweg Schema für eine modifizierte Spectrofluorometer, die Mikroskopie für Großbildschirmen Lumineszenz und NIR Photolyse Modus und Epifluoreszenz und UV-Photolyse-Modus und der experimentelle Aufbau verwendet für dieses Experiment sind in Abbildung 2 dargestellt.
- Equip Fluoreszenzmikroskop mit einem hellen Metalldampflampen Führer, in der Rückseite geleitet Port
Hinweis: In diesem oberen Ebenen Lichtweg wo gibt es ein Cube-Turm, eine Position des Würfels leer NIR aus der unteren Klasse leichte Weg zu sein - Installieren einer abstimmbaren 0,5 bis 8,0 W 980 nm Laserdiode im rechts Hafen, mit Seitenanschluss Kollimator offen.
Hinweis: Dies vergrößert die Laser Licht vor Ort, um etwa 500 µm im Durchmesser, wenn ein 10 X-Objektiv verwendet wird. Entfernen dieser Kollimator ergibt sich eine Mikrometer-Bereich Lichtfleck und NIR Zelle Bestrahlung unpraktisch macht. Diese Kollimator ist NIR-transparente. - Installieren Sie eine dichroitische Spiegel (850-nm-kurz-Pass) und eine Erregung Filter (950 nm lang-Pass) in der unteren Klasse Licht Weg
- Verwenden eine UCNP-Lösung, um die NIR Lichtfleck zu visualisieren. Passen Sie die Position des Lasers zur Mitte des NIR-Lichtstrahls in das Sichtfeld um die Ausrichtung zu beenden.
3. Vorbereitung und Charakterisierung von Caged PKA-UCNP bauen
- inkubieren rekombinante PKA (9 µM) mit 0,5 mM 2-Nitrobenzylbromide (BNB) in Käfighaltung Puffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl und 10 mM MgCl 2; pH 8,5) für 1-2 h bei 25 ° C. Quench die überschüssige BNB mit 10 mM Dthiothreitol (DTT) und dann gegen 4-(2-Hydroxyethyl) Dialyse Piperazin-1-Ethanesulfonic Säure (HEPES) Puffer (10 mM, pH 7,5), um überschüssige Reagenzien und Salze zu entfernen.
Hinweis: Der pH-Wert der festsetzende Lösung wird abgesenkt, von 8,5 bis 7,5 während der Dialyse mit HEPES pH 7,5 für die anschließende Ruhigstellung Reaktion. - Mix Lanthanid Salze-Y(CH3CO2) 3 Hydrat (99,9 %, 0,4527 g, 1,38 Mmol), Yb (CH 3 CO 2) 3-Hydrat (99,9 %, 0,2533 g, 0,60 Mmol) und Tm (CH 3 CO 2) 3 Hydrat (99,9 %, 0,0168 g, 0,02 Mmol)-Octadecene (30 mL) und Ölsäure (12 mL), erhitzen Sie die Mischung auf 115 ° C für 30 min, und auf 50 ° c abkühlen Als nächstes lösen das Reaktionsgemisch in einer methanolischen Lösung (20 mL) mit 0,2 g (5.0 Mmol) von NaOH Pellet und 0,2964 g (8 Mmol) von Ammonium Fluorid durch Ultraschallbehandlung für 15 min. Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 300 ° C zu den UCNP Kern (β-NaYF 4 : 1,0 % Tm 3 + / 30 % Yb 3 +) Nanopartikeln.
- Lösen sich die Kern-Nanopartikel (25 mg) mit CO-520 (0,5 mL) in Cyclohexan (10 mL). Ammoniak (wt 30 % V/V, 0,08 mL) und Tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) und ständigem Rühren für 12 h bei Raumtemperatur zu Silikon-beschichtete β-NaYF 4 gelten: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + Kern Nanopartikel.
- Inkubieren der PKA-Wert (6 Nmol) oder PKA im Käfig (6 Nmol) mit UCNP (1 mg) 15 in HEPES-Puffer (10 mM, pH 7,5) bei 4 ° C für 3 h, der PKA-Wert auf Kieselsäure-beschichtete UCNP über elektrostatische Wechselwirkungen zu immobilisieren.
- Filtern Sie das Gemisch mit PVDF-Filter (0,45 µm), Zentrifuge bei 17.000 x g für 10 min bei 4 ° C, und redisperse das Pellet in HEPES (50 µL, 10 mM, pH 7,5) mit 0,1 % Protein Stabilisator den gereinigten PKA-UCNP-Komplex zu erhalten. Bei 17.000 x g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand für Bradford-Test in der 1,5-mL-Tube sammeln.
- Analysieren die ungebundene PKA im Überstand rettete vor Schritt 3.5 mit Bradford-Test um Rücken-die PKA Substitution auf die UCNP Partikel, berechnen die haben normalerweise eine Substitution von ~ 4,5 Nmol der PKA pro mg Partikel.
Hinweis: Der Bradford-Test offenbart eine starke blaue Farbe auf die Pellets, die eine Ebene und stabile proteinreichen Immobilisierung ohne Desorption schlägt, während die überstehende Teil eingesperrt PKA-UCNP Lösung zeigt eine Farbe ähnlich HEPES-Puffer ( Abbildung 4 c-4e).
4. Charakterisierung
Hinweis: die Kinase Assay wird verwendet, um die spezifische Aktivität von Pyruvat-Kinase zu quantifizieren. Kurz gesagt, führt die Phosphorylierung des Peptids, die Pyruvat-Kinase und Laktat-Dehydrogenase gekoppelt ist, bei der Oxidation von NADH. Bildung des letzteren wird überwacht durch die Messung des Rückgangs der Extinktion von NADH bei 340 nm.
- Bestimmen Sie die Aktivität der PKA und PKA-UCNP in einem 60 µL Gesamtvolumen der Assay-Gemisch mit 4-Morpholinepropanesulfonic Säure (MOPS, 100 mM, pH 7,5), KCl (100 mM), Phosphoenolpyruvat (PEP, 1 mM), Adenosintriphosphat (ATP, 1 mM), β - Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide, reduzierte Form (NADH, 0,8 mM), Magnesiumchlorid (MgCl 2, 1 mM), Kemptide (0,4 mM) und eine Pyruvat-Kinase/Laktat-Dehydrogenase-Mischung (30/40 Einheiten der PK/LDH).
- Messen die Abnahme der NADH-Absorption im Laufe der Zeit nach der Zugabe der PKA-Lösung (2 µL) an der Assay-Mischung. Berechnen Sie die Steigung der Linie direkt reflektieren die Aktivität der Kinase gemessen wird.
- Messen die Aktivität der PKA-UCNP 15 und die gesamte Tätigkeit, die gut mit dem Produkt der Multiplikation native PKA-spezifische Aktivität und die berechnete PKA oberflächenbeschichteten Höhe abgeglichen werden sollen.
5. Photolyse Setup
- MeasUre alle Kraft des Lichts Quellen mit einem thermischen Haufen Sensor und Leistungsdichten zu berechnen (PD = Leistung (W) / Bereich (cm 2)) 18 basierend auf den spot Hellraum.
- In-vitro- UV-Photolyse Experimente durchführen, auf ein kommerzielles System mit 365 nm LED (200 mW/cm 2) 15.
- Für UV-Photoaktivierungen auf den Mikroskoptisch, beleuchten die PKA-UCNP-Lösung mit das Anregungslicht gefiltert durch eine kommerzielle Cube 15.
Hinweis: Die Leistungsdichte ist ~ 15 mW/cm 2, ohne Objektiv Fokussierung. - Für in-vitro- NIR Photoaktivierungen auf den Mikroskoptisch, beleuchten die PKA-UCNP-Lösung mit einem 980 nm Laser mit maßgeschneiderten Großbildschirmen Filter/Spiegel-Einstellungen auf der unteren Klasse Lichtweg, dichroitische Spiegel (850 nm kurz-Pass), installiert und eine Erregung Filter (950 nm lang-Pass).
Hinweis: Die Ausgabe Leistungsdichte ist 5 W/cm 2 vor 4 X Objektiv konzentriert. Die Leistungsdichte wird auf geschätzt ~ 68 W/cm 2 nach 4 X Objektiv Fokussierung.
6. Handy-Probenvorbereitung und Mikroinjektion der PKA-UCNP komplexe
- Vorfilter die Proben durch einen 0,45 µm-Filter nach PKA Immobilisierung (Schritt 3,5).
- Die Zellen im 10 % fetalen bovine Serum (FBS) mit L-15 Medium während des Zeitraums der Mikroinjektion für stabilen pH-Kontrolle außerhalb der Inkubator inkubieren.
Hinweis: um die Mikroinjektion Abschluss bestätigen, Co injizieren die native PKA-UCNP, eingesperrte PKA-UCNP oder PEGylated UCNP (7,5 mg/mL) 15 mit 5 6-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) (10 µM) in Zellen. - Anpassen der Konzentration der PKA-UCNP Partikel, sodass nach Mikroinjektion, die cytosolische Konzentration 1-3 μM PKA - einen physiologischen Konzentrationsbereich für PKA in einer Zelle, mit der Annahme ist, dass das Injektionsvolumen 1/10 der zellulären Volumen .
- Führen die Mikroinjektion in die Zellen (Schritt 6.2) mit einem Microinjector Gerät gekoppelt mit eine einachsige hydraulische Mikromanipulator ( Abbildung 3).
- Verwenden eine digitale Manometer zur Überwachung des Drucks durch die Microinjector im operativen Bereich ist (~ 50-200 hPa) und verschließen Sie die Spender-Ventil in einer angepassten Druck auf Entschädigung Druck für die Mikroinjektion zu bieten. Ziehen Sie die Nadel mit einem Abzieher.
- Halten den Einspritzdruck zwischen 50 und 75 hPa mit Injektion von 200-300 ms und der Entschädigung Druck bei 15 hPa Kulturmedium Rückfluss in Nadel durch Kapillarwirkung zu verhindern.
- Die Spitze Öffnungen der Nadeln um sicherzustellen, dass sie einen Außendurchmesser zwischen 1,3 und 1,5 µm, die bestätigt werden kann, indem man Bilder mit einem 40 X Objektiv zu untersuchen.
- Waschen der Zellen mit 2 mL L-15 Medium mit 10 % FBS nach der Mikroinjektion. Beobachten der zellulären Fluoreszenz-Bildgebung von 5 (6) - Carboxytetramethyl - Rhodamin (TAMRA) Mikroinjektion Abschluss bestätigen.
7. Photoaktivierungen von Caged PKA-UCNP mittels UV oder NIR Licht in lebenden Zellen
- für UV-Photoaktivierungen nach der PKA-UCNP Mikroinjektion, wachsen die REF52 Zellen auf einem 3,5 µm-Teller und legen Sie sie auf den Mikroskoptisch bestrahlen sie mit UV-Licht gefiltert nach der Cube für 3 min ohne Fokussierung Objektiv.
Hinweis: REF52 Zellen wurden in DMEM mit 10 % beibehalten FBS bei 37 ° C in einer 5 % CO 2 Inkubator und Zellen waren subcultured als die Konfluenz bis zu 90 % alle 2-3 Tage erreicht. - Für NIR Photoaktivierungen nach PKA-UCNP Mikroinjektion, beleuchten die Zellen auf einem 980 nm Laser aus unteren Klasse Filter/Spiegel-Einstellungen, wie unter Punkt 5.4 beschrieben.
Hinweis: Die Leistung Dichte ist 5 W/cm 2 vor 10 X Objektiv mit Schwerpunkt und wird voraussichtlich 300 W/cm 2 nach 10 x Objektiv mit Schwerpunkt. Großbildschirmen ist ein Prozess, der eine hohe Photonendichte erfordert vor allem, wenn eine größere Verschiebung der Anti-Stoke benötigt wird. Daher konzentriert ist erforderlich bei Photoaktivierungen. - Im Bedarfsfall ein größeren Lichtfleck (650 µm X 520 µm) bestrahlen diese Zellen mit NIR konzentriert durch ein 10 X-Objektiv mit einem Kollimator für 15 min. zulassen für eine dunkle Intervall von 5 min nach jeder 5-min-Bestrahlung, um Erwärmung zu vermeiden.
Hinweis: Wenn eine hohe räumliche Auflösung (subzelluläre Lichtfleck) benötigt wird, verwenden Sie 40 X Objektiv mit einer Lochkamera in der Ausfahrt Ende des Lichtleiters installiert um einen Lichtfleck subzellulären Dimension (5 µm X 4 µm) zu generieren. In diesem Fall, 1 s der Bestrahlung reicht NIR Photoaktivierungen aufgrund der hohen Fluss der Photonen. - Nach UV oder NIR Photolyse, können die Zellen wieder in eine 5 % CO 2 Inkubator bei 37 ° C für 1 h in kompletten Medium zelluläre Reaktionen erzeugen. Befestigen Sie sie anschließend in 1 mL 4 % Paraformaldehyd/Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 20 min vor weitere Färbung.
Achtung: Paraformaldehyd ist hochgiftig; vermeiden Sie Kontakt mit Haut, Augen oder Schleimhäuten. Das Pulver bei Mess- und Vorbereitung Einatmen vermeiden.
8. Visualisierung von Stress Faser Zerfall verursacht durch NIR Photoaktivierungen
- nach der Fixierung, Alexa 594-Phalloidin verwenden (5 µL 6,6 µM-Stammlösung 200 µL PBS für Färbung hinzufügen; 25 min bei Raumtemperatur inkubieren) zu färben und visualisieren Sie die Stress-Fasern. Visualisieren Sie die Bilder von Alexa 594-Phalloidin (Ex-581 nm/Em 609 nm) mit einer Filter-Set.
- Brüten die Zellen für 5 min in 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) bei Raumtemperatur. Nach dem Färben, die Proben mit PBS waschen und fluoreszierende Bilder von Stress Fasern und Kerne einzeln nehmen.
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Representative Results
Das Design des Konstrukts eingesperrte Enzym-UCNP ist in Abbildung 1dargestellt. Die PKA-Enzym wurde zunächst reagierte mit 2-Nitrobenzyl-Bromid, eine inaktive eingesperrte PKA zu generieren, und es war dann elektrostatisch auf der Oberfläche des UCNP immobilisiert. UCNPs hochkonvertiert Licht aussenden und somit photolytically Spalten die o-Nitrobenzyl Gruppen auf Cys 199 und Cys 343, generieren die aktivierte PKA. TEM Bilder und Bradford-Test bestätigt, dass die PKA und eingesperrte PKA auf die Oberfläche des UCNPs immobilisiert wurden und die Kinase-Aktivität eingesperrte PKA-UCNP-Lösung nach UV Photoaktivierungen wurde (Abbildung 4 untersucht). Nach PKA Immobilisierung, offenbart eine dynamische Lichtstreuung Instrument die Größe und das Zeta-Potential des PKA-Partikel-Komplexes zu 120 nm und -16,0 mV, beziehungsweise. Bradford-Test der PKA-UCNP Lösung zeigte eine starke violette Farbe auf die Partikel, die eine Ebene und stabile proteinreichen Immobilisierung schlägt.
REF52 Ratte embryonalen Fibroblastenzellen wurden für die Studie der Photoaktivierungen in der zellulären Experiment ausgewählt. In diesem Experiment kann der PKA-Weg durch endogene PKA-Aktivierung (ausgelöst durch die Inkubation der Zelle durchlässig 8-CPT-cAMP) oder Mikroinjektion der aktiven oder triggerbare PKA eingeschaltet werden. Aktivierte PKA (mit oder ohne Partikel Immobilisierung) zerfällt die Stress-Fasern und stellt mehr filamentösen Aktin (F-Aktin) Oberfläche und somit Fluorophore beschriftet Phalloidin, die F-Aktin, wodurch ein höherer Färbung Signal stark bindet. Nach 8-CPT-cAMP Inkubation oder Mikroinjektion der kostenlose PKA, aktive PKA-UCNP oder UV-aktivierte PKA-UCNP (als positiv-Kontrolle Experimente) haben wir das Vorhandensein von starken Beanspruchung Faser Zerfall verursacht durch PKA Weg Aktivierung (Abbildung 5) bestätigt. Sowohl endogene PKA und mikroinjiziert PKA Studien zeigen ganze Zelle Stress Faser Desintegration, während Partikel immobilisiert PKA (aktive PKA-UCNP und UV-aktivierte PKA-UCNP) zeigt Stress Faser Zerfall nur an dem Standort Mikroinjektion weiter was auf die stabile Immobilisierung der PKA auf der UCNPs. Für das NIR Photoaktivierungen Experiment, nach der Mikroinjektion die eingesperrte PKA-UCNP und die NIR-Bestrahlung UCNPs hochkonvertiert Licht emittieren und Spalten die o-Nitrobenzyl Gruppen auf Cys 199 und Cys-343. Infolgedessen sie erzeugen die aktivierte PKA, Stress Fasern zerfallen, und ergeben ein höheres Signal durch Fluorophore beschriftet Phalloidin Färbung (Abbildung 6). Negativ-Kontrolle Experimente auf REF52 Zellen mikroinjiziert mit UCNP ohne Käfig PKA und dann NIR bestrahlt, sowie REF52 Zellen mit Käfig PKA-UCNP bei fehlender Einstrahlung, zeigte keine Wirkung auf Stress Faser Integrität.
Abbildung 1 . Illustration der Käfig PKA-UCNP Design und Großbildschirmen unterstützt PKA Uncaging. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Ein Cutaway-Diagramm zeigt das Lichtweg Schema. (ein) modifizierte Spectrofluorometer und (b) Mikroskop für Großbildschirmen Lumineszenz und NIR Photolyse Modus (links) und Epifluoreszenz und UV-Photolyse-Modus (rechts), sowie ihre Versuchsaufbau. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Versuchsaufbau für die Mikroinjektion. Die Injektion-Halter ist eine einachsige Öl hydraulische Mikromanipulator in einem Winkel zwischen 30° und 45° gekoppelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Bestätigung der PKA Immobilisierung auf UCNP. TEM Bilder von (einem) Kieselsäure-beschichteten UCNP und (b) im Käfig PKA immobilisiert UCNP; Bradford-Test (c) HEPES-Puffer, (d) das Pellet Bruchteil Wiederfreisetzung Gefangener PKA-UCNP-Lösung, und (e) des Überstands Bruchteil der Käfig PKA-UCNP Lösung; und (f)-Kinase-Aktivität Assay eingesperrte PKA-UCNP-Lösung nach UV-Photoaktivierungen. Diese Zahl wurde reproduziert von Gao, H.-D. Et al. Nachdem der Verlag, der American Chemical Society ausdrückliche Erlaubnis eingeholt wurde. Maßstabsleiste = 20 nm Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Fluoreszenzbilder Stress Faser Färbung (grün) und DAPI-Färbung der Zellkerne (blau) von REF52 Zellen, zeigt Stress Faser Zerfall und morphologische Veränderungen ausgelöst durch verschiedene PKA Aktivierung. (ein) unbehandelt Zellen, (b) 8-(4-Chlorophenylthio) Adenosin 3', 5'-cyclic Monophosphate (8-CPT-cAMP)-behandelten Zellen, (c) aktive PKA mikroinjiziert Zellen, aktive PKA-UCNP-mikroinjiziert Zellen (d) und ( e) PKA-UCNP-mikroinjiziert Zellen nach UV-Bestrahlung im Käfig. (f-j) Die optische Dichte (O.D) Bilder (a-e), bzw. abgeleitet. (k-o) Der entsprechenden Intensität Kurven entlang den blauen Pfeil. Der weiße Pfeil zeigt die microinjected Zelle. Die Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Fluoreszenzbilder von REF52 Zellen mit verschiedenen Formen der PKA mikroinjiziert. Zellen mit (einem) mikroinjiziert eingesperrt PKA-UCNP nach NIR Bestrahlung, (b) PEG-veredelten UCNP unter NIR Bestrahlung, und (c) eingesperrt PKA-UCNP ohne Bestrahlung. (d-f) Die hochkonvertiert Emission von UCNP (im gestrichelten Kasten) für (a-c). (g-i) Zusammengeführte Bilder der Stress Fasern (grün), Großbildschirmen Emissionen (rot) von komplexen UCNP und DAPI-Färbung der Zellkerne (blau). NIR Photoaktivierungen der Zellen erfolgte auf einer leuchtenden Fläche von 650 µm x520 µm mit einem 10 X-Objektiv. Die Fluoreszenzbilder wurden mit einem 40 X Objektiv erworben. Daher wurde die NIR-Strahlung-Bereich bis 150 µm X 120 µm reduziert, wie im gestrichelten roten Feld angegeben. (C) die Großbildschirmen Lumineszenz entnehmen. Für die Quantifizierung Studien mit ImageJ wurden O.D Bilder (j-l) bzw. aus (a-c), abgeleitet. Intensität Kurven entlang den blauen Pfeil in (j-l) gezeigt wurden (m-o) aufgetragen. Ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) wurde für dieses System beobachtet und gilt als eine positive Antwort. Dieser Ansatz war für alle Alexa 594-Phalloidin Färbung Quantifizierungen angewendet. Der weiße Pfeil zeigt die microinjected Zelle. Die Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Zuvor, Hofmann und Kollegen zufolge dramatische morphologische Veränderungen nach der Mikroinjektion des freien PKA19REF52 Zellen beobachtet wurden. In einer anderen Studie die Lawrence-Gruppe gezeigt, dass eingesperrte PKA aktiviert in Vivo, kann führt zu morphologischen Veränderungen und den Zerfall der Stress Fasern bei UV-Photolyse20. Früher berichtet über Ausbeutung hochkonvertiert UV-Licht zur Photoaktivierungen zeigten die Aktivierung der verschiedenen UCNP unterstützt, Käfig, kleine molekulare BIOeffektoren21,22,23. Allerdings muss ein Protokoll auf die wichtigste Klasse von Bioeffector, das Enzym mit UCNP-gestützte Photoaktivierungen entwickelt werden. Daher beschreiben wir in dieser Studie eine zellulärer Experiment-Protokoll, die die NIR Photoaktivierungen der Käfig PKA mit UCNPs enthält. In dieser NIR Photoaktivierungen Plattform wurde eingesperrte PKA20 auf der Oberfläche der Kieselsäure-beschichtete UCNPs immobilisiert verwendet, um die Machbarkeit des Controllings Transduktion Signalweg der Zelle mit NIR als Auslöser zeigen. REF52 Zellen mit einem Käfig PKA-UCNP mikroinjiziert zu konstruieren und mit NIR zeigte eine Wirkung auf Stress Faser Zerfall sowie morphologische Veränderungen in den Zellen bestrahlt. Darüber hinaus wurden Positive und Negative Kontrolle Experimente durchgeführt und bewiesen, dass die PKA-induzierten Weg zur Auflösung von Stress Fasern durch NIR Bestrahlung ausgelöst wird.
Die Instrument-Modifikation wird in dieser Handschrift beschrieben, während der PKA-Wert chemische Modifikation gut dokumentierten anderswo15. Wenn eine formschöne Experiment Fehlerbehebung erfordert, zunächst festzustellen, ob die Probleme von generiert werden: (i) die Protein-UCNP Komplex, Mikroinjektion (Ii) oder (Iii) optischer Messtechnik. Im Falle von Protein Photoaktivierungen Probleme: (1) stellen sicher, das die PKA ist aktiv, (2) bestätigen, dass der Käfig PKA Restaktivität ist < 5 % des ursprünglichen Wertes, (3) feststellen, dass die UV-uncaged PKA hat mindestens 50 % seiner Tätigkeit restauriert, (4) stellen sicher das der Käfig PKA-Wert wird auf der UCNP Oberfläche immobilisiert (führen Sie eine Bradford-Test), und (5) sicherstellen, dass der Käfig PKA-UCNP auch mindestens 50 % seiner Tätigkeit hat (mithilfe von UV-Bestrahlung) wiederhergestellt. Für die Mikroinjektion Probleme: (1) stellen Sie sicher, dass Nadelspitze ist offen und die Protein-UCNP-Lösung ist korrekt geladen. Platzieren Sie die geladene Nadel (Tip) am Mikroskop mit NIR Erregung Kanal. Wenn Großbildschirmen Fluoreszenz beobachtet wird, ist das Laden richtig. (2) injizieren Sie die Protein-UCNP in den Zellen und beobachten Sie der Fluoreszenzintensität von Co eingespritzte 5 6-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) Farbstoff und Großbildschirmen Korpuskel. Korrekte Injektion führt zu intensiven TAMRA und Großbildschirmen Partikel Fluoreszenz in den Zellen. Für Mikroskop optische Änderung Fehlersuche: (1) Entfernen der Objektivlinse schalten die NIR-Laser, und der thermischen Haufen Leistungssensor Meter auf Mikroskoptisch, NIR, Messen, die durch eine unsachgemäße Einstellung nicht blockiert werden sollen. (2) montieren Sie die Objektivlinse und eine transparente Unterseite Küvette gefüllt mit 10 mg/mL UCNP Lösung auf den Mikroskoptisch. Ein scharfer blauer Balken in der Lösung wird gesehen werden, wenn die Optik alles ordnungsgemäß installiert sind.
Mikroinjektion können nur eine begrenzte Anzahl von Zellen für die Analyse. Die Erfolgsquote der Injektion ist Operator (oder Erfahrung)-angewiesen, das ist eine große Einschränkung dieser Technik. Allerdings gibt es keine andere Möglichkeit, es so weit zu umgehen. Viele Wissenschaftler vermuten, dass die Verwendung von Partikel-Zelle Inkubation der Zellen zur Aufnahme der Partikel ermöglicht. Dies ist jedoch keinen Machbaren Ansatz. Auch wenn zelluläre Partikel Aufnahme auftritt und die Aufnahme-Menge reicht aus, wird es in Endosomen/Lysosomen, aber nicht in das Zytosol anreichern. Dieses spezielle Signal Transduction Enzym braucht befindet sich in der Zellflüssigkeit nicht Endosomen, um wirksam zu sein. Darüber hinaus Wenn PKA in einem perfekten Speicher-Puffer bei 37 ° C aufgelöst hat, dauert ihre Tätigkeit nicht nach Lagerung über Nacht. Die Enzymstabilität im Zellkulturmedium ist sogar noch kürzer, und es macht die Inkubation Ansatz nicht praktikabel.
Dies berichtet, dass instrumental Setup, Mikroinjektion und Kinase NIR Photoaktivierungen Protokoll nicht nur für chemisch modifizierte Kinase, sondern auch für andere Protein oder Enzym-Klassen in der Regel anwendbar sein sollte. Darüber hinaus wäre es sinnvoll in zelluläre Studien wo ist direkte UV-Exposition unerwünscht. Darüber hinaus kann der Käfig Bioeffector-UCNP-Komplex mit extrazellulären Ziele wie Membranproteine oder Membranrezeptoren, die intrazellulären Lieferung-Problem zu vermeiden und somit die Plattform für in-Vivo -Verwendung geltenden interagieren. Nach I.V. Injektion haben eingesperrte Proteinhormone oder therapeutischer Proteine die aktivierte Form von den Bioeffector nur NIR bestrahlten Regionen.
Mikroinjektion ist der wichtigste Schritt in diesem Protokoll. Vermeiden Sie für präzise Einspritzung Luftblasen während des Ladens der Nadel. Nach dem Laden sofort installieren Sie die Nadel in den Injektor und Tauchen Sie die Nadelspitze in das Medium an die Spitze der Nadel vor dem Austrocknen, verhindert die Verstopfung verursachen. Mikroinjektion Betreiber Fähigkeit ist entscheidend für eine höhere Injektionsrate der erfolgreichen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken der Nano-Wissenschaft und Technologie-Programm der Academia Sinica und das Ministerium für Wissenschaft und Technologie von Taiwan für die Finanzierung (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Ammonium hydroxide (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
