Summary
I detta protokoll, Bur proteinkinas A (PKA), en cellulära signaltransduktion bioeffector, var orörlig på en nanopartikel yta, microinjected i cytosolen och aktiveras av matas ut UV-ljus från nära infrarött (NIR) bestrålning, förmå nedströms stress fiber sönderfall i cytosolen.
Abstract
Uppkonvertering nanopartiklar (UCNP)-medierad ljusaktivering är ett nytt förhållningssätt till distans kontroll bioeffectors med mycket mindre fototoxicitet och med djupare vävnad penetration. Befintliga instrument på marknaden är dock inte lätt kompatibel uppkonvertering ansökan. Ändra det kommersiellt tillgängliga instrumentet är därför avgörande för denna forskning. I detta papper illustrera vi först ändringarna av en konventionell fluorimeter och fluorescens Mikroskop för att göra dem kompatibla för photon uppkonvertering experiment. Vi beskriver sedan syntesen av ett infrarött (NIR)-utlöst bur protein kinase A katalytisk subenhet (PKA) orörlig på ett UCNP-komplex. Parametrar för Mikroskop och NIR ljusaktivering förfaranden redovisas också. Efter den bur PKA-UCNP är microinjected i REF52 fibroblast celler, utlöser NIR bestrålning, som är signifikant bättre än konventionella UV-bestrålning, effektivt PKA signaltransduktion vägen i levande celler. Positiv och negativ kontroll experiment bekräftar dessutom att PKA-inducerad vägen leder till upplösningen av stress fibrer specifikt utlöses av NIR bestrålning. Användningen av protein-modifierat UCNP ger således en innovativ metod för att fjärrstyra ljus-modulerat cellulära experiment, där direkt exponering för UV-ljus måste undvikas.
Introduction
Kemiskt modifierade proteiner som kan vara photoactivated (t.ex. PKA bur proteiner) har utvecklats som ett framväxande fält i kemisk biologi att icke-invasivt manipulera intercellulära biokemiska processer1,2 ,3. Med ljus som en stimulans ger utmärkt spatiotemporal upplösning när aktivera dessa bur proteiner. UV-ljus kan dock orsaka oönskad morfologiska förändringar, apoptos och DNA skada celler4,5. Därför fokuserar senaste utvecklingen i utformningen av photocaging grupper på att aktivera photocleavage vid längre våglängd eller två-photon magnetisering att minska fototoxicitet, samt för att öka djup vävnad penetration6,7. Caging grupper som svarar på längre våglängd att låta oss att välja lämplig uncaging våglängder (dvskanaler) selektivt aktivera bioeffectors när två eller fler caging grupper är närvarande7. Med tanke på dessa användbara funktioner, är utveckla nya rött ljus photocaging grupper mycket viktiga uppströms arbete i fotokemiska metoder för biologiska studier alltifrån sondera mekanismerna av reaktioner på kontroll av cellulära aktiviteter8. Ändå, en två-photon caging grupp är normalt alltför hydrofoba på grund av den smält aromatiska Ringstrukturen och en caging grupp för synligt ljus är normalt metallorganiska, med aromatiska ligander. Hydrofoba/aromatiska egenskapen är inte lämplig när bioeffector är en protein eller enzym, denaturerar webbplatsen aktivering av enzym/protein och orsakar förlust av funktion, även om de konjugation och fotolys fortfarande arbetar på kemisk nivå2 ,9.
UCNPs är effektiv givare som konverterar NIR excitation ljuset till UV. Denna unika och fascinerande egenskap hos UCNPs har erbjudit realistiska lösningar på de utmaningar i samband med ljusaktivering och utlöste kontrollerad frisättning av små molekyler, inklusive folsyra10, cisplatin derivat11 , DNA/siRNA12, sampolymer blåsor13och ihåliga partiklar14. Dock till bäst av vår kunskap, har den UCNP-assisted ljusaktivering av enzymer eller proteiner inte testats hittills. Eftersom det inte finns något framgångsrika fall att använda rött ljus eller NIR till fotoaktiva ett enzym, uppmanades vi att utföra NIR-utlöst aktiveringen av en protein/enzym-konstruktion som består av kemiskt modifierad bur enzym komplex med en kvarts-belagd, lanthanide-dopade UCNP15. I denna studie var UCNP konjugerat med ett snabbt reagerande signaltransduktion kreatinkinas i form av bur PKA. PKA styr glykogensyntesen och cytoskeletal förordning som svarar på yttre stimuli via cykliskt adenosin fosfat (cAMP) reglering i cytosolen16. Vi studerade genomförbarheten av enzym aktivering i tidsmässiga och rumsliga seder i en cellulär experiment efter NIR bestrålning. Denna UCNP-assisted ljusaktivering plattform är en ny metod att photoactivate ett enzym som använder NIR och undviker oönskade signaltransduktion svaret från celler som orsakas av konventionella UV bestrålning2,4.
Det är mycket svårt att translocate stora bioeffectors (t.ex. proteiner) över cellmembranet att styra cellulär aktivitet. Även om partikel-orörlig protein kan vara lättare att translocate via endocytos i cytosolen, kan endocytos skadas eller försämras via endosomal brottsprovokation och åtföljande lysosomal nedbrytning2,4. Även om proteinet bur är fortfarande funktionell efter membran translokation, kanske flyttade beloppen inte tillräckligt för att utlösa den cellulära svar2,17. I skarp kontrast är Mikroskop en direkt och kvantitativ strategi att leverera stora bioeffectors till cytoplasman i cellen. Dessutom kräver UCNP-orörlig bioeffector matas ut ljus aktiveras. Optiska instrument kräver därför ytterligare modifiering för att mäta, visualisera och utnyttja uppkonvertering ljuset. I detta arbete, kommer leverans av en bur PKA-UCNP-komplex till en cell som använder Mikroskop och följande väsentliga spektroskopi och mikroskopi ändringar för NIR ljusaktivering att beskrivas i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: protokollet beskriver en detaljerad instrumentation modifikation uppkonvertering-assisted ljusaktivering, en syntetisk förfarande att generera bur PKA-UCNP, transmissionselektronmikroskopi (TEM) av den kiseldioxid-belagd UCNP och bur PKA-UCNP prover, UV och NIR fotolys setup, cell förberedelse, PKA-UCNP Mikroskop, en ljusaktivering studie och stress fiber färgningen av REF52 celler.
1. Fluorimeter Setup för uppkonvertering spektrum mätning
- installera en 4 X-objektiv bredvid kyvetten innehavaren av fluorescens spektrometern så att lasern är inriktad på mitten av kyvetten.
- Placera en avstämbara 0,5 - till 8-W 980-nm laser-diod 90° mot objektivet.
Varning: Föraren har behov att ha laser säkerhet kunskap och NIR laser skyddsglasögon. - Installera en full reflektans spegel i ljusbanan genomskärningen av objektiv och laser. Placera en svart anodiserat metallplatta att blockera fönstret excitation av spektroskopi och skydda inredelarna.
- Placera i kyvetten kiseldioxid-belagd UCNP lösning (0,2 - 0,6 mg/mL) i kyvetten hållaren så att en ljusa uppkonvertering balk kan visualiseras och kan användas för att justera den bästa ljus justeringen för spegel installation.
- Växla spektroskopin till luminiscens läge med lägsta PMT spänning inställning (justera till en högre inställning om signalen är för svag). Justera spegeln till bästa anpassning, där strålen på mitten av kyvetten och PMT plockar upp den starkaste signalen.
- Mät uppkonvertering spektrumet, efter justering, med inställningen för önskad effekt. Använda en termisk högen kraftmätare för att bygga en kalibreringskurva av lasereffekten mot den elektriska aktuella mätningen på laser strömförsörjningen. Ständigt kontrollera laserprestanda Kontrollera att prestandan är inom intervallet kalibrerad.
2. Mikroskopet Setup
Obs: följande inställningar fungerar för Mikroskop utrustat med ett tudelat optisk väg. Om användaren har för avsikt att installera en magnetisering ljuskälla växel tillbaka hamn att göra NIR laser och den halide lampan delar samma port, blockerar kollimator i hamnen tillbaka betydligt Niren eftersom den är utformad för att minska prov värme. Användaren måste göra ett svårt val: hålla kollimator och lider av mycket låga uppkonvertering effektivitet, eller ta bort kollimator och offra intensiteten av magnetiseringen ljus för epifluorescence.
Obs: ett cutaway-diagram som visar den ljusstrålen ordningen för en modifierad spectrofluorometer, microscopyen för uppkonvertering luminiscens och NIR fotolys läge och epifluorescence och UV fotolys läge och den experimentella setup använde för detta experiment illustreras i figur 2.
- Equip fluorescens Mikroskop med en metallhalidlampor ljus guide, regisserad tillbaka port.
Obs: I detta övre skikt ljusbanan där det finns en kub torn, en kuben position måste vara tom för NIR kommer från den underliggande ljusa sökvägen. - Installera en avstämbara 0,5 till 8,0 W 980 nm-laserdiod i högra porten, med den side-port kollimator öppna.
Obs: Detta förstorar den laser ljus plats till ca 500 µm i diameter när en 10 X objektiv används. Ta bort denna kollimator resulterar i en mikrometer-range ljusfläcken och gör NIR cell bestrålning opraktiskt. Detta kollimator är NIR-transparent. - Installera en dichroic spegel (850-nm kort-pass) och en excitationsfilter (950 nm lång-pass) i den underliggande ljusa sökvägen.
- Använda en UCNP lösning för att visualisera NIR ljusfläcken. Justera positionen för laser att centrera NIR ljusstrålen i synfältet att avsluta justeringen.
3. Förberedelse och karakterisering av Caged PKA-UCNP konstruera
- Inkubera rekombinant PKA (9 µM) med 0,5 mM 2-nitrobenzylbromide (NBB) i kasse buffert (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl och 10 mM MgCl 2, pH 8,5) för 1-2 h vid 25 ° C. Quench den överskjutande NBB med 10 mM dthiothreitol (DTT) och sedan dialyze mot 4-(2-hydroxietyl) piperazin-1-ethanesulfonic syra (HEPES) buffert (10 mM, pH 7.5) för att ta bort överflödig reagenser och salter.
Obs: Den caging lösningen pH sänks från 8,5 till 7,5 under dialys med HEPES pH 7.5 för efterföljande immobilisering reaktionen. - Mix lanthanide salter-Y(CH3CO2) 3 hydrat (99,9%, 0.4527 g, 1,38 mmol), Yb (CH 3 CO 2) 3 hydrat (99,9%, 0.2533 g, 0.60 mmol) och Tm (CH 3 CO 2) 3 hydrat (99,9%, 0.0168 g, 0,02 mmol)-i octadecene (30 mL) och oljesyra (12 mL), värm blandningen till 115 ° C i 30 min, och kyl dem till 50 ° C. Nästa, lös reaktionsblandningen i en metanollösning (20 mL) med 0,2 g (5,0 mmol) NaOH pellet och 0.2964 g (8 mmol) av ammonium fluoride av ultraljudsbehandling för 15 min. öka reaktion temperatur till 300 ° C för att få den UCNP kärnan (β-NaYF 4 : 1,0% Tm 3 + / 30% Yb 3 +) nanopartiklar.
- Lös den core nanopartiklar (25 mg) med CO-520 (0,5 mL) i cyklohexan (10 mL). Lägg till ammoniak (wt 30% v/v, 0,08 mL) och tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) och tillämpa ständig omrörning för 12 timmar vid rumstemperatur för att få den kiseldioxid-belagd β-NaYF 4: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + core nanopartiklar.
- Inkubera i PKA (6 nmol) eller bur PKA (6 nmol) med UCNP (1 mg) 15 i HEPES buffert (10 mM, pH 7.5) vid 4 ° C för 3 h att immobilisera PKA på silica-belagd UCNP via elektrostatiska växelverkan.
- Filtrera blandningen med PVDF filter (0,45 ìm), Centrifugera vid 17 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C, och redisperse pelleten i HEPES (50 µL, 10 mM, pH 7.5) innehållande 0,1% protein stabilisator för att erhålla renat PKA-UCNP komplexet. Centrifugera vid 17 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C och samla in supernatanten för en Bradford analys i en 1,5 mL tub.
- Analysera den gränslösa PKA i supernatanten Sparad från steg 3,5 med en Bradford-analys för att back-beräkna PKA substitution nivån på UCNP partiklarna, som normalt har en substitution ~ 4,5 nmol av PKA per mg partikel.
Obs: Bradford analysen avslöjar en stark blå färg på pellets, vilket tyder på en hög nivå och stabil protein immobilisering utan desorption, medan den supernatant fraktionen av caged PKA-UCNP lösning visar en färg liknande till HEPES buffert ( figur 4 c-4e).
4. Karakterisering
Obs: Kinas analysen används för att kvantifiera den specifika aktiviteten av pyruvat Kinas. I korthet resulterar fosforyleringen av peptiden, som är kopplat till Pyruvat Kinas och laktatdehydrogenas, i oxidationen av NADH. Bildandet av den senare övervakas genom att mäta minskningen av NADH absorbans vid 340 nm.
- Bestämma aktiviteten av PKA och PKA-UCNP i en 60 µL total volym av assay blandning innehållande 4-morpholinepropanesulfonic syra (moppar, 100 mM, pH 7.5), KCl (100 mM), phosphoenolpyruvate (PEP, 1 mM), adenosintrifosfat (ATP, 1 mM), β - nikotinamidadenindinukleotid, reducerad form (NADH, 0,8 mM), magnesiumklorid (MgCl 2, 1 mM), kemptide (0,4 mM) och en pyruvat Kinas/laktat dehydrogenas blandning (30/40 enheter av PK/LDH).
- Mäta minskningen av NADH absorbansen över tid efter tillägg av PKA lösning (2 µL) till assay blandningen. Beräkna lutningen på linjen till direkt avspeglar aktiviteten av den Kinas mäts.
- Mäter aktiviteten av PKA-UCNP 15 och den övergripande verksamhet, som ska matchas väl med multiplikation produkten av infödda PKA-specifik aktivitet och det beräknade beloppet PKA bestrukna.
5. Fotolys Setup
- åtgärUre ljusets alla kraft källor med hjälp av en termisk högen sensor och beräkna driva tätheter (PD = effekt (W) / område (cm 2)) 18 baserat på ljus plats området.
- Utför in vitro- UV fotolys experiment på ett kommersiellt system med en 365 nm LED (200 mW/cm 2) 15.
- För UV ljusaktivering på Mikroskop scenen, belysa PKA-UCNP lösningen med excitation ljus filtreras av en kommersiell cube 15.
Obs: Drivatätheten är ~ 15 mW/cm 2, utan objektiv fokus. - För in vitro- NIR ljusaktivering på Mikroskop scenen, belysa PKA-UCNP lösningen med en 980 nm laser med anpassade uppkonvertering filter/spegel inställningar installerad på lower-tier ljusstrålen, en dichroic spegel (850 nm kort-pass), och en excitationsfilter (950 nm lång-pass).
Obs: Utdata drivatätheten är 5 W/cm 2 innan 4 X objektiv fokuserar. Drivatätheten uppskattas till ~ 68 W/cm 2 efter 4 X objektiv fokuserar.
6. Cell provberedning och Mikroskop av PKA-UCNP komplex
- förfilter proverna genom ett 0,45 µm filter efter PKA immobilisering (steg 3.5).
- Inkubera cellerna i 10% fetalt bovint serum (FBS) som innehåller l-15 medium under mikroskop för stabil pH-kontroll utanför inkubatorn.
Obs: för att bekräfta Mikroskop slutförandet, Co injicera den infödda PKA-UCNP, Bur PKA-UCNP eller PEGylated UCNP (7,5 mg/mL) 15 med 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) (10 µM) i celler. - Justera koncentrationen av PKA-UCNP partiklarna sådan att, efter Mikroskop, den cytosoliska koncentrationen är 1-3 μM PKA - en fysiologisk koncentrationsintervall för PKA i en cell, med antagandet att injektionsvolymen är 1/10 av cellulära volym .
- Utför Mikroskop in i cellerna (steg 6,2) använder en microinjector enhet tillsammans med en 1-axlig hydraulisk micromanipulator ( figur 3).
- Använda en digital manometer att övervaka trycket av microinjector är i driftområdet (~ 50-200 hPa) och försegla dispenser ventilen i en anpassad påtryckningar kammare att ge ersättning tryck för Mikroskop. Dra tillbaka nålen med hjälp av avdragare.
- Upprätthålla Injekteringstryck mellan 50 och 75 hPa, med en injektion tid av 200-300 ms och ersättning trycket vid 15 hPa att förhindra odlingsmedium återflödet in nålen genom kapillärkraften.
- Undersöka tip öppningarna av nålarna så att de har en yttre diameter mellan 1,3 och 1,5 µm, som kan bekräftas genom att ta bilder med en 40 x objektiv.
- Tvätta cellerna med 2 mL l-15-medium som innehåller 10% FBS efter Mikroskop. Observera cellulära fluorescens imaging från 5 (6) - carboxytetramethyl - rodamin (TAMRA) att bekräfta Mikroskop slutförande.
7. Ljusaktivering av Caged PKA-UCNP med UV- eller NIR ljus i levande celler
- för UV ljusaktivering efter den PKA-UCNP Mikroskop, växa de REF52 cellerna på en 3,5 µm maträtt, placera dem på Mikroskop scenen och bestråla dem med UV-ljus filtreras genom kuben för 3 min utan objektiv fokus.
Obs: REF52 celler bibehölls DMEM innehållande 10% FBS vid 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator och celler var subcultured när konfluens nådde till 90% varje 2-3 dagar. - För NIR ljusaktivering efter PKA-UCNP Mikroskop, belysa cellerna på en 980-nm laser från underliggande filter/spegel inställningar, som beskrivs i steg 5,4.
Obs: Densitet uteffekten är 5 W/cm 2 innan 10 X objektiv fokuserar och uppskattas till 300 W/cm 2 efter 10 x objektiv fokuserar. Uppkonvertering är en process som kräver en hög photon densitet, särskilt när en större anti-Stoke Skift behövs. Därför fokuserar behövs under ljusaktivering. - När en större ljusfläcken (650 µm x 520 µm) behövs, bestråla dessa celler med NIR fokuseras av en 10 x objektiv med en kollimator för 15 min. Tillåt för en 5 min mörka intervall efter varje 5-min. bestrålning att undvika värme.
Obs: När en hög rumslig upplösning (subcellulär ljusfläcken) behövs, använda det 40 X-objektivet med ett hål som installeras i exit slutet av guiden ljus för att generera en subcellulär-dimension ljus spot (5 µm x 4 µm). I detta fall, 1 s av bestrålning är nog för NIR ljusaktivering på grund av det höga flödet av fotoner. - Efter UV eller NIR fotolys, låta cellerna återhämta sig i en 5% CO 2 inkubator vid 37 ° C för 1 h i komplett medium att generera cellulära svar. Därefter fixa dem i 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD/fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för 20 min innan ytterligare färgning.
FÖRSIKTIGHET: PARAFORMALDEHYD är mycket giftigt; Undvik kontakt med hud, ögon eller slemhinnor. Undvik att inandas pulvret under mätning och förberedelse.
8. Visualisering av Stress Fiber sönderfall orsakas av NIR ljusaktivering
- efter fixering, använda Alexa 594-phalloidin (tillsätt 5 µL av 6,6 µM stamlösningen till 200 µL av PBS för färgning, inkubera i 25 min i rumstemperatur) att färga och visualisera stress fibrerna. Visualisera bilderna av Alexa 594-phalloidin (Ex 581 nm/Em 609 nm) med hjälp av filter.
- Inkubera cellerna för 5 min i 4 ', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) vid rumstemperatur. Efter färgning, tvätta av prov med PBS och separat ta fluorescerande bilder av stress fibrer och atomkärnor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utformningen av den bur enzym-UCNP konstruktion illustreras i figur 1. Enzymet PKA var först reagerade med 2-nitrobenzyl metylbromid att generera en inaktiv bur PKA, och det var sedan elektrostatiskt orörlig på ytan av UCNP. UCNPs avger lampan matas ut och följaktligen klyva fotolytiskt o-nitrobenzyl grupperna på Cys 199 och Cys 343, genererar den aktiveras PKA. TEM bilder och Bradford assay bekräftat att de PKA och bur PKA var orörlig på ytan av UCNPs, och Kinas aktiviteten av caged PKA-UCNP lösning efter UV ljusaktivering var analyseras (figur 4). Efter PKA immobilisering, en dynamisk ljusspridning instrument visade storleken och zeta potential av PKA-partikel komplexet vara 120 nm och -16,0 mV, respektive. Bradford haltbestämning av PKA-UCNP lösningen visade en stark lila färg på partiklarna, vilket tyder på en hög nivå och stabil protein immobilisering.
REF52 rat embryonala fibroblast celler valdes ut för studien av ljusaktivering i cellulära experimentet. I detta experiment, kan PKA vägen slås på av endogena PKA-aktivering (som utlöses av inkubering av cell-permeable 8-CPT-cAMP) eller Mikroskop av den aktiva eller triggerable PKA. Aktiveras PKA (med eller utan partikel immobilisering) desintegrerar stress fibrerna och exponerar mer fintrådiga aktin (F-aktin) yta och därmed fluorophore-märkt phalloidin, som binder starkt till F-aktin, vilket ger en högre färgning signal. Efter 8-CPT-lägret inkubation eller Mikroskop gratis PKA, aktivt PKA-UCNP eller UV-aktiveras PKA-UCNP (som positiva-kontroll experiment) bekräftat vi förekomsten av stark stress fiber sönderfall orsakas av PKA väg aktivering (figur 5). Både endogena PKA och microinjected PKA studier visar hela-cell stress fiber sönderfall, medan partikel-orörlig PKA (aktivt PKA-UCNP och UV-aktiveras PKA-UCNP) visar stress fiber sönderfall endast på Mikroskop platsen, ytterligare tyder på stabil immobilisering av PKA på UCNPs. För NIR ljusaktivering experimentet, efter Mikroskop den bur PKA-UCNP och NIR bestrålning, UCNPs avger matas ut ljus och klyva o-nitrobenzyl grupperna på Cys 199 och Cys 343. Följaktligen de generera den aktiveras PKA, desintegrerade stress fibrer och ger en högre signal av fluorophore-märkt phalloidin färgning (figur 6). Negativ-kontroll experiment på REF52 celler microinjected med UCNP utan den bur PKA och sedan NIR-bestrålade, liksom REF52 celler med bur PKA-UCNP i frånvaro av bestrålning, visade ingen effekt på stress fiber integritet.
Figur 1 . Illustration av Caged PKA-UCNP Design och uppkonvertering-assisted PKA Uncaging. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Ett Cutaway-Diagram som visar systemet ljusbanan. (en) ändrad spectrofluorometer och (b) Mikroskop för uppkonvertering luminiscens och NIR fotolys läge (vänster) och epifluorescence och UV fotolys läge (höger), samt deras experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Experimentella Setup för Mikroskop. Hållaren för injektion är tillsammans med en en-axel olja hydrauliska micromanipulator i vinkel mellan 30° och 45°. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Bekräftelse av PKA immobilisering på UCNP. TEM bilder av (en) silica-belagda UCNP och (b) bur PKA-orörlig UCNP; Bradford haltbestämning av (c), HEPES buffert, (d), pelleten bråkdel resuspension av caged PKA-UCNP lösning, och (e), supernatanten bråkdel av caged PKA-UCNP lösning; och (f) Kinas aktivitet haltbestämning av caged PKA-UCNP lösning efter UV ljusaktivering. Denna siffra har återgivits från Gao, H.-D. o.a. efter uttryckligt tillstånd erhölls från förlaget, American Chemical Society. Skalstapeln = 20 nm vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : Fluorescens bilder av Stress Fiber färgning (grön) och DAPI färgning av atomkärnor (blå) av REF52 celler, visar Stress Fiber sönderfall och morfologiska förändringar utlöses av olika PKA aktiveringen. (en) obehandlat celler, (b) 8-(4-Chlorophenylthio) adenosin 3', 5'-cykliskt monofosfat (8-CPT-cAMP)-behandlade celler, (c) aktiva PKA-microinjected celler, (d) aktiva PKA-UCNP-microinjected celler och ( e) bur PKA-UCNP-microinjected celler efter UV-strålning. (f-j) Optisk densitet (ytterdiameter) bilderna härrör från (a-e), respektive. (k-o) Motsvarande intensitet kurvor längs den blå pilen. Den vita pilen visar cellen microinjected. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: Fluorescens bilder av REF52 celler Microinjected med olika PKA former. Celler som microinjected med (en) bur PKA-UCNP efter NIR bestrålning, (b), PEG-ympade UCNP under NIR bestrålning, och (c) bur PKA-UCNP utan bestrålning. (d-f) Matas ut utsläpp av UCNP (i rutan streckad) för (a-c). (g-i) Sammanslagna bilder av stress fibrer (grön), uppkonvertering utsläpp (röd) av den komplexa UCNP och DAPI färgning av atomkärnor (blå). NIR ljusaktivering av cellerna genomfördes vid en lysande yta på 650 µm x520 µm med hjälp av en 10 X objektiv. Fluorescens bilderna förvärvades använder ett 40 X-objektiv. Därmed sänktes området NIR bestrålning till 150 µm x 120 µm, som anges i rutan streckad röd. Den uppkonvertering luminiscens kan ses i (c). För kvantifiering studier använder ImageJ, härleddes OD bilder (j-l) från (a-c), respektive. Intensitet kurvor längs den blå pilen som visas i (j-l) var ritade i (m-o). En hög signal-brus-förhållande (S/N) observerades för detta system och anses vara ett positivt svar. Detta tillvägagångssätt tillämpades för alla Alexa 594-phalloidin färgning kvantifieringar. Den vita pilen visar cellen microinjected. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare, Hofmann och medarbetare fann att dramatiska morfologiska förändringar observerades i REF52 celler efter Mikroskop av gratis PKA19. En annan studie visat gruppen Lawrence att bur PKA kan vara aktiverad i vivo, leder till morfologiska förändringar och upplösningen av stress fibrer när de utsätts för UV fotolys20. Tidigare rapporter om att utnyttja matas ut UV-ljus för ljusaktivering visade aktivering av den flera UCNP-assisted, Bur, små molekylära bioeffectors21,22,23. Ett protokoll för att använda UCNP-assisted ljusaktivering på den viktigaste klassen av bioeffector, enzymet, behöver dock fortfarande utvecklas. Därför i denna studie beskriver vi en cellulär experiment protokoll som innehåller den NIR ljusaktivering av caged PKA med UCNPs. I denna NIR ljusaktivering plattform användes bur PKA20 orörlig på ytan av kiseldioxid-belagd UCNPs att demonstrera möjligheten att styra de transduktion signalvägen i cellen använder NIR som en utlösande faktor. REF52 celler microinjected med en bur PKA-UCNP konstruera och bestrålas med NIR visade en effekt på stress fiber sönderfall, samt morfologiska förändringar i cellerna. Dessutom var positiv och negativ kontroll experiment utförs och visat att PKA-inducerad vägen leder till upplösningen av stress fibrer utlöses av NIR bestrålning.
Instrumentet ändringen beskrivs i detta manuskript, medan PKA kemisk modifiering är väldokumenterade någon annanstans15. Om en väl utformade experiment kräver felsökning, först identifiera om problemen genereras från: a protein-UCNP komplex, (ii) Mikroskop eller (iii) optisk instrumentering. Vid protein ljusaktivering problem: (1) gör visst som PKA är aktiv, (2) bekräfta att den bur PKA har kvarvarande verksamhet som är < 5% av dess ursprungliga värde, (3) fastställa att den UV-uncaged PKA har minst 50% av dess aktivitet återställd, (4) göra säker som den bur PKA är orörlig på UCNP yta (utföra en Bradford assay), och (5) se till att den bur PKA-UCNP också har minst 50% av dess aktivitet som återställde (genom att utföra UV-bestrålning). För Mikroskop problem: (1) Kontrollera att att nålspetsen finns öppna och protein-UCNP lösningen är korrekt laddat. Placera laddade nålen (spets) på ett Mikroskop med en NIR excitation kanal. Om uppkonvertering fluorescens observeras, är lastning korrekt. (2) injicera den protein-UCNP i cellerna och observera fluorescensintensiteten hos Co injicerade 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) färgämne och uppkonvertering partikel. Ordentlig injektion resulterar i intensiv TAMRA och uppkonvertering partikel fluorescens i cellerna. För Mikroskop Optisk modifiering felsökning: (1) ta bort objektivet, slå på NIR laser och sätta termisk högen power mätaren sensorn på Mikroskop scenen att mäta Niren, som inte ska blockeras av en felaktig inställning. (2) installera objektivet och lägga en transparent-botten kyvetten fylld med 10 mg/mL UCNP lösning på Mikroskop scenen. En skarp blå balk i lösningen kommer att ses om optiken är alla korrekt installerade.
Mikroskop kan endast ge ett begränsat antal celler för analys. Injektion framgång är operatör (eller erfarenhet)-beroende, vilket är en stor begränsning av denna teknik. Dock finns det inget annat sätt att kringgå det hittills. Många forskare föreslår att användningen av partikel-cell inkubation gör cellerna att upptag partiklarna. Detta är dock inte en genomförbar strategi. Även om cellulära partikel upptag uppstår och upptag beloppet är tillräckligt, kommer det ackumuleras i endosomes/lysosomer, men inte i cytosolen. Detta specifika signaltransduktion enzym måste finnas i cytosolen, inte endosomes, ska vara effektivt. Dessutom när PKA är upplöst i en perfekt lagring buffert vid 37 ° C, sista dess aktivitet inte efter övernattning lagring. Enzymet stabilitet i cellodlingsmedium är ännu kortare, och det gör metoden inkubation opraktiskt.
Detta rapporterade instrumental setup, Mikroskop och Kinas NIR ljusaktivering protokoll bör vara allmänt tillämpliga, inte bara för kemiskt modifierade kinase, men också för andra protein eller enzym klasser. Dessutom skulle det vara användbar i cellulära studier där direkt UV-exponering är önskvärt. Dessutom kan bur bioeffector-UCNP komplexet interagera med extracellulära mål, såsom membranproteiner eller membranreceptorer, undvika intracellulära leverans problemet och göra plattformen gäller för in-vivo användning. Efter I.V. injektion har bur proteinhormoner eller terapeutiska proteiner aktiverad form av bioeffector endast i NIR-bestrålade regioner.
Mikroskop är det mest kritiska steget i detta protokoll. För exakt injektion, undvika bubblor under nålen lastning. Efter lastning, omedelbart installera nålen i injektorn och fördjupa nålspetsen i mediet att förhindra kanylspetsen från torkning, som kommer att orsaka igensättning. Mikroskop operatören skicklighet är avgörande för en framgångsrik injektion högre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar den Nano Science och Technology Program av Academia Sinica och ministeriet för vetenskap och teknik i Taiwan för finansiering (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Ammonium hydroxide (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
