Summary
In questo protocollo, gabbia della proteina chinasi A (PKA), un bioeffector di trasduzione del segnale cellulare, era immobilizzata su una superficie di nanoparticelle, microiniettata nel cytosol e attivata da upconverted UV luce da irradiazione di vicino infrarosso (NIR), che inducono disintegrazione di fibra a valle dello stress nel citosol.
Abstract
Upconversion delle nanoparticelle (UCNP)-mediata fotoattivazione è un nuovo approccio in remoto il controllo bioeffectors con molto meno fototossicità e con più profonda penetrazione del tessuto. Tuttavia, la strumentazione esistente sul mercato non è facilmente compatibile con upconversion applicazione. Pertanto, modificando lo strumento disponibile in commercio è essenziale per questa ricerca. In questa carta, illustriamo prima le modifiche di un fluorimetro convenzionale e microscopio a fluorescenza per renderli compatibili per gli esperimenti di upconversion di fotone. Descriviamo quindi la sintesi di un vicino-infrarosso (NIR)-attivato in gabbia proteina chinasi A sola subunità catalitica (PKA) immobilizzati su un complesso UCNP. Parametri per microiniezione e NIR fotoattivazione procedure inoltre sono segnalati. Dopo il PKA-UCNP in gabbia è microiniettati in cellule del fibroblasto REF52, l'irradiazione di NIR, che è significativamente superiore all'irradiazione UV convenzionale, attiva in modo efficiente la via di trasduzione del segnale PKA in cellule viventi. Inoltre, esperimenti di controllo positivi e negativi confermano che la via di PKA-indotta che conduce alla disintegrazione delle fibre di stress specificamente è innescata da irradiazione di NIR. Così, l'uso di UCNP proteina-modificato fornisce un approccio innovativo per il controllo remoto esperimenti cellulari luce modulata, in cui l'esposizione diretta ai raggi UV deve essere evitato.
Introduction
Proteine chimicamente modificati che possono essere fotoattivazione (ad es., proteine PKA in gabbia) sono state sviluppate come campo emergente in biologia chimica non invadente manipolare i processi biochimici intercellulari1,2 ,3. Utilizzando la luce come uno stimolo fornisce un'eccellente risoluzione spazio-temporale durante l'attivazione di questi ingabbiati proteine. Tuttavia, la luce UV può causare indesiderati cambiamenti morfologici, apoptosi e danno del DNA in cellule4,5. Quindi, recenti sviluppi nella progettazione dei gruppi di photocaging di concentrano sull'attivazione photocleavage lunghezza d'onda o due-fotone eccitazione per ridurre fototossicità, nonché per aumentare la penetrazione dei tessuti profondi6,7. Attivare gruppi di ingabbiamento che rispondono alla lunghezza d'onda maggiore, permettendoci di scegliere adatto uncaging lunghezze d'onda (cioè, canali) a selettivamente bioeffectors quando due o più gruppi di ingabbiamento sono presenti7. Date queste caratteristiche utili, lo sviluppo di nuovi gruppi di luci rosse photocaging è un lavoro molto importante a Monte in fotochimiche metodologie per gli studi biologici che vanno da sondare i meccanismi delle reazioni al controllo di attività cellulari8. Tuttavia, un gruppo di ingabbiamento del due-fotone è normalmente troppo idrofobico a causa della struttura fusa anello aromatico, e un gruppo di ingabbiamento di luce visibile è normalmente organometallico, con ligandi aromatici. Questa proprietà idrofobe/aromatico non è adatta quando la bioeffector è una proteina o un enzima, che denatura il sito di attivazione della proteina/enzima e causa la perdita di funzione, anche se la coniugazione e la fotolisi continuano a funzionare a livello chimico2 ,9.
UCNPs sono efficaci trasduttori che convertono la luce di eccitazione di NIR a UV. Questa proprietà unica e affascinante di UCNPs ha offerto risoluzioni realistici per affrontare le sfide associate fotoattivazione e attivato il rilascio controllato di piccole molecole, tra cui l'acido folico10, cisplatino derivati11 , DNA/siRNA12, copolimero vescicole13e particelle cava14. Tuttavia, al meglio della nostra conoscenza, il UCNP-assistita fotoattivazione di enzimi o proteine è non stato testato finora. Perché non esiste nessun caso di successo dell'utilizzo di luce rossa o NIR per fotoattivi un enzima, ci hanno richiesto di eseguire l'attivazione di un costrutto di proteine/enzimi composto da complessi di chimicamente modificati degli enzimi in gabbia con un silice rivestite, NIR-innescato drogato con lantanidi UCNP15. In questo studio, il UCNP è stato coniugato con una reazione rapida chinasi di trasduzione di segnale sotto forma di PKA in gabbia. PKA controlla la sintesi del glicogeno e regolazione del citoscheletro che risponde agli stimoli esterni tramite regolamento di fosfato (accampamento) adenosina ciclica nel cytosol16. Abbiamo studiato la fattibilità di attivazione enzimatica in maniere temporale e spaziale in un esperimento cellulare dopo irradiazione di NIR. Questa piattaforma di fotoattivazione assistita da UCNP è una nuova metodologia per photoactivate un enzima utilizzando NIR ed evita la risposta di trasduzione del segnale indesiderato dalle cellule causata da convenzionale UV irradiazione2,4.
È molto difficile traslocano nel grande bioeffectors (ad es., proteine) attraverso la membrana cellulare per controllare l'attività cellulare. Sebbene immobilizzata particella proteina potrebbe essere più semplice traslocano tramite endocitosi nel cytosol, endocitosi possono essere danneggiati o deteriorati via endosomal allettamento e il conseguente degradazione lisosomiale2,4. Anche se la proteina in gabbia è ancora funzionante dopo traslocazione di membrana, gli importi spostati potrebbero non essere sufficiente a innescare la risposta cellulare2,17. In netto contrasto, microiniezione è un approccio diretto e quantitativo per offrire grande bioeffectors nel citoplasma della cellula. Inoltre, bioeffector UCNP-immobilizzata richiede luce upconverted da attivare. Pertanto, la strumentazione ottica richiede ulteriori modifiche per misurare, visualizzare e utilizzare la luce upconversion. In questo lavoro, la consegna di un complesso di PKA-UCNP in gabbia per una cella mediante microiniezione e le seguenti modifiche essenziali di spettroscopia e microscopia per NIR fotoattivazione descriveremo in dettaglio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: il protocollo descrive una modifica di strumentazione dettagliata per fotoattivazione assistita upconversion, una procedura sintetica per generare in gabbia PKA-UCNP, microscopia elettronica di trasmissione (TEM) della UCNP rivestite con silice e in gabbia PKA-UCNP esempi, installazione di fotolisi UV e NIR, preparazione delle cellule, microiniezione di PKA-UCNP, uno studio di fotoattivazione e la colorazione della fibra lo stress delle cellule di REF52.
1. Setup fluorimetro per Upconversion spettro misura
- installare un 4 X obiettivo obiettivo accanto al titolare del cuvetta dello spettrometro di fluorescenza in modo che il laser è focalizzato sulla metà della cuvetta.
- Inserire un diodo laser sintonizzabile di 980 nm 0,5 - 8 W 90° contro la lente obiettiva.
Attenzione: L'operatore deve avere conoscenza di sicurezza laser e indossare occhiali laser NIR. - Installare uno specchio completo riflettanza nell'intersezione percorso della luce di laser e la lente dell'obiettivo. Collocare una lastra di metallo anodizzata nero per bloccare la finestra di eccitazione di spettroscopia e per proteggere le parti interne.
- Disponga la provetta della soluzione UCNP rivestite con silice (0,2 - 0,6 mg/mL) nel supporto per cuvette affinché un fascio luminoso upconversion può essere visualizzato e può essere utilizzato per regolare l'allineamento di luce migliore per installazione specchio.
- Passare la spettroscopia alla modalità di luminescenza con impostazione di tensione minima PMT (regolare ad un livello superiore, se il segnale è troppo debole). Regolare lo specchietto per l'allineamento migliore, dove il fascio è al centro della provetta e la PMT preleva il segnale più forte.
- Misurare lo spettro di upconversion, dopo l'allineamento, con l'impostazione desiderata. Utilizzare un misuratore di potenza termica mucchio per costruire una curva di calibrazione della potenza del laser contro la lettura corrente elettrica sull'alimentazione elettrica del laser. Controllare costantemente le prestazioni del laser per assicurarsi che le prestazioni sono all'interno della gamma calibrata.
2. Installazione di microscopio
Nota: l'impostazione seguente funziona per microscopi dotate del percorso ottico a due livelli. Qualora l'utente intenda installare un interruttore di sorgente luminosa di eccitazione nella porta posteriore per rendere il laser NIR e la lampada di alogenuro di condividere la stessa porta, il collimatore in porta posteriore significativamente bloccherà il NIR perché è progettato per ridurre il riscaldamento del campione. L'utente deve fare una scelta difficile: mantenere il collimatore e soffrono di efficienza molto bassa upconversion, o rimuovere il collimatore e sacrificare l'intensità della luce per l'epifluorescenza eccitazione.
Nota: un diagramma di cutaway Mostra lo schema di percorso della luce per una spettrofluorimetro modificata, la microscopia per upconversion luminescenza e modalità di fotolisi NIR e per epifluorescenza e modalità di fotolisi UV e la messa a punto sperimentale usato per questo esperimento sono illustrati nella Figura 2.
Guida- dotare il microscopio a fluorescenza con un luce ad alogenuri metallici, diretto nella parte posteriore porta.
Nota: In questo percorso di luce di livello superiore dove c'è una torretta di cubo, un cubo posizione deve essere vuota per consentire NIR provenienti dal percorso della luce. livello inferiore - Installare un diodo laser nm di 980 W 0.5 a 8.0 sintonizzabile nella porta destra, con il collimatore di porta laterale aperta.
Nota: Questo allarga il laser luce spot per circa 500 µm di diametro, quando viene utilizzato un obiettivo obiettivo 10x. Rimuovendo questo collimatore si traduce in una macchia luminosa di gamma di micrometro e rende impraticabile l'irradiazione delle cellule NIR. Questo collimatore è NIR-trasparente. - Installare uno specchio dicroico (passaggio breve 850 nm) e un filtro di eccitazione (950 nm long-pass) nel percorso della basso-livello luce.
- Utilizzare una soluzione UCNP per visualizzare il punto luce NIR. Regolare la posizione del laser per centrare il fascio di luce NIR nel campo visivo per completare l'allineamento.
3. Preparazione e caratterizzazione di PKA-UCNP in gabbia costruire
- Incubare ricombinante PKA (9 µM) con 0,5 mM 2-nitrobenzylbromide (NBB) in ingabbiamento buffer (20 mM Tris-HCl, NaCl 100 mM e 10 mM MgCl 2; pH 8,5) per 1-2 h a 25 ° C. Quench La NBB in eccesso con 10 mM dthiothreitol (DTT) e poi Dializzare contro 4-(2-idrossietil) tampone acido piperazina-1-etansolfonico (HEPES) (10 mM, pH 7.5) per rimuovere i reagenti in eccesso e sali.
Nota: Il pH della soluzione messa in gabbia è abbassato da 8,5 a 7.5 durante la dialisi con pH HEPES 7.5 per la reazione successiva immobilizzazione. - Mix i lantanidi sali-Y(CH3CO2) 3 idrato (99,9%, 0,4527 g, 1,38 mmol), Yb (CH 3 CO 2) 3 idrato (99,9%, 0,2533 g, 0.60 mmol) e Tm (CH 3 CO 2) 3 idrato (99,9%, 0,0168 g, 0.02 mmol)-in octadecene (30 mL) e l'acido oleico (12 mL), scaldare la miscela a 115 ° C per 30 min e li raffreddare a 50 ° C. Successivamente, sciogliere la miscela di reazione in una soluzione metanolica (20 mL) con 0,2 g (5,0 mmol) di NaOH pellet e 0,2964 g (8 mmol) di fluoruro di ammonio di sonicazione per 15 min. di aumentare la temperatura di reazione a 300 ° C per ottenere il nucleo UCNP (β-Sorbetto_limone 4 : 1.0% Tm 3 + / 30% Yb 3 +) nanoparticelle.
- Sciogliere le nanoparticelle core (25 mg) con CO-520 (0,5 mL) in cicloesano (10 mL). Aggiungere ammoniaca (wt 30% v/v, 0,08 mL) e tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) e applicare sotto costante agitazione per 12 h a temperatura ambiente per ottenere il rivestite con silice β-Sorbetto_limone 4: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + nanoparticelle core.
- Incubare la PKA (6 nmol) o in gabbia PKA (6 nmol) con UCNP (1 mg) 15 in tampone HEPES (10 mM, pH 7.5) a 4 ° C per 3 h immobilizzare la PKA su rivestite con silice UCNP tramite interazioni elettrostatiche.
- Filtrare la miscela utilizzando filtro PVDF (0,45 µm), centrifuga a 17.000 x g per 10 min a 4 ° C e redisperse il pellet in HEPES (50 µ l, 10 mM, pH 7.5) contenente 0,1% proteina stabilizzante per ottenere il complesso di PKA-UCNP purificato. Centrifugare a 17.000 x g per 10 min a 4 ° C e raccogliere il surnatante per un'analisi di Bradford in una provetta da 1,5 mL.
- Analizzare la PKA illimitata nel surnatante salvati dal passaggio 3.5 con un'analisi di Bradford per retro-calcolare il livello di sostituzione di PKA sulle particelle UCNP, che normalmente hanno un livello di sostituzione di ~ 4,5 nmol di PKA per mg di particella.
Nota: L'analisi di Bradford rivela un forte colore blu il pellet, che suggerisce un'immobilizzazione ad alta percentuale proteica piana e stabile senza desorbimento, mentre in gabbia il surnatante di PKA-UCNP soluzione Mostra un colore simile al (tampone HEPES Figura 4 c-4e).
4. Caratterizzazione
Nota: l'analisi della chinasi è utilizzata per quantificare l'attività specifica della chinasi del piruvato. In breve, la fosforilazione del peptide, che è accoppiato alla chinasi del piruvato e del lattato deidrogenasi, provoca l'ossidazione del NADH. Formazione di quest'ultimo viene monitorata misurando la diminuzione di assorbanza del NADH a 340 nm.
- Determinare l'attività della PKA e PKA-UCNP in un volume totale di 60 µ l di miscela di analisi contenente acido 4-morpholinepropanesulfonic (MOPS, 100 mM, pH 7.5), KCl (100 mM), fosfoenolpiruvato (PEP, 1mm), trifosfato di adenosina (trifosfato di adenosina, 1mm), β - nicotinammide adenina dinucleotide, ridotto forma (NADH, 0,8 mM), cloruro di magnesio (MgCl 2, 1mm), kemptide (0,4 mM) e una miscela di piruvato chinasi/lattato deidrogenasi (30/40 unità di PK/LDH).
- Misurare la diminuzione di assorbanza del NADH nel tempo dopo l'aggiunta della soluzione PKA (2 µ l) per la miscela di analisi. Calcolare la pendenza della linea per riflettere direttamente l'attività della chinasi misurate.
- Misurare l'attività della PKA-UCNP 15 e l'attività complessiva, che dovrebbe essere ben abbinato con il prodotto della moltiplicazione del nativo PKA-specifici di attività e l'importo calcolato di superficie-rivestito di PKA.
5. Installazione di fotolisi
- MeasUre tutta la potenza della luce fonti utilizzando un sensore termico mucchio e calcolare la densità di potenza (PD = potenza (W) / Area (cm 2)) 18 basato sulla zona spot luce.
- Eseguire in vitro UV fotolisi esperimenti su un sistema commerciale con un LED (200 mW/cm 2) di 365 nm 15.
- UV per fotoattivazione sulla fase di microscopio, illuminare la soluzione di PKA-UCNP con la luce di eccitazione filtrato da un commerciale cubo 15.
Nota: La densità di potenza è ~ 15 mW/cm 2, senza messa a fuoco dell'obiettivo. - Per in vitro NIR fotoattivazione sulla fase di microscopio, illuminare la soluzione di PKA-UCNP utilizzando un laser a 980 nm con le impostazioni di filtro/specchio upconversion personalizzato installate nel percorso della luce di livello inferiore, uno specchio dicroico (850 nm breve-pass), e un filtro di eccitazione (950 nm long-pass).
Nota: La densità di potenza di uscita è 5 W/cm 2 prima messa a fuoco dell'obiettivo 4 X. La densità di potenza è stimato pari a ~ 68 W/cm 2 dopo 4 X messa a fuoco dell'obiettivo.
6. Preparazione del campione e microiniezione di PKA-UCNP complessi delle cellule
- pre-filtro i campioni attraverso un filtro da 0,45 µm dopo immobilizzazione PKA (punto 3.5).
- Incubare le cellule nel 10% siero bovino fetale (FBS) che contiene il L-15 media durante il periodo di microiniezione per controllo pH stabile all'esterno dell'incubatrice.
Nota: per confermare il completamento di microiniezione, co-iniettare il nativo PKA-UCNP, PKA-UCNP in gabbia o PEGylated UCNP (7,5 mg/mL) 15 con 5 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) (10 µM) in cellule. - Regolare la concentrazione delle particelle PKA-UCNP tale che, dopo la microiniezione, la concentrazione citosolica è 1-3 μM PKA - una gamma di concentrazione fisiologica per PKA in una cella, con il presupposto che il volume di iniezione è 1/10 del volume cellulare .
- Eseguire la microiniezione nelle cellule (punto 6.2) utilizzando un dispositivo di microinjector accoppiato con un micromanipolatore idraulico di un asse ( Figura 3).
- Utilizzare un manometro digitale per monitorare la pressione esercitata dalla microinjector è nel campo di funzionamento (~ 50-200 hPa) e sigillare la valvola dell'erogatore in una camera di pressurizzazione su misura per fornire pressione di compensazione per il microinjection. Tirare indietro l'ago con l'estrattore.
- Mantenere la pressione di iniezione tra 50 e 75 hPa, con un tempo di iniezione di 200-300 ms e la pressione di compensazione alle 15 hPa per impedire il riflusso del mezzo di coltura nell'ago per capillarità.
- Esaminare le aperture di punta degli aghi per garantire che essi hanno un diametro esterno compreso tra 1,3 e 1,5 µm, che può essere confermato prendendo immagini utilizzando un obiettivo 40x.
- Lavare le cellule con 2 mL di mezzo di L-15 contenente 10% FBS dopo la microiniezione. Osservare l'imaging di fluorescenza cellulare da 5 (6) - carboxytetramethyl - rodamina (TAMRA) per confermare il completamento di microiniezione.
7. Fotoattivazione di Caged PKA-UCNP usando UV o luce NIR in cellule viventi
- UV per fotoattivazione dopo la microiniezione di PKA-UCNP, crescere le cellule REF52 su un piatto da 3,5 µm, metterli sul tavolino del microscopio e li irradiare con luce UV filtrata per il cubo per 3 min senza messa a fuoco dell'obiettivo.
Nota: REF52 le cellule sono state mantenute in DMEM contenente 10% FBS a 37 ° C in un incubatore a CO 2 5% e le cellule sono state subcoltivate quando il confluency raggiunto al 90% ogni 2-3 giorni. - Per NIR fotoattivazione dopo microiniezione PKA-UCNP, illuminare le cellule su un laser a 980 nm da impostazioni di livello inferiore filtro/specchio, come descritto al punto 5.4.
Nota: L'uscita di densità di potenza è 5 W/cm 2 prima 10 X messa a fuoco dell'obiettivo ed è stimata in 300 W/cm 2 dopo 10 x messa a fuoco dell'obiettivo. Upconversion è un processo che richiede una densità di fotoni ad alta, soprattutto quando è necessario un cambiamento di anti-Stoke più grande. Quindi, messa a fuoco è necessaria durante la fotoattivazione. - Quando è necessario un più grande luce spot (650 µm x 520 µm), irradiare queste cellule con NIR focalizzato da una lente dell'obiettivo 10x con un collimatore per 15 min. Consenti per un intervallo di 5 min scuro dopo irradiazione ogni 5 min per evitare riscaldamento.
Nota: Quando un'alta risoluzione spaziale (punto luminoso subcellulare) è necessario utilizzare la lente dell'obiettivo X 40 con un foro stenopeico installato all'estremità di uscita della luce guida per generare un punto luminoso subcellulare-dimensione (5 µm x 4 µm). In questo caso, 1 s di irradiazione è abbastanza per fotoattivazione NIR grazie all'elevato flusso di fotoni. - Fotolisi UV dopo o NIR, permettono alle cellule di recuperare in un 5% CO 2 incubatore a 37 ° C per 1 h in terreno completo per generare risposte cellulari. Successivamente, correggerli in 1 mL di 4% paraformaldeide /-soluzione tampone fosfato salino (PBS) per 20 min prima della ulteriore colorazione.
Attenzione: Paraformaldeide è altamente tossico; evitare il contatto con pelle, occhi o mucose. Evitare di inalare la polvere durante la misurazione e la preparazione.
8. Visualizzazione di disintegrazione di fibra lo Stress causato da NIR fotoattivazione
- dopo la fissazione, utilizzare Alexa 594-falloidina (aggiungere 5 µ l di soluzione madre di 6,6 µM a 200 µ l di PBS per la macchiatura; Incubare per 25 min a temperatura ambiente) a macchiare e visualizzare le fibre di stress. Visualizzare le immagini di Alexa 594-falloidina (Ex 581 nm/Em 609 nm) utilizzando un set di filtri.
- Incubare le cellule per 5 min in 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a temperatura ambiente. Dopo la colorazione, lavare i campioni con PBS e prendere separatamente immagini fluorescenti delle fibre di sforzo e nuclei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il design del costrutto in gabbia enzima-UCNP è illustrato nella Figura 1. L'enzima PKA in primo luogo è stato reagito con il bromuro di 2-nitrobenzyl per generare un'inattiva della PKA in gabbia, e si era quindi elettrostaticamente immobilizzato sulla superficie del UCNP. UCNPs emettono la luce di upconverted e di conseguenza photolytically fendere i gruppi o-nitrobenzyl su 199 Cys e Cys 343, generando la PKA attivata. Immagini TEM e analisi di Bradford ha confermato che il PKA e PKA in gabbia sono stati immobilizzati sulla superficie del UCNPs, e l'attività della chinasi di soluzione di PKA-UCNP in gabbia dopo UV fotoattivazione era analizzata (Figura 4). Dopo immobilizzazione PKA, uno strumento di diffusione dinamica della luce ha rivelato le dimensioni e il potenziale zeta del complesso PKA-particella per essere 120 nm e -16,0 mV, rispettivamente. Analisi di Bradford della soluzione PKA-UCNP ha mostrato un forte colore viola sulle particelle, che suggerisce un'immobilizzazione ad alta percentuale proteica piana e stabile.
Cellule embrionali del fibroblasto del ratto di REF52 sono state selezionate per lo studio di fotoattivazione nell'esperimento cellulare. In questo esperimento, il pathway di PKA può essere attivato da attivazione di PKA endogeno (che viene attivato tramite l'incubazione di cellula-permeabile 8-CPT-cAMP) o la microiniezione della PKA attiva o triggerable. PKA attivato (con o senza immobilizzazione della particella) si disintegra le fibre di stress ed espone più filamentose actina (F-actina) superficie e quindi fluoroforo falloidina, che si lega fortemente al F-actina, producendo un segnale maggiore colorazione. Dopo incubazione 8-CPT-cAMP o microiniezione del PKA gratuito, attivo PKA-UCNP o UV-attivato PKA-UCNP (come gli esperimenti di controllo positivo), ci ha confermato la presenza di disintegrazione di fibra forte stress causato dall'attivazione di PKA pathway (Figura 5). Sia endogeno PKA e iniettati PKA studi mostrano disintegrazione di fibra lo sforzo intero-cellula, mentre lo stress display particella-immobilizzata PKA (PKA-UCNP attivo e UV-attivato PKA-UCNP) disintegrazione fibra solo nel sito di microiniezione, più suggerendo l'immobilizzazione stabile di PKA sulla UCNPs. Per l'esperimento di fotoattivazione NIR, dopo la microiniezione della PKA-UCNP in gabbia e l'irradiazione di NIR, UCNPs emettono luce upconverted e fendere i gruppi o-nitrobenzyl su 199 Cys e Cys 343. Di conseguenza, essi generano la PKA attivata, disintegrato fibre di sforzo e produrre un segnale maggiore di fluoroforo falloidina macchiatura (Figura 6). Esperimenti di controllo negativo sulle cellule REF52 microiniettati con UCNP senza la PKA in gabbia e poi NIR-irradiati, come pure le cellule REF52 con gabbia PKA-UCNP in assenza di irradiazione, ha mostrato alcun effetto sull'integrità della fibra di sforzo.
Figura 1 . Illustrazione di Design in gabbia PKA-UCNP e assistita Upconversion PKA Uncaging. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cutaway diagramma mostra lo schema di percorso della luce. (un) Modified spettrofluorimetro e (b) microscopio per upconversion luminescenza e NIR fotolisi modalità (a sinistra) e per epifluorescenza e modalità di fotolisi UV (a destra), come pure loro messa a punto sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Messa a punto sperimentale per il Microinjection. Il titolare di iniezione è accoppiato con un micromanipolatore di un asse olio idraulico ad un angolo tra 30° e 45°. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Conferma di PKA immobilizzazione su UCNP. Immagini TEM di (un) silice rivestite con UCNP e (b) in gabbia UCNP PKA-immobilizzata; Analisi di Bradford di buffer (c), HEPES, (d), il pellet frazione risospensione di soluzione di PKA-UCNP in gabbia e (e) il surnatante frazione di soluzione di PKA-UCNP in gabbia; e (f) analisi di attività della chinasi di soluzione di PKA-UCNP in gabbia dopo UV fotoattivazione. Questa figura è stato riprodotto da Gao, H.-D. et al. dopo esplicita autorizzazione è stata ottenuta dal server di pubblicazione, l'American Chemical Society. Barra della scala = 20 nm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Immagini di fluorescenza di Stress fibra colorazione (verde) e DAPI colorazione dei Nuclei delle cellule REF52 (blu), mostrando la disintegrazione della fibra lo Stress ed i cambiamenti morfologici innescati dall'attivazione di PKA diverso. (un) non trattato cellule, (b) 8-(4-Chlorophenylthio) adenosina 3', 5'-monofosfato ciclico (cAMP-CPT-8)-trattato di cellule, cellule attive di PKA-microiniettati (c), cellule di PKA-UCNP-microiniettati attive (d) e ( e) in gabbia PKA-UCNP-microiniettati cellule dopo l'irradiazione UV. (f-j) Le immagini di densità ottica (O.D.) derivano da (a-e), rispettivamente. (KO) Le corrispondenti curve di intensità lungo la freccia blu. La freccia bianca indica la cella iniettata. La barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Immagini di fluorescenza delle cellule REF52 microiniettati con varie forme PKA. Le cellule microiniettate con (un) in gabbia PKA-UCNP dopo irradiazione di NIR, (b) UCNP PEG-innestati sotto irradiazione di NIR, e (c) in gabbia PKA-UCNP senza irradiazione. (d-f) L'emissione di upconverted di UCNP (nella casella tratteggiata) per (a-c). (g-i) Immagini unite delle fibre di sforzo (verde), emissioni di upconversion (rosse) della UCNP complessa e DAPI la macchiatura dei nuclei (blu). NIR fotoattivazione delle cellule è stata condotta ad una superficie illuminante di 650 µm x520 µm utilizzando un obiettivo obiettivo 10x. Le immagini di fluorescenza sono state acquisite utilizzando un obiettivo X 40. Quindi, l'area di irradiazione di NIR è stata ridotta a 150 µm x 120 µm, come indicato nel riquadro rosso tratteggiato. La luminescenza di upconversion può essere visto in (c). Per gli studi di quantificazione usando ImageJ, O.D. immagini (j-l) sono stati derivati da (a-c), rispettivamente. Le curve di intensità lungo la freccia blu mostrato in (j-l) sono state tracciate in (m-o). Un alto rapporto segnale-rumore (S/N) è stato osservato per questo sistema ed è considerato una risposta positiva. Questo approccio è stato applicato per tutti Alexa 594-falloidina colorazione quantificazioni. La freccia bianca indica la cella iniettata. La barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In precedenza, Hofmann e colleghe trovano che drammatici cambiamenti morfologici sono stati osservati in cellule REF52 dopo la microiniezione del libero PKA19. In un altro studio, il gruppo di Lawrence ha dimostrato che la PKA in gabbia può essere attivata in vivo, portando a cambiamenti morfologici e la disintegrazione delle fibre di stress quando sottoposti a fotolisi UV20. Precedenti rapporti sullo sfruttamento upconverted UV luce per fotoattivazione ha mostrato l'attivazione dei diversi UCNP-assistita, in gabbia, piccoli bioeffectors molecolari21,22,23. Tuttavia, un protocollo da utilizzare UCNP-assistita fotoattivazione sulla classe più importante di bioeffector, l'enzima, deve ancora essere sviluppata. Quindi, in questo studio, descriviamo un protocollo di esperimento cellulare che include la fotoattivazione NIR di PKA in gabbia utilizzando UCNPs. In questa piattaforma di fotoattivazione NIR, in gabbia PKA20 immobilizzati sulla superficie della silice-rivestito UCNPs è stato utilizzato per dimostrare la fattibilità della via di trasduzione del segnale della cella utilizzando NIR come trigger di controllo. REF52 cellule microiniettate con un PKA-UCNP in gabbia costruire ed irradiati con NIR ha mostrato un effetto sulla disintegrazione di fibra di stress, come pure i cambiamenti morfologici all'interno delle cellule. Inoltre, esperimenti di controllo positivo e negativo sono stati effettuati e ha dimostrati che la via di PKA-indotta che conduce alla disintegrazione delle fibre di stress è innescata da irradiazione di NIR.
Le modifiche all'apparecchio sono descritto in questo manoscritto, mentre la PKA modificazione chimica è ben documentata altrove15. Se un esperimento ben progettato richiede la risoluzione dei problemi, in primo luogo identificare se i problemi sono generati da: (i) il complesso proteina-UCNP, (ii) microiniezione o strumentazione (iii) ottica. In caso di problemi di fotoattivazione di proteina: (1) fare certo che la PKA è attiva, (2) confermare che la PKA in gabbia ha attività residua che è < 5% del suo valore originale, (3) accertare che la PKA UV-uncaged ha almeno il 50% della sua attività restaurato, (4) make sicuro che la PKA in gabbia è immobilizzata sulla superficie UCNP (eseguire un'analisi di Bradford) e (5) assicurare che la PKA-UCNP in gabbia ha inoltre almeno il 50% della sua attività ripristinato (eseguendo irradiazione UV). Per problemi di microiniezione: (1) assicurarsi che che la punta dell'ago è aperta e la soluzione della proteina-UCNP viene caricata correttamente. Posizionare l'ago caricato (punta) su un microscopio con un canale di eccitazione di NIR. Se si osserva fluorescenza upconversion, il caricamento è corretto. (2) la proteina-UCNP iniettare le cellule e osservare l'intensità della fluorescenza di co-iniettate 5 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) tintura e upconversion particella. Iniezione corretta si tradurrà in fluorescenza intensa di particella TAMRA e upconversion nelle cellule. Microscopio ottico modifica della risoluzione dei problemi: (1) rimuovere la lente dell'obiettivo, accendere il laser NIR e mettere il sensore di misuratore di potenza termica mucchio sul palco microscopio per misurare il NIR, che non deve essere bloccato da un'impostazione non corretta. (2) installare la lente dell'obiettivo e mettere una cuvetta di fondo trasparente riempita con 10 mg/mL soluzione UCNP sul tavolino del microscopio. Un forte fascio blu nella soluzione si vedrà se le ottiche sono installate correttamente.
Microiniezione solo può fornire un numero limitato di cellule per l'analisi. Il tasso di successo di iniezione è operatore (o esperienza)-dipendente, che è una limitazione importante di questa tecnica. Tuttavia, non c'è nessun altro modo per aggirare questo finora. Molti scienziati suggeriscono che l'uso di incubazione delle particelle-cellulare permette alle cellule di assorbimento le particelle. Tuttavia, non si tratta di un approccio fattibile. Anche se si verifica l'assorbimento cellulare delle particelle e la quantità di assorbimento è sufficiente, si accumulano nei endosomes/lisosomi, ma non nel citosol. Questo enzima di trasduzione di segnale specifico deve essere situato nel citosol, non gli endosomi, per essere efficace. Inoltre, quando PKA è dissolto in un buffer di memoria perfetta a 37 ° C, l'attività non dura dopo deposito notturno. La stabilità dell'enzima in mezzo di coltura cellulare è ancora più breve, e rende l'approccio di incubazione impraticabile.
Questo segnalato strumentale installazione, microiniezione e chinasi NIR fotoattivazione protocollo deve essere generalmente applicabile, non solo per la chinasi chimicamente modificata, ma anche per altre classi di proteine o enzimi. Inoltre, sarebbe utile in studi cellulari dove la diretta esposizione ai raggi UV è indesiderabile. Inoltre, il complesso di bioeffector-UCNP in gabbia possa interagire con bersagli extracellulare, ad esempio proteine di membrana o recettori di membrana, evitando il problema di consegna intracellulare e rendere la piattaforma applicabile per uso in vivo . Dopo l'iniezione I.V., ormoni proteici in gabbia o proteine terapeutiche avrà la forma attivata del bioeffector solo nelle regioni di NIR-irradiati.
Microiniezione è la fase più critica in questo protocollo. Per iniezione precisa, evitare bolle durante il caricamento dell'ago. Dopo il caricamento, immediatamente installare l'ago nell'iniettore e immergere la punta dell'ago nel mezzo per prevenire la punta dell'ago da essiccazione, che causerà l'intasamento. Abilità dell'operatore microiniezione è fondamentale per un più alto tasso di successo di iniezione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo il Nano scienze e tecnologia programma di Academia Sinica e il Ministero della scienza e tecnologia di Taiwan per il finanziamento (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Ammonium hydroxide (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
