Summary
في هذا البروتوكول، معطلة على سطح نانوحبيبات محبوس البروتين كيناز ألف (PKA)، بيوفيكتور توصيل إشارات خلوية، وميكروينجيكتيد إلى سيتوسول وتفعيلها من خلال تحويل الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة من الإشعاع (الجرد) القريبة من الأشعة تحت الحمراء، الذي يحفز الإجهاد المصب تفكك الألياف في سيتوسول.
Abstract
نانوحبيبات Upconversion (أوكنب)-فوتواكتيفيشن الوساطة نهج جديد في بيوفيكتورس التحكم عن بعد مع الضيائية أقل بكثير وأعمق اختراق الأنسجة. ومع ذلك، الأجهزة الموجودة في السوق غير سهولة متوافق مع تطبيق upconversion. ولذلك، تعديل الصك متاحة تجارياً ضروري لهذا البحث. في هذه الورقة، ونحن أولاً توضيح التعديلات فلوريميتير التقليدية ومجهر الأسفار لجعلها متوافقة لتجارب upconversion فوتون. ثم يصف لنا توليف القرب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد)-أثارت محبوس البروتين كيناز ألف الحفاز فرعية (PKA) معطلة في مجمع أوكنب. وأفيد أيضا معلمات microinjection وإجراءات الجرد فوتواكتيفيشن. بعد أن يتم ميكروينجيكتيد PKA-أوكنب محبوس في خلايا تنتجها الخلايا الليفية REF52، مشغلات تشعيع الجرد، وتفوق إلى حد كبير لإشعاع الأشعة فوق البنفسجية التقليدية، كفاءة PKA المسار توصيل الإشارات في الخلايا الحية. وبالإضافة إلى ذلك، تؤكد تجارب التحكم الإيجابي والسلبي أن الطريق التي يسببها PKA مما يؤدي إلى تفكك ألياف الإجهاد على وجه التحديد يتم تشغيلها بواسطة تشعيع الجرد. وهكذا، يوفر استخدام أوكنب البروتين تعديل نهج مبتكر التحكم عن بعد بالتضمين في ضوء التجارب الخلوية، التي يجب تجنب التعرض المباشر للأشعة فوق البنفسجية.
Introduction
وقد وضعت البروتينات المعدلة كيميائيا يمكن أن فوتواكتيفاتيد (مثلاً، PKA محبوس البروتينات) كحقل ناشئة في مجال البيولوجيا الكيميائية لمعالجة العمليات الكيميائية الحيوية بين الخلايا1،2 غير إينفاسيفيلي ،3. استخدام الضوء كما يوفر حافزا القرار الزمانية المكانية ممتازة عند تنشيط هذه محبوس البروتينات. ومع ذلك، يمكن أن يسبب ضوء الأشعة فوق البنفسجية التغييرات الشكلية غير مرغوب فيها، والمبرمج، وتلف الحمض النووي للخلايا4،5. ومن ثم، التطورات الأخيرة في التصميم مجموعات فوتوكاجينج تركز على تمكين فوتوكليفاجي عند الإثارة أطول الطول الموجي أو اثنين-فوتون لتقليل الضيائية، كذلك فيما يتعلق بزيادة التغلغل العميق الأنسجة6،7. تنشيط مجموعات حبس تستجيب للطول الموجي أطول مما يسمح لنا باختيار الأطوال الموجية أونكاجينج المناسبة (أي، قنوات) إلى بشكل انتقائي بيوفيكتورس عند اثنين أو أكثر الفئات كاجينج الحالي7. ونظرا لهذه الخصائص المفيدة، تطوير مجموعات جديدة من فوتوكاجينج الضوء الأحمر عمل المنبع هام جداً في منهجيات الضوئية للدراسات البيولوجية بدءاً من سبر آليات ردود الفعل على مراقبة الأنشطة الخلوية8. ومع ذلك، مجموعة كاجينج اثنين-فوتون عادة مسعور جداً بسبب هيكل حلقة عطرية تنصهر فيها، ومجموعة كاجينج الضوء المرئي عادة الفلزية العضوية، مع يغاندس العطرية. هذه الخاصية العطرية/عمود المصباح غير مناسبة عندما يكون بيوفيكتور البروتين أو الإنزيم، كما ديناتوريس الموقع تنشيط الإنزيم/البروتين ويسبب فقدان وظيفة، حتى لو كان التصريف والتحلل الضوئي لا تزال تعمل على مستوى المواد الكيميائية2 ،9.
أوكنبس هي محولات الطاقة الفعالة التي تحول على ضوء الإثارة الجرد بالأشعة فوق البنفسجية. وقد عرضت هذه الخاصية الفريدة والرائعة من أوكنبس قرارات واقعية للتصدي للتحديات المرتبطة فوتواكتيفيشن وتشغيل الإصدار التي تسيطر عليها من الجزيئات الصغيرة، بما في ذلك10من حمض الفوليك، سيسبلاتين مشتقات11 ،12الحمض النووي/siRNA و حويصلات كوبوليمر13والجسيمات أجوف14. ومع ذلك، على حد علمنا، فوتواكتيفيشن أوكنب--بمساعدة من الإنزيمات أو البروتينات لم يتم اختباره حتى الآن. لأنه لا توجد أي حالة ناجحة لاستخدام الضوء الأحمر أو قوائم الجرد الوطنية فوتواكتيفي إنزيم، نحن كانت تطالب بإجراء التنشيط آثار تقرير الجرد الوطني لبناء البروتين/إنزيم تتألف من مجمعات إنزيم محبوس معدلة كيميائيا مع السليكا المغلفة، لانثانيدات يخدر أوكنب15. في هذه الدراسة، أوكنب كان مترافق مع سرعة في رد فعل إشارة توصيل كيناز في شكل قفص PKA. يتحكم PKA توليف الجليكوجين والتنظيم سيتوسكيليتال يستجيب للمنبهات الخارجية عن طريق دوري أدينوسين الفوسفات (معسكر) التنظيم في سيتوسول16. علينا دراسة جدوى لتنشيط إنزيم في الخلق الزماني والمكاني في تجربة الهاتف خلوي بعد التشعيع الجرد. هذا المنبر فوتواكتيفيشن أوكنب-بمساعدة منهجية جديدة إلى فوتواكتيفاتي إنزيم استخدام قوائم الجرد الوطنية ويتجنب استجابة الخلايا الناجم عن إشعاع الأشعة فوق البنفسجية التقليدية2،4توصيل إشارة غير مرغوب فيها.
من الصعب جداً ترانسلوكاتي بيوفيكتورس كبيرة (مثلاً، البروتينات) عبر غشاء الخلية للتحكم في النشاط الخلوي. على الرغم من أن قد يكون من الأسهل ترانسلوكاتي عن طريق الالتقام في سيتوسول البروتين الجسيمات معطلة، قد تضررت الالتقام أو المتدهورة عن طريق فخ اندوسومال وما يترتب عليه من تدهور الليزوزومية2،4. مبالغ ذوبانها حتى لو البروتين محبوس الفنية لا تزال بعد الغشاء إزفاء، قد لا يكون كافياً لإحداث الاستجابة الخلوية2،17. في تناقض حاد، microinjection نهجاً مباشرا والكمية لتسليم بيوفيكتورس الكبيرة إلى السيتوبلازم للخلية. وعلاوة على ذلك، يتطلب المعطل تداولها أوكنب بيوفيكتور تحويل الضوء لتفعيلها. ولذلك، الأجهزة البصرية يتطلب المزيد من التعديل لقياس، تصور، والاستفادة من الضوء upconversion. وسيرد في هذا العمل، تسليم مجمع أوكنب PKA محبوس إلى خلية باستخدام microinjection والتعديلات الأساسية التالية التحليل الطيفي، والفحص المجهري نير فوتواكتيفيشن بالتفصيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يصف البروتوكول تعديل أجهزة مفصلة لساعد upconversion فوتواكتيفيشن، وإجراء اصطناعية لتوليد محبوس PKA-أوكنب، مجهر إلكتروني (TEM) من أوكنب والسليكا المغلفة وقفص عينات PKA-أوكنب والإعداد التحلل الضوئي الأشعة فوق البنفسجية والجرد، وإعداد الخلية، microinjection PKA-أوكنب، ودراسة فوتواكتيفيشن وتلطيخ الألياف الإجهاد من الخلايا REF52-
1-الإعداد فلوريميتير لقياس الطيف Upconversion
- تثبيت عدسة هدف X 4 بجوار حامل ومبومو مطياف الأسفار حيث أن الليزر وتركز على منتصف ومبومو. ضع
- 0.5-8 ث الانضباطي 980 نانومتر ليزر الصمام ثنائي 90° ضد العدسة الهدف.
تنبيه: المشغل يحتاج إلى معرفة سلامة الليزر وارتداء نظارات الليزر نير. - تثبيت مرآة انعكاس كامل في تقاطع مسار الضوء من العدسة والهدف والليزر. ضع لوحة معدنية أسود المؤكسد إلى كتلة نافذة الإثارة للتحليل الطيفي وحماية الأجزاء الداخلية-
- مكان ومبومو المغلفة السليكا أوكنب الحل (0.2-0.6 مغ/مل) في حامل ومبومو حتى يمكن تصور شعاع upconversion مشرق ويمكن استخدامها لضبط محاذاة الخفيفة أفضل لتركيب مرآة.
- التبديل التحليل الطيفي إلى وضع التﻷلؤ مع أدنى إعداد الجهد PMT (ضبط لإعداد أعلى إذا كان الإشارة ضعيفة جداً). ضبط مرآة لمحاذاة أفضل، حيث الشعاع في وسط ومبومو وتلتقط PMT أقوى إشارة.
- قياس الطيف upconversion، بعد المحاذاة، مع إعداد الطاقة المطلوبة. استخدم مقياس طاقة حرارية كومة لبناء منحنى معايرة للطاقة الليزر ضد القراءة الكهربائية الحالية في إمدادات الطاقة الليزر. تحقق باستمرار أداء الليزر للتأكد من أن الأداء يقع ضمن نطاق معايرة.
2. إعداد المجهر
ملاحظة: يعمل الإعداد التالي لمجاهر مزودة بمسار بصري مستويين. إذا كان المستخدم تنوي تثبيت رمز تبديل مصدر ضوء إثارة في المنفذ مرة أخرى لجعل الليزر الجرد ومصباح هاليد تتقاسم نفس المنفذ، صيد تلسكوب في المنفذ الخلفي كثيرا كتلة تقرير الجرد الوطني أنها مصممة للحد من تدفئة العينة. يجب أن تجعل المستخدم خيار صعب: الحفاظ صيد تلسكوب ويعانون من كفاءة upconversion منخفضة جداً، أو إزالة صيد تلسكوب والتضحية بكثافة الإثارة الخفيفة ابيفلوريسسينسي-
ملاحظة: رسم تخطيطي كوتاواي عرض مخطط مسار الضوء على سبيكتروفلوروميتير معدلة، الفحص المجهري التﻷلؤ upconversion ووضع قوائم الجرد الوطنية التحلل الضوئي وابيفلوريسسينسي ووضع التحلل الضوئي الأشعة فوق البنفسجية، والإعداد التجريبية استخدمت في هذه التجربة موضحة في الشكل رقم 2-
دليل- تجهيز مجهر الأسفار مع هاليد معدنية خفيفة، توجه إلى الخلف منفذ
ملاحظة: في هذا المسار الخفيفة الطبقة العليا حيث يوجد برج مكعب، موضع مكعب واحد يجب أن تكون فارغة للسماح نير قادمة من المسار. خفيفة الطبقة السفلي - تثبيت الانضباطي 0.5 إلى 8.0 W 980 نانومتر ليزر الصمام ثنائي في الميناء الجانب الأيمن، مع صيد تلسكوب الجانب المنفذ مفتوح.
ملاحظة: وهذا يوسع ميكرومتر الموضعية إلى حوالي 500 ضوء الليزر في القطر عند استخدام عدسة هدف X 10. إزالة هذا صيد تلسكوب النتائج في بقعة ضوء مدى ميكرومتر ويجعل نير تشعيع الخلايا غير عملي. صيد تلسكوب هذا هو نير شفاف. - تثبيت مرآة مزدوج اللون (850 نانومتر قصيرة-تمرير) وعامل تصفية إثارة (950 نانومتر طويلة-تمرير) في الطبقة السفلي الخفيفة المسار. استخدام
- حل أوكنب لتصور بقعة ضوء الجرد. ضبط موضع الليزر مركز شعاع ضوء الجرد في مجال الرؤية لإنهاء المحاذاة.
3. إعداد وتوصيف من قفص PKA-أوكنب بناء
- إينكوباتي PKA المؤتلف (9 ميكرومتر) مع 0.5 مم 2-نيتروبينزيلبروميدي (NBB) في حبس المخزن المؤقت (20 مم تريس-HCl، مجكل 100 كلوريد الصوديوم، و 10 ملم 2؛ الرقم الهيدروجيني 8.5) لح 1-2 في 25 ° الطفايات جيم NBB الزائدة مع 10 مم دثيوثريتول (DTT)، وبعد ذلك دياليزي ضد 4-(2-هيدروكسيثيل) حمض الببرازين-1-اثانيسولفونيك (حبيس) المخزن المؤقت (10 ملم، ودرجة الحموضة 7.5) لإزالة الزائدة الكواشف والأملاح.
ملاحظة: الرقم الهيدروجيني لحل كاجينج هو خفض من 8.5 إلى 7.5 أثناء الغسيل الكلوي مع حبيس الرقم الهيدروجيني 7.5 لرد فعل التثبيت لاحقاً. - ميكس لانثانيدات أملاح-Y(CH3CO2) 3 الهيدرات (99.9%، 0.4527 ز، ملمول 1.38)، Yb (CH 3 CO 2) 3 هيدرات (99.9%، 0.2533 ز، ملمول 0.60)، و Tm (CH 3 CO 2) 3 هيدرات (99.9%، 0.0168 ز، 0.02 ميللي مول)-أوكتاديسيني (30 مل) وحمض الأولييك (12 مل)، تسخين المخلوط إلى 115 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وتبريد لهم إلى 50 درجة مئوية. بعد ذلك، حل الخليط رد الفعل في حل باثانول (20 مل) مع 0.2 ز (5.0 مليمول) بيليه هيدروكسيد الصوديوم و 0.2964 ز (8 ميللي مول) من فلوريد الأمونيوم التي سونيكيشن عن 15 دقيقة زيادة رد فعل درجة الحرارة إلى 300 درجة مئوية للحصول على نواة أوكنب (β-كفر 4 : 1.0% Tm 3 +/30% الماليزي 3 +) جسيمات نانوية. حل
- nanoparticles الأساسية (25 ملغم) مع شركة-520 (0.5 مل) في الحلقي (10 مل). إضافة الأمونيا (wt 30% v/v، مل 0.08) وتيترايثيلورثوسيليكاتي (تيوس، مل 0.04) وتطبيق التحريك المستمر ح 12 في درجة حرارة الغرفة للحصول على السليكا المغلفة β-كفر 4: 1.0%Tm 3 +/30%Yb 3 + الأساسية جسيمات نانوية.
- احتضانها في PKA (نمول 6) أو قفص PKA (نمول 6) مع أوكنب (1 ملغ) 15 في هيبيس المخزن المؤقت (10 ملم، ودرجة الحموضة 7.5) في 4 درجات مئوية عن ح 3 شل PKA على السليكا المغلفة أوكنب عن طريق التفاعل الالكتروستاتيكي.
- تصفية المخلوط باستخدام تصفية PVDF (0.45 ميكرومتر)، أجهزة الطرد المركزي في 17,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، وريديسبيرسي بيليه في 0.1% هيبيس (50 ميليلتر، 10 مم، الرقم الهيدروجيني 7.5) تحتوي على بروتين استقرار الحصول على المجمع PKA-أوكنب المنقي. الطرد المركزي في 17,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وجمع المادة طافية مقايسة برادفورد في أنبوب 1.5 مل. تحليل
- PKA غير محدودة في المادة طافية المحفوظة من الخطوة 3.5 مع مقايسة برادفورد للخلف-حساب مستوى الإحلال PKA على الجسيمات أوكنب، الذي عادة ما يكون مستوى إحلال ~ نمول 4.5 من PKA كل مغ جسيمات.
ملاحظة: مقايسة برادفورد يكشف لون أزرق قوي في الكريات، مما يوحي تجميد بروتين عالية المستوى ومستقرة دون الامتزاز، بينما الكسر طافية من قفص الحل PKA-أوكنب يظهر لون مماثل حبيس المخزن المؤقت ( الشكل 4 ج-4e).
4. وصف
ملاحظة: المقايسة كيناز ويستخدم لقياس نشاط بيروفات كيناز محددة. وباختصار، الفسفرة الببتيد، الذي يقترن إلى بيروفات كيناز ونازعه لاكتات، ينتج عن أكسدة NADH. ويرصد تشكيل هذا الأخير بقياس الانخفاض في امتصاص NADH في 340 نانومتر.
- تحديد نشاط PKA و PKA-أوكنب في حجم الخليط المقايسة التي تحتوي على حمض مورفولينيبروبانيسولفونيك 4 (الممسحات، 100 ملم، ودرجة الحموضة 7.5)، مجموع 60 ميليلتر بوكل (100 ملم)، فوسفونولبيروفاتي (بيب، 1 ملم)، أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP، 1 ملم)، β- نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide، خفضت النموذج (NADH، 0.8 ملم) وكلوريد المغنيسيوم (MgCl 2, 1 ملم)، كيمبتيدي (0.4 ملم) وخليط نازعة بيروفات كيناز/لاكتات (30/40 وحدة من PK/رابطة حقوق الإنسان)-
- قياس الانخفاض في امتصاص NADH مع مرور الوقت بعد إضافة الحل PKA (2 ميليلتر) إلى خليط المقايسة. حساب منحدر الخط مباشرة تعكس نشاط كيناز يجري قياسه.
- قياس نشاط PKA-أوكنب 15 والنشاط العام، والتي يجب أن تتطابق تماما مع الضرب المنتج الأصلي PKA محددة النشاط ومبلغ المغلفة بسطح PKA محسوب.
5. الإعداد التحلل
- الاتفاقات البيئية المتعددة الأطرافإليها باعتبارها قوة الضوء جميع المصادر باستخدام جهاز استشعار حراري كومة وحساب كثافة الطاقة (PD = الطاقة (W)/المنطقة (سم 2)) 18 استناداً إلى منطقة بقعة الضوء.
- القيام بتجارب في المختبر الأشعة فوق البنفسجية التحلل الضوئي على نظام تجاري مع 365 نانومتر الصمام (200 ميغاواط/سم 2) 15-
- فوتواكتيفيشن "للأشعة فوق البنفسجية" على المسرح المجهر، وإلقاء الضوء على الحل أوكنب PKA مع الإثارة الخفيفة تتم تصفيتها بواسطة مكعب تجاري 15.
ملاحظة: هو كثافة الطاقة ~ 15 ميغاواط/سم 2، دون التركيز عدسة الهدف. - في المختبر فوتواكتيفيشن نير على المسرح المجهر، إلقاء الضوء على الحل PKA-أوكنب باستخدام ليزر 980 نانومتر مع إعدادات عامل التصفية/مرآة upconversion مخصصة مثبتة على مسار الطبقة السفلي الخفيفة، مرآة مزدوج اللون (850 نانومتر قصيرة-تمرير)، و عامل تصفية إثارة (950 نانومتر طويلة-تمرير).
ملاحظة: هو كثافة الطاقة الناتج 5 واط/سم 2 قبل 4 X عدسة الهدف التركيز. كثافة الطاقة يقدر بنحو ~ 68 ث/سم 2 بعد 4 × تركز عدسة الهدف.
6. خلية إعداد العينة و Microinjection مجمعات PKA-أوكنب
- قبل تصفية العينات من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر بعد التثبيت PKA (الخطوة 3، 5)-
- احتضان الخلايا في 10% مصل بقرى الجنين (FBS) تحتوي على L-15 المتوسطة خلال فترة microinjection لمراقبة درجة الحموضة مستقرة خارج الحاضنة.
ملاحظة: للتأكد من إتمام microinjection، شارك حقن الأصلية PKA-أوكنب، أوكنب PKA محبوس، أو سي أوكنب (7.5 مغ/مل) 15 5 6-كاربوكسيتيتراميثيلرهوداميني (طمره) (10 ميكرومتر) في الخلايا. - ضبط تركيز الجسيمات PKA-أوكنب أن، بعد microinjection، تركيز سيتوسوليك 1-3 ميكرومتر PKA-مجموعة تركيز فسيولوجية ل PKA في خلية، مع افتراض أن حجم الحقن هو 1/10 حجم الهاتف الخلوي .
- أداء microinjection في الخلايا (الخطوة 6.2) باستخدام جهاز ميكروينجيكتور مقرونا محور واحد ميكرومانيبولاتور هيدروليكية ( الشكل 3).
- استخدام مقياس الضغط رقمي لمراقبة الضغوط التي مورست قبل ميكروينجيكتور في نطاق التشغيل (~ 50-200 hPa) وختم صمام موزع في حجرة الضغط على مخصصة لتوفير التعويض الضغط ل microinjection. سحب الإبرة استخدام ساحبة.
- الحفاظ على ضغط الحقن بين 50 و 75 hPa، مع وقت حقن ms 200-300 والضغط التعويض في 15 hPa لمنع الدفق المتوسطة الثقافة في إبرة بعمل شعري.
- دراسة الفتحات نصيحة من الإبر ضمان أن تكون لديهم قطر خارجي بين 1.3 و 1.5 ميكرومتر، التي يمكن تأكيدها بأخذ الصور باستخدام عدسة هدف 40 x- أغسل
- الخلايا مع 2 مل من L-15 المتوسطة التي تحتوي على 10% FBS بعد microinjection. مراقبة تصوير fluorescence الخلوية من-كاربوكسيتيتراميثيل-والرودامين 5 (6) (طمره) للتأكد من إتمام microinjection.
7. فوتواكتيفيشن من قفص PKA-أوكنب باستخدام الأشعة فوق البنفسجية أو ضوء الجرد في "الخلايا الحية"
فوتواكتيفيشن- "للأشعة فوق البنفسجية" بعد microinjection PKA-أوكنب، تنمو الخلايا REF52 على طبق 3.5 ميكرون ومكان لهم في مرحلة مجهر، ويتهددها لهم مع تصفية بواسطة الأشعة فوق البنفسجية المكعب لمدة 3 دقيقة دون التركيز عدسة الهدف.
ملاحظة: REF52 وأبقى على الخلايا في دميم التي تحتوي على 10% FBS في 37 درجة مئوية في 5% CO 2 حاضنة، والخلايا وكانت سوبكولتوريد عندما كونفلوينسي وصلت إلى 90% كل 2-3 أيام- - فوتواكتيفيشن "للجرد" بعد microinjection PKA-أوكنب، تضيء الخلايا على 980 نانومتر ليزر من إعدادات تصفية الطبقة السفلي/مرآة، كما هو موضح في الخطوة 5، 4-
ملاحظة: إخراج كثافة الطاقة وهو 5 واط/سم 2 قبل 10 X عدسة الهدف التركيز يقدر بنحو 300 واط/سم 2 بعد 10 x عدسة الهدف التركيز. Upconversion هو عملية تتطلب كثافة عالية فوتون، لا سيما عند الحاجة إلى تحول أنتيستوكي أكبر. ومن ثم يلزم التركيز أثناء فوتواكتيفيشن.
تشعيع - عند الحاجة إلى بقعة ضوء أكبر (650 مكم x 520 ميكرومتر)، هذه الخلايا مع تقرير الجرد الوطني ركز بعدسة هدف العاشر 10 مع صيد تلسكوب ل 15 دقيقة السماح لفاصل الظلام 5 دقائق بعد كل تشعيع 5-دقيقة لتجنب التدفئة.
ملاحظة: عند الحاجة مكانية-دقة عالية (بقعة الضوء سوبسيلولار)، استخدام عدسة الهدف X 40 مع ثقب المثبتة في نهاية المطاف الخروج من توجيه الضوء لتوليد بقعة ضوء سوبسيلولار البعد (5 ميكرون x 4 ميكرومتر). في هذه الحالة، 1 s تشعيع ما يكفي نير فوتواكتيفيشن بسبب ارتفاع تدفق الفوتونات. - التحلل بعد الأشعة فوق البنفسجية أو الجرد، تسمح للخلايا لاسترداد في 5% CO 2 حاضنة في 37 درجة مئوية ح 1 في المتوسط كاملة لتوليد الاستجابات الخلوية. في وقت لاحق، إصلاحها في 1 مل من 4% بارافورمالدهيد/الفوسفات-مخزنة المالحة (PBS) لمدة 20 دقيقة قبل مواصلة تلطيخ.
تنبيه: بارافورمالدهيد شديدة السمية؛ تجنب ملامسة الجلد أو العينين أو الأغشية المخاطية. تجنب التنفس المسحوق أثناء قياس وإعداد-
8. التصور "إجهاد الألياف التفكك الناجمة عن نير فوتواكتيفيشن"
- بعد التثبيت، استخدم أليكسا 594-فالويدين (إضافة 5 ميليلتر من 6.6 مكم الحل الأسهم إلى 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لتلطيخ؛ واحتضان لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) وصمة عار و تصور الألياف الإجهاد. تصور صور أليكسا 594-فالويدين (ت 581 نانومتر nm/م 609) باستخدام عامل تصفية مجموعة-
- احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) في درجة حرارة الغرفة. بعد تلطيخ، غسل العينات مع برنامج تلفزيوني وتأخذ كل على حدة الصور الفلورية ألياف الإجهاد ونوى-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويتضح تصميم بناء قفص الإنزيم-أوكنب في الشكل 1. أولاً كان رد فعل الإنزيم PKA مع بروميد 2-نيتروبينزيل لتوليد PKA محبوس غير نشط، ومن ثم المعطل تداولها الكهربية الاستاتية على سطح أوكنب. تنبعث منها في ضوء تحويل أوكنبس ونتيجة لذلك فوتوليتيكالي تنشق الجماعات س-نيتروبينزيل على Cys 199 و 343 Cys، توليد PKA المنشط. صور تيم والمقايسة برادفورد أكدت أن PKA و PKA قفص كانت معطلة على السطح أوكنبس، ونشاط كيناز محبوس PKA-أوكنب حل بعد أن كان فوتواكتيفيشن الأشعة فوق البنفسجية جزيئي (الشكل 4). بعد التثبيت PKA، أداة ديناميكية تشتت ضوء وكشف الحجم وإمكانات زيتا المجمع الجسيمات PKA لتكون 120 نانومتر و-16.0 أم، على التوالي. برادفورد بالانزيم من الحل PKA-أوكنب أظهرت لون أرجواني قوية على الجسيمات، مما يوحي تجميد بروتين عالية المستوى ومستقرة.
واختير REF52 الفئران الخلايا الجنينية تنتجها الخلايا الليفية لدراسة فوتواكتيفيشن في تجربة الهاتف الخلوي. في هذه التجربة، يمكن تشغيل المسار PKA بتنشيط PKA الذاتية (والتي يتم تشغيلها بواسطة الاحتضان نفاذية الخلية 8-CPT-مخيم) أو microinjection من PKA النشطة أو تريجيرابل. تنشيط PKA (مع أو بدون تجميد الجسيمات) يفتت الألياف الإجهاد ويكشف أكثر الخيطية أكتين (F-أكتين) السطح والمسمى فلوروفوري ومن ثم فالويدين، الذي يلزم بشدة إلى واو-أكتين، مما أسفر عن إشارة المصبوغة أعلى. بعد 8-CPT-مخيم الحضانة أو microinjection PKA الحرة، أوكنب PKA النشطة، أو الأشعة فوق البنفسجية-تنشيط PKA-أوكنب (كتجارب إيجابية-التحكم)، أكدنا وجود تفكك الألياف قوي الإجهاد الناجم عن تفعيل المسار PKA (الشكل 5). PKA الذاتية والدراسات PKA ميكروينجيكتيد تفكك الألياف الإجهاد كامل الخلية، بينما المعطل تداولها الجسيمات PKA (أوكنب PKA النشطة والأشعة فوق البنفسجية-تنشيط PKA-أوكنب) يعرض الإجهاد الألياف تفكك فقط في الموقع microinjection، وإظهار مزيد اقتراح تجميد مستقرة من PKA على أوكنبس. للتجربة فوتواكتيفيشن نير، بعد microinjection PKA-أوكنب محبوس وتشعيع نير، تنبعث منها تحويل الضوء أوكنبس وتنشق الجماعات س-نيتروبينزيل على Cys 199 و Cys 343. ونتيجة لذلك، تولد PKA المنشط وتفككت ألياف الإجهاد، وتعطي إشارة أعلى من فالويدين المسمى fluorophore تلطيخ (الشكل 6). تجارب سلبية-التحكم في الخلايا REF52 ميكروينجيكتيد مع أوكنب دون PKA محبوس وثم نير المشع، فضلا عن الخلايا REF52 مع أوكنب PKA محبوس في غياب التشعيع، أظهر أي تأثير على سلامة الألياف الإجهاد.
الشكل 1 . شكل توضيحي لتصميم قفص PKA-أوكنب وساعدت Upconversion PKA أونكاجينج- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: رسم تخطيطي كوتاواي عرض مخطط مسار الضوء. () تعديل سبيكتروفلوروميتير و (ب) المجهر التﻷلؤ upconversion ووضع قوائم الجرد الوطنية التحلل الضوئي (يسار) وابيفلوريسسينسي والأشعة فوق البنفسجية التحلل الضوئي الوضع (على اليمين)، فضلا عن الإعداد التجريبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الإعداد التجريبية ل Microinjection. يقترن صاحب حقن ميكرومانيبولاتور هيدروليكي نفط محور واحد في زاوية بين 30 و 45 درجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: تأكيد التثبيت PKA على أوكنب- صور تيم () والسليكا المغلفة أوكنب و (ب) محبوس أوكنب المعطل تداولها PKA؛ برادفورد بالانزيم المخزن المؤقت (ج) هيبيس، (د) بيليه استثارة جزء من قفص PKA-أوكنب الحل، وكسر (ه) المادة طافية من قفص PKA-أوكنب الحل؛ ومقايسة النشاط كيناز (f) من قفص PKA-أوكنب حل بعد فوتواكتيفيشن الأشعة فوق البنفسجية. وهذا الرقم قد استنسخ من قاو، دال--حاء et al. بعد أن تم الحصول على إذن صريح من الناشر، "الجمعية الكيميائية الأمريكية". شريط المقياس = 20 نانومتر الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : صور fluorescence الألياف الإجهاد تلطيخ (الأخضر) و DAPI تلطيخ من نواة الخلايا REF52 (أزرق)، والتي تبين تفكك الألياف الإجهاد والتغييرات الشكلية التي فجرتها تنشيط PKA مختلفة- () أونتريتيد الخلايا، (ب) 8 (4-تشلوروفينيلثيو)-أدينوسين 3 ', 5' دوري الأدينوزين (8-CPT-مخيم)-تعامل الخلايا والخلايا ميكروينجيكتيد PKA النشطة (ج)، (د) الخلايا النشطة PKA-أوكنب-ميكروينجيكتيد و ( e) محبوس PKA-أوكنب-ميكروينجيكتيد الخلايا بعد إشعاع الأشعة فوق البنفسجية. (وي) صور الكثافة البصرية (نقلت) مشتقة من (أ-ه)، على التوالي. (كس) منحنيات شدة المقابلة على طول السهم الأزرق. ويشير السهم الأبيض إلى الخلية ميكروينجيكتيد. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: صور صف من الخلايا REF52 ميكروينجيكتيد مع مختلف أشكال PKA. خلايا ميكروينجيكتيد مع () محبوس PKA-أوكنب بعد التشعيع نير، (ب) أوكنب شماعة المطعمة تحت نير إشعاع، وقفص (ج) PKA-أوكنب دون التشعيع. (د-f) تحويل الانبعاثات من أوكنب (في مربع متقطع) ل (أ-ج). (ط ز) الصور المدمجة ألياف الإجهاد (الأخضر) وانبعاثات upconversion (أحمر) أوكنب المعقدة، وتلطيخ DAPI نويات (أزرق). وأجرى فوتواكتيفيشن نير من الخلايا في منطقة مضيئة من ميكرومتر 650 x520 ميكرون تستخدم عدسة هدف X 10. الصور الفلورية تم الحصول عليها باستخدام عدسة هدف X 40. ومن ثم، مجال تشعيع نير انخفض إلى 150 ميكرون x 120 ميكرومتر، كما هو مبين في مربع أحمر متقطع. يمكن تبينه من التﻷلؤ upconversion (ج). لدراسات القياس الكمي باستخدام إيماجيج، نقلت الصور (j-l) مستمدة من (أ-ج)، على التوالي. تم رسم منحنيات شدة على طول السهم الأزرق هو مبين في (j-l) في (م-س). نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية (S/N) لوحظ لهذا النظام، ويعتبر أن يكون ردا إيجابيا. وكان تطبيق هذا النهج لكافة أليكسا 594-فالويدين كوانتيفيكاتيونس المصبوغة. ويشير السهم الأبيض إلى الخلية ميكروينجيكتيد. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سابقا، هوفمان وزملاء العمل وجدت أن التغييرات الشكلية المثيرة وقد لوحظت في الخلايا REF52 بعد microinjection PKA الحرة19. وفي دراسة أخرى، أن المجموعة لورانس أثبتت أن PKA محبوس يمكن تفعيلها في فيفو، مما يؤدي إلى التغييرات الشكلية وتفكك ألياف الإجهاد عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية التحلل الضوئي20. وفي وقت سابق تقارير عن استغلال تحويل الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة فوتواكتيفيشن أظهرت تفعيل22،21،بيوفيكتورس الجزيئية مساعدة أوكنب، محبوس، صغيرة عدة23. ومع ذلك، بروتوكول لاستخدام فوتواكتيفيشن أوكنب-وساعدت على الفئة الأكثر أهمية من بيوفيكتور، الإنزيم، لا يزال يحتاج إلى تطوير. ومن ثم، في هذه الدراسة، ونحن وصف بروتوكول تجربة خلوية التي تتضمن فوتواكتيفيشن نير من قفص PKA باستخدام أوكنبس. في هذا المنبر فوتواكتيفيشن نير، استخدمت محبوس PKA20 معطلة على سطح أوكنبس والسليكا المغلفة لإثبات إمكانية التحكم في مسار توصيل إشارة الخلية باستخدام قوائم الجرد الوطنية كنقطة انطلاق. بناء الخلايا REF52 ميكروينجيكتيد مع محبوس PKA-أوكنب والمشع بقوائم الجرد الوطنية أظهرت تأثير على تفكك الألياف الإجهاد، فضلا عن التغييرات الشكلية داخل الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، إجراء التجارب الإيجابية والسلبية السيطرة وأثبتت أن الطريق التي يسببها PKA مما يؤدي إلى تفكك ألياف الإجهاد يتم تشغيلها بواسطة تشعيع الجرد.
يرد تعديل الصك في هذه المخطوطة، في حين PKA التعديل الكيميائي موثقة توثيقاً جيدا في أماكن أخرى15. إذا كانت تجربة مصممة تصميماً جيدا يتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها، أولاً تحديد ما إذا كانت المشاكل التي تتولد من: (ط) مجمع البروتين-أوكنب، (ثانيا) microinjection أو الأجهزة البصرية (ثالثا). في حالة حدوث مشاكل فوتواكتيفيشن البروتين: (1) أن التأكيد التي تنشط PKA، (2) تأكيد أن PKA محبوس النشاط المتبقية التي يتم < 5% قيمتها الأصلية، (3) التأكد من أن لديه PKA الأشعة فوق البنفسجية-أونكاجيد 50 في المائة على الأقل من نشاطها المستعادة، (4) أن التأكيد هذا هو المعطل تداولها PKA محبوس على سطح أوكنب (القيام فحص برادفورد)، و (5) ضمان أن PKA-أوكنب محبوس أيضا 50 في المائة على الأقل من نشاطها المستعادة (عن طريق إجراء إشعاع الأشعة فوق البنفسجية). لمشاكل microinjection: جعل (1) تأكد من أن الحافة إبرة مفتوح والحل أوكنب البروتين يتم تحميلها بشكل صحيح. مكان الإبرة المحمل (تلميح) على مجهر مع قناة إثارة الجرد. إذا كان من الملاحظ upconversion fluorescence، التحميل الصحيح. (2) حقن البروتين-أوكنب في الخلايا ومراقبة كثافة الفلورية شارك حقن صبغة 6-كاربوكسيتيتراميثيلرهوداميني (طمره) 5، والجسيمات upconversion. سيؤدي إلى الحقن المناسبة مكثفة طمره و upconversion fluorescence الجسيمات في الخلايا. مجهر بصرية تعديل استكشاف الأخطاء وإصلاحها: (1) إزالة العدسة، والهدف تشغيل الليزر الجرد، ووضعت استشعار متر الطاقة الحرارية كومة على مرحلة مجهر لقياس تقرير الجرد الوطني، الذي يجب أن لا يتم حظر بوضع غير سليم. (2) تثبيت العدسة الهدف ووضع ومبومو أسفل شفافة مليئة بحل أوكنب 10 ملغ/مل في مرحلة مجهر. شعاع أزرق حاد في الحل سيتضح إذا كانت البصريات كلها مثبتة بشكل صحيح.
يمكن أن توفر microinjection سوى عدد محدود من الخلايا لتحليلها. هو معدل نجاح حقن عامل التشغيل (أو التجربة)-المعالين، الذي يشكل قيداً رئيسيا لهذا الأسلوب. ومع ذلك، هناك أي وسيلة أخرى لتجاوز ذلك حتى الآن. تشير العديد من العلماء أن يتيح استخدام الجسيمات--خلية حضانة الخلايا لامتصاص الجزيئات. ومع ذلك، هذا ليس نهجاً عمليا. حتى لو كان يحدث امتصاص الجسيمات الخلوية ومقدار الإقبال بما فيه الكفاية، سوف تتراكم في اندوسوميس/ليسوسوميس، ولكن ليس في سيتوسول. يحتاج هذا الإنزيم توصيل إشارة محددة إلى تكون موجودة في سيتوسول، لم اندوسوميس، أن تكون فعالة. وعلاوة على ذلك، عندما يتم حل PKA في مخزن تخزين مثالية في 37 درجة مئوية، لا يدوم نشاطها بعد التخزين بين عشية وضحاها. استقرار الإنزيم في الخلية الثقافة المتوسطة حتى أقصر، ويجعل هذا النهج الاحتضان غير عملي.
وأفادت هذه ينبغي أن يكون بروتوكول فوتواكتيفيشن الإعداد و microinjection كيناز نير مفيدة قابلة للتطبيق عموما، ليس فقط من أجل كيناز معدلة كيميائيا، بل أيضا لفئات أخرى من البروتين أو الإنزيم. وعلاوة على ذلك، من المفيد في الدراسات الخلوية حيث التعرض المباشر للأشعة فوق البنفسجية غير مرغوب فيه. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تتفاعل المجمع محبوس بيوفيكتور-أوكنب مع أهداف خارج الخلية، مثل البروتينات الغشاء أو الغشاء مستقبلات، تجنب المشكلة التسليم داخل الخلايا وتطبيق المنهاج للاستخدام في فيفو . بعد حقن رابعا، هرمونات البروتين محبوس أو البروتينات العلاجية سوف يكون على شكل المنشط بيوفيكتور فقط في مناطق الجرد المشع.
Microinjection هو الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول. لحقن دقيقة، تجنب فقاعات أثناء تحميل الإبرة. بعد التحميل، تثبيت الإبرة داخل محقن فورا وتزج نصيحة إبرة في المتوسط إلى منع إبرة غيض من التجفيف، مما يؤدي إلى انسداد. مهارة المشغل microinjection أمر حاسم لارتفاع معدل حقن ناجحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونحن نشكر العلم نانو وبرنامج التكنولوجيا من سينيكا ووزارة العلوم والتكنولوجيا في تايوان للتمويل (101-2113-M-001-001-MY2؛ 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Ammonium hydroxide (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
