Summary
In dit protocol was gekooide proteïne kinase A (PKA), een Cellulaire signaaltransductie bioeffector, geïmmobiliseerd op een oppervlak van nanoparticle, microinjected in het cytosol en geactiveerd door de upconverted UV-licht van nabij-infrarood (NIR) bestraling, inducerende stroomafwaarts stress vezel desintegratie in het cytosol.
Abstract
Upconversion nanoparticle (UCNP)-gemedieerde photoactivation is een nieuwe aanpak om op afstand controle bioeffectors met veel minder fototoxiciteit en diepere weefsels penetratie. De bestaande instrumenten op de markt is echter niet gemakkelijk compatibel met upconversion toepassing. Wijzigen van de commercieel beschikbare instrument is daarom essentieel voor dit onderzoek. In deze paper illustreren we eerst de wijzigingen in een conventionele fluorimeter en fluorescentie Microscoop te laten compatibel voor foton upconversion experimenten. Vervolgens beschrijven we de synthese van een nabij-infrarood (NIR)-geactiveerd gekooide proteïne kinase A katalytische subeenheid (PKA) geïmmobiliseerd op een UCNP complex. Parameters voor microinjection en NIR photoactivation procedures worden ook gemeld. Nadat de gekooide PKA-UCNP is microinjected in REF52 fibroblast cellen, activeert de bestraling van het NIR, dat aanzienlijk superieur aan conventionele UV-bestraling is, efficiënt de PKA signaaltransductie traject in levende cellen. Bovendien bevestigen de positieve en negatieve controle experimenten dat de PKA-geïnduceerde traject leidt tot het uiteenvallen van stress vezels specifiek wordt geactiveerd door NIR bestraling. Het gebruik van gemodificeerde eiwitten UCNP biedt dus een innovatieve benadering van op afstand bedienen licht-gemoduleerd cellulaire experimenten, waarin directe blootstelling aan UV-licht vermeden worden moet.
Introduction
Chemisch gemodificeerde eiwitten die photoactivated (bijvoorbeeld PKA gekooide eiwitten worden kunnen) zijn ontwikkeld als een opkomende veld in de chemische biologie te niet-gebeurt manipuleren intercellulaire biochemische processen1,2 ,3. Met behulp van licht, zoals een stimulans uitstekende Spatio resolutie biedt bij het activeren van deze gekooide eiwitten. UV-licht kan echter leiden tot ongewenste morfologische veranderingen, apoptosis en DNA schade aan cellen4,5. Vandaar, recente ontwikkelingen in het ontwerp van photocaging groepen richten over het inschakelen van photocleavage bij langere golflengte of twee-foton excitatie om fototoxiciteit, evenals over het verhogen van de diep-weefsel penetratie6,7. Kooien groepen die reageren op langere golflengte waardoor ons om te kiezen van de geschikte uncaging golflengten (d.w.z., kanalen) selectief activeren bioeffectors wanneer twee of meer caging groepen zijn huidige7. Gezien deze handige functies, is ontwikkeling van nieuwe rood-licht photocaging groepen zeer belangrijk stroomopwaartse werk in fotochemische methodologieën voor biologische studies, variërend van het sonderen van de mechanismen van de reacties op het beheersen van cellulaire activiteiten8. Niettemin, een twee-foton caging groep is normaal als gevolg van de structuur van de gesmolten aromatische ring te hydrophobic, en een caging groep van zichtbaar licht is normaal organometaal, met aromatische liganden. Deze hydrofobe/aromatische eigenschap is niet geschikt als de bioeffector is een eiwit of enzym, zoals het denatureert van de site van de activering van het enzym/eiwit en verlies van functie, veroorzaakt zelfs als de vervoeging en fotolyse nog steeds op de chemische niveau2 werkt ,9.
UCNPs zijn effectieve omvormers die het NIR excitatie licht omzetten in UV. Deze unieke en fascinerende eigenschap van UCNPs biedt realistische oplossingen voor de uitdagingen in verband met photoactivation en geactiveerd gecontroleerde afgifte van kleine molecules, met inbegrip van foliumzuur10, cisplatine derivaten11 , DNA/siRNA12, copolymeer blaasjes13en holle deeltjes14. Echter tot de beste van onze kennis, is de UCNP-bijgewoonde photoactivation van enzymen of eiwitten niet getest tot nu toe. Omdat er geen succesvolle geldt voor het gebruik van rood licht of NIR photoactive een enzym, werden we gevraagd uit te voeren van de NIR-geactiveerd activering van een eiwit/enzym constructie bestaat uit chemisch gewijzigde gekooide enzym complexen met een silica-bekleed, lanthanide-doped UCNP15. In dit onderzoek was de UCNP met een snel reagerende signaaltransductie kinase in de vorm van gekooide PKA vervoegd. PKA regelt glycogeen-synthese en cytoskeletal verordening die op externe prikkels via cyclisch adenosine fosfaat (cAMP) verordening in het cytosol16 reageert. We studeerde de haalbaarheid van enzymactivering in temporele en ruimtelijke manieren in een cellulaire experiment na NIR bestraling. Dit UCNP-bijgewoonde photoactivation platform is een nieuwe methode om photoactivate een enzym met behulp van NIR en vermijdt de ongewenste signaaltransductie reactie van cellen veroorzaakt door conventionele UV-bestraling-2,4.
Het is zeer moeilijk te translocate grote bioeffectors (bijvoorbeeld eiwitten) tussen de celmembranen controle van cellulaire activiteit. Hoewel deeltje-geïmmobiliseerd eiwit gemakkelijker translocate via endocytose in het cytosol wellicht, kan endocytose worden beschadigd of gedegradeerd via endosomal entrapment en de daaruit voortvloeiende lysosomale afbraak2,4. Misschien zelfs als de gekooide proteïne nog steeds functioneel na membraan translocatie is, de translocated bedragen niet genoeg om het activeren van de cellulaire reactie2,17. In schril contrast is microinjection een directe en kwantitatieve benadering leveren grote bioeffectors naar het cytoplasma van de cel. Bovendien vereist de bioeffector UCNP-geïmmobiliseerd upconverted licht te worden geactiveerd. De optische instrumenten vereist daarom verdere wijziging te meten, visualiseren, en gebruik maken van het licht upconversion. In dit werk, zal de levering van een gekooide PKA-UCNP-complex naar een cel met behulp van microinjection en de volgende essentiële spectroscopie en microscopie wijzigingen voor NIR photoactivation in detail worden beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: het protocol beschrijft een wijziging van de gedetailleerde instrumentatie voor upconversion-assisted photoactivation, een synthetische procedure voor het genereren van gekooide PKA-UCNP, transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) van de silica beklede UCNP en gekooide PKA-UCNP monsters, UV- en NIR fotolyse setup cel voorbereiding, microinjection van de PKA-UCNP, een photoactivation studie en de stress vezel kleuring van REF52 cellen.
1. Fluorimeter Setup voor Upconversion Spectrum meting
- installeren van een 4 X objectief naast de houder van de meetcel van de fluorescentie-spectrometer, zodat de laser is gericht op het midden van de Cuvet.
- Plaats een afstembare 0,5 - tot 8-W 980-nm laserdiode 90° tegen de objectief.
Let op: De exploitant moet kennen met de veiligheid van laser en NIR laser veiligheidsbril dragen. - Installeren een volledige reflectie-spiegel in het lichtpad snijpunt van het objectief en de laser. Een zwart geanodiseerde metalen plaat te blokkeren van het venster van de excitatie van de spectroscopie en om de inwendige delen te beschermen plaatst.
- Plaatst de meetcel van silica beklede UCNP oplossing (0.2 - 0.6 mg/mL) in de meetcel houder zodat een straal licht upconversion kan worden gevisualiseerd en kan worden gebruikt om de beste licht uitlijning voor spiegel installatie aanpassen.
- De spectroscopie overschakelen naar luminescentie modus met laagste bet spanning instelling (pas aan een hogere instelling als het signaal te zwak is). Aanpassen van de spiegel tot de beste uitlijning, waar de lichtbundel is op het midden van de meetcel en de bet pikt het sterkste signaal.
- Meet het upconversion spectrum, na aanpassing, aan de instelling van het gewenste vermogen. Gebruik een energiemeter thermische stapel om te bouwen van een ijkcurve van laser macht tegen de elektrische huidige lezing op de voeding van de laser. Constant controleren van de prestaties van de laser om ervoor te zorgen dat de prestaties de geijkte gasgroep is.
2. Microscoop Setup
Opmerking: de volgende installatie werkt voor microscopen uitgerust met een optische weglengte van tweelagige. Als de gebruiker wil installeren een excitatie lichtbron switch in de achterste poort om de NIR-laser en de HQI lamp dezelfde poort te maken, zal de collimator in de achterste poort aanzienlijk de NIR blokkeren omdat het is ontworpen om de verwarming van het monster. De gebruiker moet een moeilijke keuze maken: Houd de collimator en lijden aan zeer lage upconversion efficiëntie, of verwijderen van de collimator en offeren van de intensiteit van excitatie licht voor de epifluorescence.
Opmerking: een cutaway diagram toont de lichtpad regeling voor een gewijzigde spectrofluorometer, de microscopie voor upconversion luminescentie en NIR fotolyse modus en voor epifluorescence en UV fotolyse modus, en de experimentele opzet gebruikt voor dit experiment worden geïllustreerd in Figuur 2.
- Equip de fluorescentie Microscoop met een lichte HQI gids, gericht op de achterkant poort.
Opmerking: In dit bovenste laag licht pad waar er een kubus torentje, één kubus positie moet leeg te voorzien van NIR afkomstig uit de lagere laag licht pad - Installeren een afstembare 0,5 tot 8,0 W 980 nm laserdiode in de rechterkant haven, met de open kant-poort-collimator.
Opmerking: Dit vergroot de laser licht plek aan circa 500 µm in diameter als een 10 X-objectief wordt gebruikt. Het verwijderen van deze collimator resulteert in een micrometer gasgroep lichte plek en NIR cel bestraling onpraktisch maakt. Deze collimator is NIR-transparante. - Installeer een dichroïde spiegel (850-nm korte-pass) en een excitatie-filter (950 nm long pass) in de lagere laag licht cmd.
- Gebruiken een UCNP oplossing te visualiseren van de NIR lichte plek. Pas de positie van de laser het NIR lichtstraal in het gezichtsveld tot finish de uitlijning centreren.
3. Bereiding en karakterisatie van Caged PKA-UCNP bouwen
- Incubate recombinante PKA (9 µM) met 0.5 mM 2-nitrobenzylbromide (NBB) in kooien buffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, en 10 mM MgCl 2; pH 8,5) voor 1-2 h bij 25 ° C. Quench de overtollige NBB met 10 mM dthiothreitol (DTT) en klik vervolgens dialyze tegen 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic zuur (HEPES) buffer (10 mM, pH 7.5) te verwijderen van de overtollige reagentia en zouten.
Opmerking: De pH van de oplossing caging is verlaagd van 8,5 tot 7.5 tijdens dialyse met HEPES pH 7.5 voor de latere immobilisatie reactie. - Mix de lanthanide zouten-Y(CH3CO2) 3 hydraat (99,9%, 0.4527 g, 1.38 mmol), Yb (CH 3 CO 2) 3 hydraat (99,9%, 0.2533 g, 0.60 mmol) en Tm (CH 3 CO 2) 3 hydraat (99,9%, 0.0168 g, 0,02 mmol)-octadecene (30 mL) en oliezuur (12 mL), verwarm het mengsel tot 115 ° C gedurende 30 minuten, en ze afkoelen tot 50 ° C. Vervolgens los het reactiemengsel in een oplossing in methanol (20 mL) met 0,2 g (5.0 mmol) van NaOH pellet en 0.2964 g (8 mmol) ammonium fluoride met het ultrasoonapparaat voor 15 min. verhogen de temperatuur van de reactie tot 300 ° C om de kern van de UCNP (β-NaYF 4 : 1,0% Tm 3 + / 30% Yb 3 +) nanodeeltjes.
- Los de kern nanodeeltjes (25 mg) met CO-520 (0,5 mL) in cyclohexaan (10 mL). Ammoniak (wt 30% v/v, 0,08 mL) en tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) toevoegen en toepassen van constant roeren gedurende 12 uur bij kamertemperatuur te krijgen van de silica beklede β-NaYF-4: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + core nanodeeltjes.
- Broeden de PKA (6 nmol) of PKA caged (6 nmol) met UCNP (1 mg) 15 in HEPES-buffer (10 mM, pH 7.5) bij 4 ° C gedurende 3 uur te immobiliseren van de PKA van UCNP silica beklede via Elektrostatische interacties.
- Filteren het mengsel met behulp van PVDF filter (0,45 µm), centrifuge op 17.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, en redisperse van de pellet in HEPES (50 µL, 10 mM, pH 7.5) met 0,1% eiwit stabilisator te verkrijgen van het gezuiverde PKA-UCNP complex. Centrifugeer bij 17.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en het verzamelen van het supernatans dat voor een analyse van Bradford in een tube 1.5-mL.
- Analyseren de onbegrensde PKA in supernatant behoed stap 3.5 met een analyse van Bradford voor het rug-berekenen van het niveau van de PKA-vervanging voor de UCNP deeltjes, die normaal zijn vervanging van ~ 4.5 nmol van PKA per mg van deeltje.
Opmerking: De analyse van Bradford onthult een sterke blauwe kleur op de pellets, waarin wordt voorgesteld een vlak en stabiel eiwitrijk immobilisatie zonder desorptie, terwijl het supernatant Fractie van gekooide PKA-UCNP oplossing toont een kleur vergelijkbaar HEPES-buffer ( Figuur 4 c-4e).
4. Karakterisering van
Opmerking: de kinase bepaling wordt gebruikt voor het kwantificeren van de specifieke activiteit van pyruvaat kinase. Kortom, resulteert de fosforylering van de peptide, die is gekoppeld aan pyruvaat kinase en lactaat dehydrogenase, in de oxidatie van NADH. Vorming van laatstgenoemde wordt gecontroleerd door het meten van de afname van de absorptie van NADH bij 340 nm.
- Bepalen de activiteit van de PKA en PKA-UCNP in een 60 µL totaalvolume van assay mengsel met 4-morpholinepropanesulfonic zuur (MOPS, 100 mM, pH 7.5), KCl (100 mM), phosphoenolpyruvate (PEP, 1 mM), adenosine trifosfaat (ATP, 1 mM), β - Nicotinamide adenine dinucleotide, minder vorm (NADH, 0.8 mM), magnesiumchloride (MgCl 2, 1 mM), kemptide (0,4 mM) en een pyruvaat kinase/lactaat dehydrogenase mengsel (30/40 eenheden van PK/LDH).
- Meten de afname van de NADH extinctie na verloop van tijd na de toevoeging van PKA oplossing (2 µL) aan het mengsel assay. Berekenen van de helling van de lijn rechtstreeks aan de activiteit van de gemeten kinase.
- Meten van de activiteit van de PKA-UCNP 15 en de algehele activiteit, die moet ook gepaard gaan met het product van de vermenigvuldiging van inheemse PKA-specifieke activiteit en het berekende bedrag oppervlak-coated PKA.
5. Fotolyse Setup
- Measure alle macht van het licht bronnen met behulp van een thermische stapel sensor en macht dichtheden berekenen (PD = vermogen (W) / Area (cm 2)) 18 gebaseerd op de lichte plek.
- In vitro UV fotolyse experimenten uitvoeren op een commercieel systeem met een 365 nm LED (200 mW/cm 2) 15.
- Voor UV-photoactivation in het werkgebied van de Microscoop, verlichten de PKA-UCNP oplossing met de excitatie licht gefilterd door een commerciële kubus 15.
Opmerking: De vermogensdichtheid is ~ 15 mW/cm 2, zonder objectief gericht. - Voor in vitro NIR photoactivation in het werkgebied van de Microscoop, verlichten de PKA-UCNP oplossing met behulp van een 980 nm laser met aangepaste upconversion filter/spiegel instellingen geïnstalleerd op de lagere-tier licht pad, een dichroïde spiegel (850 nm korte-pass), en een excitatie-filter (950 nm long pass).
Opmerking: De vermogensdichtheid van de uitvoer is 5 W/cm 2 vóór 4 X objectief gericht. De vermogensdichtheid wordt geschat op ~ 68 W/cm 2 na 4 X het objectief gericht.
6. Cel monstervoorbereiding en Microinjection van de complexen van de PKA-UCNP
- vooraf Filtreer de monsters door een 0,45 µm filter na PKA immobilisatie (stap 3.5).
- Incubeer de cellen in het foetale runderserum (FBS) 10% met L-15 medium gedurende de periode van microinjection voor stabiele pH-control buiten de incubator.
Opmerking: als u wilt bevestigen dat microinjection is voltooid, mede injecteren de inheemse PKA-UCNP, gekooide PKA-UCNP of PEGylated UCNP (7,5 mg/mL) 15 met 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) (10 µM) in naar cellen. - Aanpassen de concentratie van de PKA-UCNP deeltjes zodanig is dat na microinjection, de cytosolische concentratie 1-3 μM PKA - een fysiologische concentratiebereik voor PKA in een cel, met de veronderstelling dat het geïnjecteerde volume 1/10 van cellulaire volume .
- De microinjection in de cellen (stap 6.2) uitvoeren met behulp van een microinjector apparaat in combinatie met een één-assige hydraulisch micromanipulator ( Figuur 3).
- Gebruik een digitale manometer te controleren van de druk van de microinjector in het meetbereik is (~ 50-200 hPa) en de klep van de dispenser in een aangepaste pressuring kamer te verstrekken compensatie druk voor microinjection verzegelen. Terugtrekken van de naald met behulp van een trekker.
- Injectie druk tussen 50 en 75 hPa, met een tijd van de injectie van 200-300 ms en de druk van de compensatie bij 15 hPa om te voorkomen dat kweekmedium terugvoer in naald door capillaire werking blijven.
- Onderzoeken van de openingen van de tip van de naalden om ervoor te zorgen dat ze een uitwendige diameter van tussen 1,3 en 1,5 µm, die kan worden bevestigd door het nemen van beelden met behulp van een objectief 40 x.
- Wassen de cellen met 2 mL van L-15 medium met 10% FBS na de microinjection. Observeren van de cellulaire fluorescentie beeldvorming van 5 (6) - carboxytetramethyl - rhodamine (TAMRA) kunt bevestigen microinjection voltooid.
7. Photoactivation van Caged PKA-UCNP met behulp van UV- of NIR licht in levende cellen
- voor UV photoactivation na de PKA-UCNP microinjection, groeien de REF52 cellen op een schotel van 3,5 µm, plaats ze op het podium van de Microscoop en ze bestralen met UV-licht gefilterd door de kubus voor 3 min zonder objectief gericht.
Opmerking: REF52 cellen werden onderhouden in DMEM met 10% FBS bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator en cellen waren subcultured toen de confluentie tot 90% elke 2-3 dagen bereiken. - Voor NIR photoactivation na PKA-UCNP microinjection, verlichten de cellen op een laser 980-nm uit lagere-tier filter/spiegel instellingen, zoals beschreven in stap 5.4.
Opmerking: Het vermogen van de dichtheid is 5 W/cm 2 vóór 10 X objectief gericht en wordt geschat op 300 W/cm 2 na 10 x objectief gericht. Upconversion is een proces dat vereist een hoge foton dichtheid, vooral wanneer een grotere verschuiving van de anti-Stoke nodig is. Vandaar, gericht is nodig tijdens photoactivation. - Wanneer een grotere lichte plek (650 µm x 520 µm) vereist is, deze cellen met NIR gericht door een 10 x-objectief met een collimator voor 15 min. toestaan voor een donkere interval van 5 minuten na elke 5-min bestraling te vermijden verwarming bestralen.
Opmerking: Wanneer een hoge ruimtelijke resolutie (subcellular lichte plek) vereist is, gebruik de 40 X-objectief met een gaatje in het einde van de afrit van de lichtgeleider geïnstalleerd voor het genereren van een lichte plek van subcellular-dimensie (5 µm x 4 µm). In dit geval, 1 s van bestraling is genoeg voor NIR photoactivation als gevolg van de hoge flux van fotonen. - Na UV- of NIR fotolyse, de cellen te herstellen in een 5% CO 2 incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur in volledige medium voor het genereren van cellulaire reacties toestaan. Vervolgens kunt u ze vóór verdere vlekken in 1 mL 4% paraformaldehyde-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor 20 min.
Let op: Paraformaldehyde is zeer giftig; Vermijd contact met huid, ogen en slijmvliezen. Vermijd inademen van het poeder tijdens het meten en voorbereiding.
8. Visualisatie van Stress Fiber desintegratie veroorzaakt door NIR Photoactivation
- na fixatie, gebruiken Alexa 594-phalloidin (5 µL van 6,6 µM stockoplossing toevoegen aan 200 µL van PBS voor kleuring; Incubeer gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur) om vlek en Visualiseer de stress vezels. Visualiseren van de beelden van Alexa 594-phalloidin (Ex 581 nm/Em 609 nm) met behulp van een filter set.
- Incubeer de cellen gedurende 5 min. in 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) bij kamertemperatuur. Na kleuring, wassen van de monsters met PBS en fluorescerende beelden van de vezels van de stress en de kernen afzonderlijk nemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het ontwerp van de gekooide enzym-UCNP constructie wordt geïllustreerd in Figuur 1. Het enzym PKA was eerst reageerden met 2-nitrobenzyl bromide (en) voor het genereren van een inactieve gekooide PKA, en het werd vervolgens via een elektrostatisch proces geïmmobiliseerd op het oppervlak van UCNP. UCNPs de upconverted licht uitstralen en dus photolytically het klieven van de o-nitrobenzyl groepen op Cys 199 en Cys 343, het genereren van de geactiveerde PKA. TEM beelden en analyse van Bradford bevestigd dat de PKA en gekooide PKA waren geïmmobiliseerd op het oppervlak van UCNPs, en het kinaseactiviteit van gekooide PKA-UCNP oplossing na UV photoactivation was vehiculumcontrolegroep (Figuur 4). Na PKA immobilisatie, een instrument van Dynamische lichtverstrooiing bleek de grootte en de potentie van de zeta van de PKA-deeltje complex om 120 nm en-16.0 mV, respectievelijk. De analyse van Bradford van de PKA-UCNP oplossing bleek een sterke paarse kleur op de deeltjes, die een vlak en stabiel eiwitrijk immobilisatie suggereert.
REF52 rat embryonale fibroblast cellen werden geselecteerd voor de studie van photoactivation in het cellulaire experiment. In dit experiment, kan de PKA-traject worden ingeschakeld door endogene activering van de PKA (die wordt geactiveerd door de incubatie van cel-permeabele 8-CPT-cAMP) of de microinjection van de PKA van actieve of triggerable. Geactiveerde PKA (met of zonder deeltje immobilisatie) de stress vezels uiteenvalt en blootstelt meer filamenteuze actine (F-actine) oppervlak en vandaar fluorophore-label phalloidin, dat sterk aan F-actine bindt, levert een hogere kleuring signaal. Na 8-CPT-cAMP incubatie of microinjection van de gratis PKA, actieve PKA-UCNP of UV-geactiveerde PKA-UCNP (als positief-control-experimenten) bevestigd die wij de aanwezigheid van sterke stress vezel desintegratie veroorzaakt door PKA traject activering (Figuur 5). Zowel endogene PKA en microinjected PKA studies tonen geheel-cel stress vezel desintegratie, terwijl PKA (actieve PKA-UCNP en UV-geactiveerde PKA-UCNP) geeft stress vezel desintegratie is deeltje-geïmmobiliseerd alleen op de site van microinjection, verder suggereren de stabiele immobilisatie van PKA op de UCNPs. Voor het NIR photoactivation experiment, na de microinjection van de gekooide PKA-UCNP en het NIR-bestraling, UCNPs upconverted licht uitstralen en de o-nitrobenzyl groepen op Cys 199 en Cys 343 klieven. Dus ze genereren de geactiveerde PKA, gedesintegreerd stress vezels en een hogere signaal opbrengst door fluorophore-label phalloidin kleuring (Figuur 6). Negatieve-control-experimenten op cellen van de REF52 microinjected met UCNP zonder de gekooide PKA en vervolgens NIR-bestraalde, evenals REF52 cellen met gekooide PKA-UCNP in de afwezigheid van bestraling, toonden geen effect op stress vezel integriteit.
Figuur 1 . Illustratie van gekooide PKA-UCNP Design en Upconversion-bijgewoonde PKA Uncaging. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Een Cutaway Diagram toont de regeling lichtpad. (een) gewijzigd spectrofluorometer en (b) Microscoop voor upconversion luminescentie en NIR fotolyse modus (links) en voor epifluorescence en UV fotolyse modus (rechts), evenals hun experimentele opzet. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Experimentele opstelling voor Microinjection. De houder van de injectie gaat gepaard met een één-as olie hydraulische micromanipulator onder een hoek tussen 30° en 45°. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Bevestiging van PKA immobilisatie op UCNP. TEM beelden van (een) silica beklede UCNP en (b) gekooide PKA-geïmmobiliseerd UCNP; De analyse van Bradford van (c) HEPES-buffer, (d) de pellet breuk resuspensie van gekooide PKA-UCNP oplossing en (e) het supernatant Fractie van gekooide PKA-UCNP oplossing; en (f) kinase activiteit assay van gekooide PKA-UCNP oplossing na UV-photoactivation. Dit cijfer is weergegeven van Gao, H.-D. et al. na uitdrukkelijke toestemming werd verkregen van de uitgever, de American Chemical Society. Schaal bar = 20 nm Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Fluorescentie beelden van Stress Fiber kleuring (groen) en DAPI kleuring van de kernen (blauw) van REF52 cellen, waaruit Stress Fiber desintegratie en morfologische veranderingen veroorzaakt door de activering van verschillende PKA. (een) Untreated cellen, (b) 8-(4-Chlorophenylthio) adenosine 3', 5'-cyclisch monofosfaat (8-CPT-cAMP)-cellen, (c) actieve PKA-microinjected cellen, cellen voor actieve PKA-UCNP-microinjected (d) en ( behandeld e) gekooide PKA-UCNP-microinjected cellen na UV bestraling. (f-j) De optische dichtheid (OD) foto's ontleend (a-e), respectievelijk. (k-o) De overeenkomstige intensiteit bochten langs de blauwe pijl. De witte pijl geeft de microinjected cel. De schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Fluorescentie beelden van REF52 cellen met verschillende vormen van de PKA Microinjected. Cellen met (een) microinjected caged PKA-UCNP na de bestraling NIR, (b) UCNP PEG-geënt onder NIR bestraling, en (c) gekooide PKA-UCNP zonder bestraling. (d-f) De upconverted uitstoot van UCNP (in het onderbroken vak) voor (a-c). (g-i) Samengevoegde afbeeldingen van de stress vezels (groen), upconversion emissies (rood) van de complexe UCNP en DAPI kleuring van kernen (blauw). NIR photoactivation van de cellen werd uitgevoerd op een verhelderend oppervlakte van 650 µm x520 µm met behulp van een 10 X-objectief. De fluorescentie-beelden werden verkregen met behulp van een 40 X-objectief. Vandaar, het NIR bestraling gebied werd teruggebracht tot 150 µm x 120 µm, zoals aangegeven in de onderbroken rood kader. De upconversion luminescentie kan worden gezien in (c). Voor kwantificering studies ImageJ met, waren od afbeeldingen (j-l) afgeleid van onder a-c, respectievelijk. Intensiteit bochten langs de blauwe pijl weergegeven in (j-l) werden uitgezet in (m-o). Een hoge signaal-ruisverhouding (S/N) werd waargenomen voor dit systeem en wordt beschouwd als een positieve reactie. Deze aanpak werd toegepast voor alle Alexa 594-phalloidin kleuring ondermeer. De witte pijl geeft de microinjected cel. De schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eerder, Hofmann en collega's vinden dat dramatische morfologische veranderingen werden waargenomen in de REF52 cellen na de microinjection van de gratis PKA-19. In een andere studie, de groep Lawrence aangetoond dat gekooide PKA geactiveerd in vivo worden kan, wat leidt tot morfologische veranderingen en het uiteenvallen van stress vezels wanneer onderworpen aan UV fotolyse20. Eerder verslagen over het benutten van upconverted UV licht voor photoactivation toonde de activering van de verschillende UCNP-bijgewoonde gekooide, kleine moleculaire bioeffectors21,22,-23. Een protocol moet worden gebruikt UCNP-bijgewoonde photoactivation op de belangrijkste klasse van bioeffector, het enzym, moet echter nog worden ontwikkeld. Vandaar, in deze studie beschrijven we een cellulaire experiment-protocol waarin de NIR photoactivation van gekooide PKA met behulp van UCNPs. In dit NIR photoactivation platform, werd gekooide PKA20 geïmmobiliseerd op het oppervlak van silica beklede UCNPs gebruikt om aan te tonen van de haalbaarheid van de controle op de signaaltransductie traject van de cel met behulp van NIR als een trigger. De cellen van de REF52 microinjected met een gekooide PKA-UCNP bouwen en bestraald met NIR toonden een effect op stress vezel desintegratie, evenals de morfologische veranderingen binnen de cellen. Bovendien waren de positieve - en negatieve-control-experimenten uitgevoerd en bleek dat de PKA-geïnduceerde traject leidt tot het uiteenvallen van stress vezels wordt geactiveerd door NIR bestraling.
De wijziging van het instrument wordt beschreven in dit manuscript, terwijl de PKA chemische modificatie is goed gedocumenteerd elders15. Als een goed ontworpen experiment probleemoplossing vereist, eerst vaststellen of de problemen zijn gegenereerd op basis van: (i) de eiwit-UCNP complex, (ii) microinjection, of (iii) optische instrumentatie. In geval van eiwit photoactivation problemen: (1) zorg zeker dat de PKA is actief, (2) bevestigen dat de gekooide PKA residuele activiteit die heeft < 5% van de oorspronkelijke waarde (3) vast dat de UV-uncaged PKA heeft ten minste 50% van haar activiteiten hersteld, (4) zorg zeker dat de gekooide PKA is geïmmobiliseerd op het oppervlak van de UCNP (het uitvoeren van een analyse van Bradford), en (5) zorgen ervoor dat de gekooide PKA-UCNP ook ten minste 50% van haar activiteiten hersteld heeft (door UV-bestraling uit te voeren). Voor microinjection problemen: (1) Controleer zeker die naald tip is open en de eiwit-UCNP oplossing correct wordt geladen. Plaats het geladen naald (tip) op een microscoop met een kanaal NIR excitatie. Indien upconversion fluorescentie wordt waargenomen, wordt het laden klopt. (2) het injecteren van de eiwit-UCNP in de cellen en observeren van de intensiteit van de fluorescentie van mede ingespoten 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) kleurstof en upconversion deeltje. Juiste injectie zal resulteren in een intens TAMRA en upconversion deeltje fluorescentie in de cellen. Voor het oplossen van Microscoop optische wijziging: (1) Verwijder de objectief, inschakelen van de NIR-laser, en zetten de thermische stapel vermogenssensor meter in het werkgebied van de Microscoop voor het meten van het NIR, die niet geblokkeerd moet worden door een onjuiste instelling. (2) Installeer de objectief en zet een transparante-onderstuk cuvette gevuld met 10 mg/mL UCNP in het werkgebied van de Microscoop. Een scherpe blauwe balk in de oplossing zal worden gezien als de optica allemaal goed zijn geïnstalleerd.
Microinjection kan slechts een beperkt aantal cellen bieden voor analyse. Het slagingspercentage van de injectie is exploitant (of ervaring)-afhankelijk, dat is een belangrijke beperking van deze techniek. Echter, er is geen andere manier om te omzeilen het tot nu toe. Veel wetenschappers suggereren dat het gebruik van deeltje-cel incubatie de deeltjes de cellen die de opname maakt. Dit is echter niet een haalbare aanpak. Zelfs als cellulaire deeltje opname optreedt en het bedrag van de opname genoeg is, zal het zich ophopen in Endosomen/lysosomen, maar niet in het cytosol. Dit specifieke signaaltransductie enzym moet worden gevestigd in het cytosol, niet Endosomen, effectief te zijn. Bovendien, wanneer PKA is opgelost in een buffer van de perfecte opslag bij 37 ° C, haar activiteiten niet duurt na overnachting opslag. De stabiliteit van het enzym in cel kweekmedium is nog korter, en het maakt de incubatie aanpak onpraktisch.
Dit meldde instrumentale setup, microinjection en kinase NIR photoactivation protocol moet algemeen toepasbaar, niet alleen voor chemisch gewijzigde kinase, maar ook voor andere klassen eiwit of enzym. Bovendien, het zou zinvol in cellulaire studies waar de directe UV-blootstelling is ongewenst. Verder, de gekooide bioeffector-UCNP-complex kan communiceren met extracellulaire doelen, zoals membraaneiwitten of membraan receptoren, het vermijden van het probleem van het intracellulair levering en toepassing op in vivo gebruik maken van het platform. Na I.V. injectie krijgen gekooide eiwit hormonen of therapeutische eiwitten de geactiveerde vorm van de bioeffector alleen in NIR-bestraalde regio's.
Microinjection is de meest kritische stap in dit protocol. Voor nauwkeurige injectie, Vermijd bellen tijdens het laden van de naald. Na het laden, onmiddellijk de naald in de injector installeren en de naald tip onderdompelen in het medium om te voorkomen dat de naald tip van drogen, die leiden verstopping tot zal. Microinjection exploitant vaardigheid is essentieel voor een hoger tarief van succesvolle injectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij danken de Nano-wetenschap en technologie programma van de Academia Sinica en het ministerie van wetenschap en technologie van Taiwan voor de financiering (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Ammonium hydroxide (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
