Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

एक एकीकृत प्रणाली को दूर करने के लिए Intracellular संकेत Transduction द्वारा ट्रिगर Nanoparticle-मध्यस्थता कळेनासे Photoactivation

Published: August 30, 2017 doi: 10.3791/55769
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 3, 1,2, 1
1Institute of Chemistry, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University, 3Department of Materials and Mineral Resources Engineering, National Taipei University of Technology

Summary

इस प्रोटोकॉल में, पिंजरा प्रोटीन कळेनासे ए (PKA), एक सेलुलर संकेत transduction प्रभाव, एक nanoparticle सतह पर स्थिर था, microinjected में cytosol, और निकट अवरक्त (NIR) विकिरण, उत्प्रेरण से ऊपर से ऊपर से नीचे की ओर यूवी प्रकाश द्वारा सक्रिय बहाव cytosol में तनाव फाइबर विघटन ।

Abstract

nanoparticle (UCNP)-मध्यस्थ photoactivation दूर से बहुत कम phototoxicity के साथ और गहरे ऊतक पैठ के साथ अप्रभावियों को नियंत्रित करने के लिए एक नया दृष्टिकोण है । हालांकि, बाजार पर मौजूदा उपकरण रूपांतरण आवेदन के साथ आसानी से संगत नहीं है । इसलिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध साधन को संशोधित करना इस शोध के लिए आवश्यक है । इस पत्र में, हम पहले एक पारंपरिक fluorimeter और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के संशोधनों को समझाने के लिए उंहें फोटॉन रूपांतरण प्रयोगों के लिए संगत बनाते हैं । हम तो एक निकट-अवरक्त (NIR) के संश्लेषण का वर्णन-ट्रिगर पिंजरा प्रोटीन कळेनासे एक उत्प्रेरक उपइकाई (PKA) एक UCNP परिसर में मैटीरियल । microinjection और NIR photoactivation कार्यविधियों के लिए पैरामीटर्स भी सूचित किए जाते हैं । के बाद बंदी PKA-UCNP REF52 fibroblast कोशिकाओं में microinjected है, NIR विकिरण, जो काफी पारंपरिक यूवी विकिरण से बेहतर है, कुशलतापूर्वक रहने वाले कोशिकाओं में PKA संकेत transduction मार्ग चलाता है । इसके अलावा, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों की पुष्टि करते हैं कि PKA-प्रेरित मार्ग तनाव तंतुओं के विघटन के लिए अग्रणी विशेष रूप से NIR विकिरण द्वारा ट्रिगर किया जाता है । इस प्रकार, प्रोटीन का उपयोग संशोधित UCNP दूर प्रकाश संग्राहक सेलुलर प्रयोगों, जिसमें यूवी प्रकाश के लिए प्रत्यक्ष जोखिम से बचा जाना चाहिए नियंत्रण के लिए एक अभिनव दृष्टिकोण प्रदान करता है ।

Introduction

रासायनिक संशोधित प्रोटीन है कि photoactivated जा सकता है (जैसे, PKA पिंजरा प्रोटीन) गैर इनवेसिव हेरफेर करने के लिए रासायनिक जीवविज्ञान में एक उभरते हुए क्षेत्र के रूप में विकसित किया गया है सेलुलर जैव रासायनिक प्रक्रियाओं1,2 ,3. एक उत्तेजना के रूप में प्रकाश का प्रयोग उत्कृष्ट spatiotemporal जब इन पिंजरा प्रोटीन को सक्रिय संकल्प प्रदान करता है । हालांकि, यूवी प्रकाश अवांछित रूपात्मक परिवर्तन, apoptosis, और कोशिकाओं के लिए डीएनए क्षति4,5पैदा कर सकता है । इसलिए, photocaging समूहों के डिजाइन में हाल की घटनाओं पर photocleavage को सक्षम करने पर ध्यान केंद्रित अब-तरंग दैर्ध्य या दो-फोटॉन उत्तेजना phototoxicity को कम करने के लिए, साथ ही साथ गहरी ऊतक पैठ बढ़ाने के लिए6,7. Caging समूहों है कि लंबे समय तक हमें उपयुक्त uncaging तरंग दैर्ध्य (जैसे, चैनल चुन कर चुनने के लिए अनुमति तरंग दैर्ध्य का जवाब है चुनिंदा जब दो या अधिक Caging समूहों7मौजूद है अप्रभावियों को सक्रिय करने के लिए । इन उपयोगी सुविधाओं को देखते हुए, नए लाल बत्ती photocaging समूहों के विकास के लिए बहुत महत्वपूर्ण है photochemical के तरीके में जैविक अध्ययन के लिए सेलुलर गतिविधियों को नियंत्रित करने के लिए प्रतिक्रियाओं के तंत्र को लेकर8। बहरहाल, एक दो फोटॉन caging समूह आम तौर पर भी जुड़े खुशबूदार अंगूठी संरचना के कारण hydrophobic है, और एक दृश्य प्रकाश caging समूह आम तौर पर खुशबूदार organometallic के साथ, लाइगैंडों है । इस hydrophobic/खुशबूदार संपत्ति उपयुक्त नहीं है जब जैव अप्रभावी एक प्रोटीन या एंजाइम है, क्योंकि यह एंजाइम/प्रोटीन और समारोह के नुकसान का कारण बनता है की सक्रियण साइट विकृत, भले ही विकार और photolysis अभी भी रासायनिक स्तर पर काम2 ,9.

UCNPs प्रभावी ट्रांसड्यूसर हैं जो NIR उत्तेजना लाइट को यूवी में कन्वर्ट करते हैं । UCNPs की इस अनूठी और आकर्षक संपत्ति photoactivation के साथ जुड़े चुनौतियों का पता करने के लिए यथार्थवादी संकल्प की पेशकश की है और छोटे अणुओं के शुरू नियंत्रित जारी, फोलिक एसिड सहित10, सिस्प्लैटिन डेरिवेटिव11 , डीएनए/सिरना12, copolymer बुलबुले13, और खोखले कणों14. हालांकि, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, एंजाइमों या प्रोटीन के UCNP असिस्टेड photoactivation अब तक परीक्षण नहीं किया गया है । क्योंकि वहां लाल बत्ती या NIR का उपयोग करने के लिए एक एंजाइम photoactive का कोई सफल मामला है, हम प्रदर्शन करने के लिए प्रेरित किया गया एक प्रोटीन की NIR-ट्रिगर सक्रियण एक सिलिका लेपित के साथ रासायनिक संशोधित पिंजरा एंजाइम परिसरों से बना/ lanthanide-मैगनीज UCNP15. इस अध् ययन में UCNP ने तेजी से संयुग्मित से प्रतिक्रिया व्यक्त करते हुए संकेत transduction कळेनासे के रूप में पिंजरा PKA । PKA ग्लाइकोजन संश्लेषण और cytoskeletal विनियमन है कि चक्रीय adenosine फॉस्फेट के माध्यम से बाहरी उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रिया करता है नियंत्रण (cytosol में शिविर) विनियमन16. हम NIR विकिरण के बाद एक सेलुलर प्रयोग में अस्थाई और स्थानिक शिष्टाचार में एंजाइम सक्रियण की व्यवहार्यता का अध्ययन किया । इस UCNP-असिस्टेड photoactivation मंच NIR का उपयोग कर एक एंजाइम photoactivate करने के लिए एक नई पद्धति है और पारंपरिक यूवी विकिरण2,4की वजह से कोशिकाओं से अवांछित संकेत transduction प्रतिक्रिया से बचा जाता है.

सेलुलर गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए कोशिका झिल्ली के पार बड़े (जैसे, प्रोटीन) translocate के लिए बहुत मुश्किल है । हालांकि कण-मैटीरियल प्रोटीन cytosol में endocytosis के जरिए translocate आसान हो सकता है, endocytosis क्षतिग्रस्त या endosomal फंसाने और फलस्वरूप लाइसोसोमल क्षरण2,4के माध्यम से नीचा किया जा सकता है । यहां तक कि अगर पिंजरा प्रोटीन अभी भी झिल्ली translocation के बाद कार्यात्मक है, translocated मात्रा सेलुलर प्रतिक्रिया2,17ट्रिगर करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । तीव्र विषमता में, microinjection को कोशिका के कोशिका में बड़ा-सा प्रभाव देने के लिए प्रत्यक्ष और परिमाणात्मक दृष्टिकोण है. इसके अलावा, UCNP मैटीरियल अप्रभावी को सक्रिय किए जाने के लिए रूपांतरित प्रकाश की आवश्यकता होती है । इसलिए, ऑप्टिकल इंस्ट्रूमेंटेशन को मापने के लिए आगे संशोधन की आवश्यकता है, कल्पना, और रूपांतरण प्रकाश का उपयोग । इस काम में, एक पिंजरा PKA-UCNP microinjection का उपयोग कर एक सेल के लिए जटिल और NIR photoactivation के लिए निम्नलिखित आवश्यक स्पेक्ट्रोस्कोपी और सूक्ष्म संशोधनों का वितरण विस्तार से वर्णित किया जाएगा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

< p class = "jove_content" > ध्यान दें: प्रोटोकॉल रूपांतरण के लिए एक विस्तृत इंस्ट्रूमेंटेशन संशोधन-असिस्टेड photoactivation, एक सिंथेटिक प्रक्रिया के लिए पिंजरा लगाया PKA-UCNP, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) सिलिका लेपित UCNP उत्पन्न करने के लिए वर्णन करता है और बंदी PKA-UCNP नमूने, यूवी और NIR photolysis सेटअप, सेल तैयारी, PKA-UCNP microinjection, एक photoactivation अध्ययन, और REF52 कोशिकाओं के तनाव फाइबर धुंधला ।

< p class = "jove_title" > 1. Fluorimeter सेटअप for रूपांतरण स्पेक्ट्रम माप

  1. cuvette प्रतिदीप्ति के स्पेक्ट्रोमीटर धारक के बगल में एक 4x उद्देश्य लेंस स्थापित इतना है कि लेजर cuvette के बीच पर ध्यान केंद्रित है ।
  2. जगह एक स्वरित्र ०.५-to 8-W ९८०-एनएम लेजर डायोड ९० & #176; उद्देश्य लेंस के खिलाफ.
    चेतावनी: ऑपरेटर के लिए लेजर सुरक्षा ज्ञान है और NIR लेजर काले चश्मे पहनने की जरूरत है ।
  3. उद्देश्य लेंस और लेजर के प्रकाश पथ चौराहे में एक पूर्ण चिंतनशील दर्पण स्थापित करें । स्पेक्ट्रोस्कोपी की उत्तेजना विंडो ब्लॉक करने के लिए और आंतरिक भागों की रक्षा करने के लिए एक काले रंग का धातु की थाली में रखें ।
  4. cuvette cuvette धारक में सिलिका लेपित UCNP समाधान (०.२-०.६ मिलीग्राम/एमएल) की जगह है ताकि एक उज्ज्वल रूपांतरण बीम visualized किया जा सकता है और दर्पण स्थापना के लिए सबसे अच्छा प्रकाश संरेखण को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. स्विच करने के लिए स्पेक्ट्रोस्कोपी luminescence मोड के साथ सबसे कम PMT वोल्टेज सेटिंग (सिग्नल बहुत कमज़ोर है, तो एक उच्च सेटिंग को समायोजित करें). सबसे अच्छा संरेखण के लिए दर्पण समायोजित करें, जहां बीम cuvette के बीच पर है और PMT मजबूत संकेत उठाता है.
  6. रूपांतरण स्पेक्ट्रम, संरेखण के बाद, वांछित शक्ति की स्थापना के साथ उपाय । लेजर बिजली की आपूर्ति पर विद्युत वर्तमान पढ़ने के खिलाफ लेजर शक्ति का एक अंशांकन वक्र बनाने के लिए एक थर्मल ढेर बिजली मीटर का उपयोग करें । लगातार लेजर प्रदर्शन की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रदर्शन नपे सीमा के भीतर है ।
< p class = "jove_title" > 2. माइक्रोस्कोप सेटअप

< p वर्ग = "jove_content" > नोट: निम्न सेटअप एक दो स्तरीय ऑप्टिकल पथ के साथ सुसज्जित सूक्ष्मदर्शी के लिए काम करता है. यदि उपयोगकर्ता के लिए वापस बंदरगाह में एक उत्तेजना प्रकाश स्रोत स्विच स्थापित करना चाहता है NIR लेजर और halide लैंप शेयर एक ही बंदरगाह बनाने के लिए, वापस बंदरगाह में संधानक काफी NIR ब्लॉक क्योंकि यह नमूना हीटिंग को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । उपयोगकर्ता एक मुश्किल विकल्प बनाना चाहिए: में संधानक रखने के लिए और बहुत कम रूपांतरण दक्षता से पीड़ित हैं, या संधानक को हटाने और epifluorescence के लिए उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता बलिदान ।

< p class = "jove_content" > नोट: एक cutaway एक संशोधित spectrofluorometer के लिए प्रकाश पथ योजना दिखा आरेख, रूपांतरण luminescence और NIR photolysis मोड के लिए माइक्रोस्कोपी और epifluorescence और यूवी photolysis मोड के लिए, और प्रयोगात्मक सेटअप इस प्रयोग के लिए प्रयुक्त < सबल वर्ग में सचित्र हैं = "xfig" > चित्रा २ .

  1. एक धातु halide प्रकाश गाइड के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप लैस, पीठ बंदरगाह में निर्देश दिया ।
    नोट: इस ऊपरी-स्तरीय प्रकाश पथ में जहां एक घन बुर्ज है, एक घन स्थिति NIR के लिए अनुमति देने के लिए खाली होना चाहिए निचले स्तर प्रकाश पथ से आ रहा है ।
  2. एक स्वरित्र ०.५ के लिए ८.० डब्ल्यू ९८० एनएम लेजर डायोड स्थापित दाईं ओर बंदरगाह में, साइड पोर्ट संधानक खुला के साथ.
    नोट: यह लेजर प्रकाश स्थान में इजाफा के बारे में ५०० & #181; एम व्यास में जब एक 10x उद्देश्य लेंस का उपयोग किया जाता है । एक माइक्रोमीटर-रेंज प्रकाश स्थान में इस संधानक परिणाम निकाल रहा है और NIR कोशिका विकिरण अव्यावहारिक बनाता है । यह संधानक NIR-पारदर्शी है ।
  3. एक dichroic मिरर (८५०-एनएम शॉर्ट-पास) और लोअर-टियर लाइट पथ में एक उत्तेजना फ़िल्टर (९५० एनएम लांग-पास) स्थापित करें ।
  4. NIR प्रकाश स्थान की कल्पना करने के लिए एक UCNP समाधान का उपयोग करें । संरेखण समाप्त करने के लिए दृश्य के क्षेत्र में NIR प्रकाश बीम केंद्र के लिए लेजर की स्थिति को समायोजित करें.
< p class = "jove_title" > 3. तैयारी और बंदी का लक्षण वर्णन PKA-UCNP construction

  1. संयोजक PKA (9 & #181; एम) के साथ ०.५ मिमी 2-nitrobenzylbromide (NBB) में caging बफर (20 मिमी Tris-एचसीएल, १०० मिमी NaCl, और 10 मिमी MgCl 2 ; पीएच ८.५) के लिए 1-2 ज पर 25 & #176; ग. शमन अतिरिक्त NBB के साथ 10 मिमी dthiothreitol (डीटीटी) और फिर 4 के खिलाफ dialyze-(2-hydroxyethyl) पिपेराजीन-1-ethanesulfonic एसिड (HEPES) बफर (10 मिमी, पीएच ७.५) अतिरिक्त रिएजेंट और लवण को हटाने के लिए.
    नोट: caging समाधान के पीएच बाद में स्थिरीकरण प्रतिक्रिया के लिए HEPES पीएच ७.५ के साथ डायलिसिस के दौरान ८.५ से ७.५ तक कम है ।
  2. मिक्स द lanthanide साल्ट-वाय (CH 3 CO 2 ) 3 हाइड्रेट (९९.९%, ०.४५२७ g, १.३८ mmol), Yb (ch 3 CO 2 ) 3 हाइड्रेट (९९.९%, ०.२५३३ g, ०.६० mmol), और Tm (ch 3 CO 2 ) 3 हाइड्रेट (९९.९%, ०.०१६८ ग्राम, ०.०२ mmol)-octadecene (30 एमएल) और ओलिक एसिड (12 एमएल) में, मिश्रण को 30 मिनट के लिए ११५ & #176; c के लिए गरम करें, और उन्हें ५० & #176; c को ठंडा करें । अगले, 15 मिनट के लिए sonication द्वारा अमोनियम फ्लोराइड के NaOH गोली और ०.२९६४ ग्राम (8 mmol) के ०.२ ग्राम (५.० mmol) के साथ एक methanolic समाधान (20 मिलीलीटर) में प्रतिक्रिया मिश्रण भंग । प्रतिक्रिया तापमान को बढ़ाएं ३०० & #176; ग पाने के लिए UCNP कोर (& #946;-NaYF 4 : १.०% Tm 3 + /30% Yb 3 + ) नैनोकणों.
  3. (10 एमएल) cyclohexane में सह ५२० (०.५ एमएल) के साथ कोर नैनोकणों (25 मिलीग्राम) भंग । अमोनिया जोड़ें (wt 30% v/०.०८ मिलीलीटर) और tetraethylorthosilicate (टीओए, ०.०४ मिलीलीटर) और 12 ज के लिए लगातार क्रियाशीलता लागू करने के लिए कमरे के तापमान पर सिलिका-लेपित & #946;-NaYF 4 : 1.0% Tm 3 + /30%Yb 3 + कोर नैनोकणों.
  4. PKA (6 nmol) या पिंजरा PKA (6 nmol) के साथ UCNP (1 मिलीग्राम) < सुप क्लास = "xref" > 15 में HEPES बफर (10 एमएम, pH ७.५) पर 4 & #176; ग के लिए 3 ज के लिए PKA को सिलिका कोटेड UCNP पर इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के जरिए मैटीरियल.
    5. PVDF फ़िल्टर का उपयोग करते हुए मिश्रण को फ़िल्टर
  5. (०.४५ & #181; एम), 10 मिनट के लिए १७,००० x g पर 4 & #176 पर केंद्रापसारक; सी, और HEPES में गोली फिर से फैलाना (५० & #181; एल, 10 मिमी, पीएच ७.५) से युक्त ०.१% प्रोटीन स्थिरता प्राप्त करने के लिए शुद्ध PKA-UCNP परिसर । १७,००० पर 10 मिनट के लिए एक्स जी पर केंद्रापसारक 4 & #176; सी और एक १.५ एमएल ट्यूब में एक ब्रैडफोर्ड परख के लिए supernatant इकट्ठा ।
  6. विश्लेषण supernatant में असीम PKA एक ब्रैडफोर्ड परख के साथ कदम ३.५ से बचाया वापस करने के लिए PKA कणों पर UCNP प्रतिस्थापन स्तर की गणना, जो आम तौर पर nmol के ~ ४.५ PKA के कण के प्रति मिलीग्राम के एक प्रतिस्थापन स्तर है ।
    नोट: ब्रैडफोर्ड परख छर्रों पर एक मजबूत नीले रंग से पता चलता है, जो desorption बिना एक उच्च स्तर और स्थिर प्रोटीन जमावड़ा पता चलता है, जबकि बंदी PKA के supernatant अंश-UCNP समाधान एक HEPES बफर के समान रंग दिखाता है ( < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ४ c-4e ).
< p class = "jove_title" > 4. लक्षणीय

< p class = "jove_content" > नोट: कळेनासे परख के लिए पाइरूवेट कळेनासे की विशिष्ट गतिविधि का अंदाजा लगाया जाता है. संक्षेप में, पेप्टाइड की फास्फारिलीकरण, जो पाइरूवेट कळेनासे और स्तनपान कराने वाली डिहाइड्रोजनेज के लिए युग्मित है, नध के ऑक्सीकरण में परिणाम. ३४० एनएम में नध के अवशोषण में कमी को मापने से बाद के गठन पर नजर रखी जाती है.

  1. में PKA और PKA-UCNP की गतिविधि का निर्धारण ६० & #181; एल की कुल मात्रा परख युक्त मिश्रण 4-morpholinepropanesulfonic एसिड (MOPS, १०० मिमी, पीएच ७.५), KCl (१०० मिमी), phosphoenolpyruvate (स्फूर्ति, 1 मिमी), adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी, 1 मिमी), & #946;- nicotinamide adenine dinucleotide, कम रूप (नध, ०.८ मि. ग्रा.), मैग्नीशियम क्लोराइड (MgCl २ , १ मि.), kemptide (०.४ मि.), तथा एक पाइरूवेट कळेनासे/स्तनपान डिहाइड्रोजनेज मिश्रण (PK/LDH की 30/40 इकाइयों)
  2. के अलावा समय के साथ नध के अवशोषण में कमी को मापने के PKA समाधान (२ & #181; L) के अतिरिक्त परख मिश्रण को. लाइन की ढलान की गणना करने के लिए सीधे मापा जा रहा कळेनासे की गतिविधि को प्रतिबिंबित.
  3. PKA-UCNP < सुप वर्ग की गतिविधि को मापने = "xref" > 15 और समग्र गतिविधि, जो अच्छी तरह से देशी PKA-विशिष्ट गतिविधि और परिकलित PKA सतह लेपित राशि के गुणन उत्पाद के साथ मिलान किया जाना चाहिए ।
< p class = "jove_title" > 5. Photolysis सेटअप

  1. रहतद्ध एक थर्मल ढेर संवेदक का उपयोग कर प्रकाश स्रोतों के सभी शक्ति और बिजली की गणना घनत्व (पीडी = पावर (डब्ल्यू)/Area (सेमी 2 )) < सुप क्लास = "xref" > 18 लाइट स्पॉट एरिया के आधार पर ।
  2. परफॉर्म इन विट्रो यूवी photolysis प्रयोगों के साथ एक वाणिज्यिक प्रणाली पर ३६५ एनएम एलईडी (२०० मेगावाट/cm 2 ) < सुप क्लास = "xref" > 15 .
    3. माइक्रोस्कोप मंच पर यूवी photoactivation के लिए
  3. , एक वाणिज्यिक घन द्वारा फ़िल्टर उत्तेजना प्रकाश के साथ PKA-UCNP समाधान रोशन < सुप वर्ग = "xref" > १५ .
    नोट: विद्युत घनत्व है ~ 15 मेगावाट/सेमी 2 , उद्देश्य लेंस के बिना ध्यान केंद्रित ।
  4. के लिए इन विट्रो में NIR photoactivation माइक्रोस्कोप मंच पर, एक PKA मिरर (८५० एनएम शॉर्ट-पास), अनुकूलित रूपांतरण फ़िल्टर/दर्पण सेटिंग्स के साथ एक ९८० एनएम लेजर का उपयोग कर UCNP-dichroic समाधान रोशन, और एक उत्तेजना फ़िल्टर (९५० एनएम लंबे समय से गुजारें) ।
    नोट: उत्पादन शक्ति घनत्व है 5 W/सेमी 2 से पहले 4x उद्देश्य लेंस ध्यान केंद्रित । बिजली की सघनता का अनुमान है ~ ६८ W/सेमी 2 4x उद्देश्य लेंस ध्यान केंद्रित के बाद ।
< p class = "jove_title" > 6. सेल नमूना तैयारी और PKA-UCNP परिसरों की Microinjection

  1. PKA के बाद एक ०.४५ & #181; m फ़िल्टर के माध्यम से नमूनों को पूर्व फ़िल्टर करें (चरण ३.५).
  2. मशीन के बाहर स्थिर पीएच नियंत्रण के लिए microinjection अवधि के दौरान एल-15 मध्यम युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) में कोशिकाओं की मशीन ।
    नोट: microinjection पूरा होने की पुष्टि करने के लिए, सह सुई देशी PKA-UCNP, पिंजरा PKA-UCNP, या PEGylated UCNP (७.५ mg/मब) < सुप वर्ग = "xref" > 15 with 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (तमृ) (10 & #181; मी) in cells.
  3. PKA-UCNP कणों की एकाग्रता को समायोजित करें जैसे कि, microinjection के बाद, cytosolic एकाग्रता है 1-3 & #956; M PKA-एक कोशिका में PKA के लिए एक शारीरिक एकाग्रता सीमा, इस धारणा के साथ कि इंजेक्शन की मात्रा सेलुलर मात्रा का 1/10 है .
  4. कक्षों में microinjection निष्पादित करें (चरण ६.२) एक एक अक्ष हाइड्रोलिक के साथ युग्मित एक microinjector डिवाइस का उपयोग कर micromanipulator (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ ).
  5. microinjector द्वारा लागू दबाव की निगरानी करने के लिए एक डिजिटल दबाव गेज का उपयोग ऑपरेटिंग रेंज (~ 50-200 hPa) में है और microinjection के लिए क्षतिपूर्ति दबाव प्रदान करने के लिए एक स्वनिर्धारित दबाव चैंबर में मशीन वाल्व सील । एक खींचने का उपयोग कर सुई वापस खींचो.
  6. ५० और ७५ hPa के बीच इंजेक्शन दबाव बनाए रखने, 200-300 ms के एक इंजेक्शन समय और 15 hPa पर क्षतिपूर्ति दबाव के साथ केशिका कार्रवाई द्वारा सुई में संस्कृति मध्यम backflow को रोकने के लिए.
  7. सुई के टिप खुलने की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे १.३ और १.५ & #181 के बीच एक बाहरी व्यास है, एम, जो एक 40x उद्देश्य लेंस का उपयोग कर छवियों को लेने के द्वारा पुष्टि की जा सकती है.
    8. microinjection के बाद 10% FBS युक्त एल-15 मीडियम की 2 मिलीलीटर वाली कोशिकाओं को धो
  8. । सेलुलर प्रतिदीप्ति इमेजिंग 5 (6) से निरीक्षण-carboxytetramethyl-rhodamine (तमृ) microinjection पूरा होने की पुष्टि करने के लिए.
< p class = "jove_title" > 7. Photoactivation के PKA-UCNP के रहने वाले कोशिकाओं में यूवी या NIR प्रकाश का उपयोग कर

  1. के बाद यूवी Photoactivation के लिए PKA-UCNP microinjection, एक ३.५ पर REF52 कोशिकाओं बढे & #181; एम डिश, उंहें माइक्रोस्कोप मंच पर जगह है, और उंहें यूवी प्रकाश के साथ विकीर्ण द्वारा फ़िल्टर उद्देश्य लेंस के बिना 3 मिनट के लिए घन ध्यान केंद्रित ।
    नोट: REF52 कोशिकाओं DMEM में बनाए रखा गया था 10% FBS पर ३७ & #176; सी में एक 5% कं 2 मशीन, और कोशिकाओं उपसंस्कृति थे जब प्रवाह ९०% हर 2-3 दिन तक पहुंच गया ।
    2. NIR photoactivation के लिए
  2. PKA-UCNP microinjection के बाद, चरण ५.४ में वर्णित के रूप में, निचले-टियर फ़िल्टर/मिरर सेटिंग से ९८०-एनएम लेज़र पर कक्षों को रोशन करें ।
    नोट: बिजली घनत्व उत्पादन 5 w/सेमी 2 से पहले 10x उद्देश्य लेंस ध्यान केंद्रित कर रहा है और ३०० W/cm 2 के बाद 10x उद्देश्य लेंस ध्यान केंद्रित करने का अनुमान है । रूपांतरण एक प्रक्रिया है कि एक उच्च फोटॉन घनत्व की आवश्यकता है, खासकर जब एक बड़ा विरोधी झोंकने बदलाव की जरूरत है । इसलिए, ध्यान केंद्रित photoactivation.
    3. के दौरान की जरूरत है
  3. जब एक बड़ा प्रकाश स्पॉट (६५० & #181; एम एक्स ५२० & #181; एम) की जरूरत है, विकीर्ण NIR के साथ इन कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए एक संधानक के साथ एक 10x उद्देश्य लेंस द्वारा ध्यान केंद्रित के लिए अनुमति देते हैं । हीटिंग से बचने के लिए हर 5-मिनट के विकिरण के बाद 5 मिनट डार्क अंतराल के लिए नोट: जब एक उच्च स्थानिक-संकल्प (सेलुलर लाइट स्पॉट) की जरूरत है, एक उपसेलुलर आयाम प्रकाश स्थान उत्पंन करने के लिए प्रकाश गाइड के निकास अंत में स्थापित एक pinhole के साथ 40X उद्देश्य लेंस का उपयोग करें (5 & #181; m x 4 & #181; मी). इस मामले में, विकिरण के 1 एस फोटॉनों के उच्च प्रवाह के कारण NIR photoactivation के लिए पर्याप्त है.
  4. के बाद यूवी या NIR photolysis, कोशिकाओं को एक 5% में ठीक करने के लिए अनुमति दें सह 2 मशीनी पर ३७ & #176; सी के लिए 1 एच के लिए पूर्ण माध्यम में सेलुलर प्रतिक्रियाएं उत्पंन । बाद में, उंहें 4% paraformaldehyde/फास्फेट-बफर खारा (पंजाब) 20 मिनट के लिए आगे धुंधला से पहले के 1 मिलीलीटर में ठीक ।
    चेतावनी: Paraformaldehyde अत्यधिक विषाक्त है; त्वचा, आंखों, या श्लेष्मा झिल्ली के साथ संपर्क से बचें । मापने और तैयारी के दौरान पाउडर सांस लेने से बचें ।
< p class = "jove_title" > 8. तनाव फाइबर विघटन के दृश्य के कारण NIR Photoactivation

  1. निर्धारण के बाद, का प्रयोग करें Alexa ५९४-phalloidin (add 5 & #181; l के ६.६ & #181; M शेयर हल करने के लिए २०० & #181; l दाग लगाने के लिए पंजाबियों के; कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए मशीन) दाग और तनाव फाइबर कल्पना । एक फिल्टर सेट का उपयोग Alexa ५९४-phalloidin (पूर्व ५८१ एनएम/Em ६०९ एनएम) की छवियों कल्पना ।
  2. 4 & #39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को मशीन । दाग के बाद, पंजाब के साथ नमूनों धोने और अलग से तनाव फाइबर और नाभिक के फ्लोरोसेंट छवियों ले लो ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

पिंजरा एंजाइम-UCNP का निर्माण का डिजाइन चित्रा 1में सचित्र है । PKA एंजाइम पहले 2 के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की थी-nitrobenzyl ब्रोमाइड एक निष्क्रिय बंदी PKA उत्पंन करने के लिए, और यह तो electrostatically की सतह पर स्थिर मैटीरियल था । UCNPs उत्सर्जित प्रकाश और फलस्वरूप photolytically Cys १९९ और Cys ३४३ पर ओ-nitrobenzyl समूहों सट, पैदा सक्रिय PKA । उनि छवियों और ब्रैडफोर्ड परख की पुष्टि की है कि PKA और बंदी PKA UCNPs की सतह पर स्थिर थे, और कळेनासे की गतिविधि के बाद PKA-UCNP समाधान यूवी photoactivation के बाद परख की गई थी (चित्रा 4) । PKA स्थिरीकरण के बाद, एक गतिशील प्रकाश तितर बितर साधन के आकार और PKA के जीटा क्षमता-कण परिसर से पता चला १२० एनएम और-१६.० एमवी, क्रमशः । PKA-UCNP सॉल्यूशन की ब्रैडफोर्ड परख ने कणों पर एक मजबूत बैंगनी रंग दिखाया, जो एक उच्च स्तर और स्थिर प्रोटीन के जमावड़े का पता चलता है ।

सेलुलर प्रयोग में photoactivation के अध्ययन के लिए REF52 रैट भ्रूण fibroblast कोशिकाओं का चयन किया गया. इस प्रयोग में, PKA मार्ग को अंतर्जात PKA सक्रियण द्वारा चालू किया जा सकता है (जो कोशिका-पारगंय ८-CPT-शिविर की मशीन द्वारा ट्रिगर होता है) या सक्रिय या उत्प्रेरित microinjection के PKA में होता है. सक्रिय PKA (के साथ या बिना कण स्थिरीकरण) तनाव तंतुओं को विखंडित करता है और अधिक रेशा actin (f-actin) सतह और इसलिए fluorophore-लेबल phalloidin है, जो दृढ़ता से एफ-actin को बांधता है, एक उच्च धुंधला संकेत उपज । 8 के बाद CPT-शिविर या मुक्त PKA के microinjection, सक्रिय PKA-UCNP, या यूवी सक्रिय PKA-UCNP (सकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों के रूप में), हम मजबूत तनाव फाइबर विघटन की उपस्थिति की पुष्टि की वजह से PKA मार्ग सक्रियण (चित्रा 5). दोनों अंतर्जात PKA और microinjected PKA अध्ययनों से पता चलता है पूरे सेल तनाव फाइबर विघटन, जबकि कण-मैटीरियल PKA (सक्रिय PKA-UCNP और यूवी सक्रिय PKA-UCNP) केवल microinjection साइट पर तनाव फाइबर विघटन को प्रदर्शित करता है, आगे UCNPs पर PKA के स्थिर जमावड़े का सुझाव. NIR photoactivation प्रयोग के लिए, पिंजरा PKA-UCNP और NIR विकिरण के microinjection के बाद, UCNPs कन्वर्ट लाइट उत्सर्जन और nitrobenzyl १९९ और Cys ३४३ पर ओ-Cys समूहों सट. नतीजतन, वे सक्रिय PKA उत्पन्न, एकीकृत तनाव तंतुओं, और fluorophore द्वारा एक उच्च संकेत उपज-लेबल phalloidin धुंधला (चित्रा 6). REF52 कोशिकाओं पर नकारात्मक नियंत्रण प्रयोग UCNP के साथ microinjected बिना बंदी PKA और फिर NIR-विकिरणित, साथ ही साथ REF52 कोशिकाओं के साथ ही, विकिरण के अभाव में बंदी PKA-UCNP के साथ, तनाव फाइबर अखंडता पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया.

Figure 1
चित्र 1 . PKA का चित्रण-UCNP डिजाइन और रूपांतरण-असिस्टेड PKA Uncaging । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: प्रकाश पथ योजना को दिखाते हुए एक Cutaway आरेख । (क) रूपांतरण luminescence और NIR photolysis मोड (बाएँ) के लिए और epifluorescence और यूवी photolysis मोड (दाएँ) के लिए, साथ ही साथ उनके प्रायोगिक सेटअप के लिए संशोधित spectrofluorometer और (ख) माइक्रोस्कोप. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: Microinjection के लिए प्रायोगिक सेटअप. इंजेक्शन धारक 30 डिग्री और ४५ डिग्री के बीच एक कोण पर एक अक्ष तेल हाइड्रोलिक micromanipulator के साथ युग्मित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: UCNP पर PKA स्थिरीकरण की पुष्टि । उनि images of (a) सिलिका-लेपित UCNP and (b) पिंजरा PKA-मैटीरियल UCNP; (ग) HEPES बफर की ब्रैडफोर्ड परख, (घ) पिंजरा PKA के गोली अंश निलंबन-UCNP समाधान, और (ई) supernatant अंश के पिंजरा PKA-UCNP समाधान; और (च) कळेनासे की गतिविधि परख के बाद PKA-UCNP समाधान के बाद यूवी photoactivation. यह आंकड़ा गाओ, एच.-डी. से reproduced किया गया है । एट अल. के बाद स्पष्ट अनुमति प्रकाशक, अमेरिकन केमिकल सोसायटी से प्राप्त किया गया था । स्केल बार = 20 एनएम कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : तनाव फाइबर धुंधला (हरा) प्रतिदीप्ति छवियों और DAPI REF52 कोशिकाओं के नाभिक (नीला) के दाग, तनाव फाइबर विघटन और रूपात्मक परिवर्तन अलग PKA सक्रियण द्वारा ट्रिगर दिखा । (क) अनुपचारित कोशिकाएँ, (ख) ८-(४-Chlorophenylthio) adenosine ३ ', 5 '-चक्रीय मोनोफोस्फेट (8-CPT-cAMP)-स्वास्थ्यकर्मी कोशिकाओं, (ग) सक्रिय PKA-microinjected कोशिकाओं, (घ) सक्रिय PKA-UCNP-microinjected कोशिकाओं, और ( ङ) पिंजरा PKA-UCNP-microinjected कोशिकाओं यूवी विकिरण के बाद । (f-j) ऑप्टिकल घनत्व (आयुध) चित्र (a-e), क्रमशः से व्युत्पंन । (k-o) इसी तीव्रता नीले तीर के साथ घटता है । सफ़ेद तीर microinjected कक्ष को इंगित करता है । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: प्रतिदीप्ति विभिन्न PKA रूपों के साथ Microinjected REF52 कोशिकाओं की छवियाँ. कोशिकाओं के साथ microinjected (एक) बंदी PKA-UCNP के बाद NIR विकिरण, (ख) खूंटी-UCNP विकिरण के तहत भ्रष्टाचारी NIR, और (ग) बिना विकिरण के PKA-UCNP । (d-f) (a-c) के लिए UCNP (डैश्ड बॉक्स में) के रूपांतरित उत्सर्जन । (g-i) तनाव तंतुओं की मर्ज की गई छवियां (हरा), UCNP परिसर के रूपांतरण उत्सर्जन (लाल), और नाभिक के DAPI धुंधला (नीला) । कोशिकाओं के NIR photoactivation ६५० µm एक्स के एक प्रबुद्ध क्षेत्र में आयोजित किया गया५२० µm एक 10x उद्देश्य लेंस का उपयोग कर । प्रतिदीप्ति छवियों एक 40X उद्देश्य लेंस का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे । इसलिए, NIR विकिरण क्षेत्र १५० µm x १२० µm के लिए कम हो गया था, के रूप में धराशायी लाल बॉक्स में संकेत दिया । (c) में कनवर्ज़न luminescence को देखा जा सकता है । ImageJ का उपयोग करके ठहराव अध्ययनों के लिए, आयुध चित्र (j-l) क्रमश: (a-c) से प्राप्त किए गए थे । (जे एल) में दिखाए गए नीले तीर के साथ तीव्रता घटता (एम-ओ) में रची गई थी । इस सिस्टम के लिए उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात (S/N) को देखा गया था और इसे सकारात्मक प्रतिक्रिया माना जाता है । इस दृष्टिकोण सभी Alexa ५९४ के लिए लागू किया गया था-phalloidin धुंधला quantifications । सफ़ेद तीर microinjected कक्ष को इंगित करता है । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पहले, Hofmann और सहकर्मियों पाया कि नाटकीय रूपात्मक परिवर्तन REF52 कोशिकाओं में मनाया गया मुक्त PKA के microinjection के बाद19। एक अंय अध्ययन में, लॉरेंस समूह का प्रदर्शन किया है कि बंदी PKA vivo मेंसक्रिय हो सकते हैं, रूपात्मक परिवर्तन और तनाव फाइबर के विघटन के लिए अग्रणी जब यूवी photolysis20के अधीन । photoactivation के लिए reconverted यूवी प्रकाश शोषण पर पहले रिपोर्टों के कई UCNP-असिस्टेड, बंदी, लघु आणविक अप्रभावी21,22,23के सक्रियण दिखाया । हालांकि, एक प्रोटोकॉल UCNP का उपयोग करने के लिए photoactivation के सबसे महत्वपूर्ण वर्ग पर सहायता प्रदान की, एंजाइम, अभी भी विकसित किए जाने की जरूरत है । इसलिए, इस अध्ययन में, हम एक सेलुलर प्रयोग प्रोटोकॉल है कि UCNPs का उपयोग कर PKA के NIR photoactivation शामिल है का वर्णन । इस NIR photoactivation मंच में, PKA सिलिका लेपित UCNPs की सतह पर पिंजरे में20 मैटीरियल एक ट्रिगर के रूप में transduction का उपयोग कर कोशिका के संकेत NIR मार्ग को नियंत्रित करने की व्यवहार्यता प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । REF52 कोशिकाओं के साथ microinjected एक पिंजरा PKA-UCNP का निर्माण और विकिरणित के साथ तनाव फाइबर विघटन, साथ ही कोशिकाओं के भीतर NIR परिवर्तन पर एक प्रभाव दिखाई दिया । इसके अलावा, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों प्रदर्शन किया और साबित कर दिया कि PKA प्रेरित मार्ग तनाव तंतुओं के विघटन के लिए अग्रणी NIR विकिरण से शुरू हो रहा है ।

साधन संशोधन इस पांडुलिपि में वर्णित है, जबकि PKA रासायनिक संशोधन में अच्छी तरह से प्रलेखित है15कहीं । यदि एक अच्छी तरह से डिजाइन प्रयोग समस्या निवारण की आवश्यकता है, पहले की पहचान कि क्या समस्याओं से उत्पंन होते हैं: (i) प्रोटीन-UCNP परिसर, (ii) microinjection, या (iii) ऑप्टिकल इंस्ट्रूमेंटेशन । प्रोटीन photoactivation समस्याओं के मामले में: (1) सुनिश्चित करें कि PKA सक्रिय है, (2) की पुष्टि करें कि बंदी PKA अवशिष्ट गतिविधि है कि & #60 है; अपने मूल मूल्य के 5%, (3) का पता लगाना है कि यूवी unPKAed अपनी गतिविधि बहाल की ५०% से कम है, (4) सुनिश्चित करें कि बंदी PKA UCNP सतह पर मैटीरियल है (एक ब्रैडफोर्ड परख प्रदर्शन), और (5) यह सुनिश्चित करना है कि बंदी PKA-UCNP भी अपनी गतिविधि बहाल (यूवी विकिरण प्रदर्शन) के कम से ५०% है । microinjection समस्याओं के लिए: (1) सुनिश्चित करें कि सुई टिप खुला है और प्रोटीन-UCNP समाधान ठीक से भरी हुई है । एक NIR उत्तेजना चैनल के साथ एक खुर्दबीन पर भरी हुई सुई (टिप) रखें. यदि रूपांतरण प्रतिदीप्ति मनाया जाता है, लोडिंग सही है । (2) प्रोटीन-UCNP को कोशिकाओं में इंजेक्ट करें और प्रतिदीप्ति तीव्रता के सह-इंजेक्टेड 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (तमृ) डाई, और कन्वर्जन पार्टिकल का निरीक्षण करें । उचित इंजेक्शन तीव्र तमृ और कोशिकाओं में रूपांतरण कण प्रतिदीप्ति में परिणाम होगा । माइक्रोस्कोप ऑप्टिकल संशोधन समस्या निवारण के लिए: (1) उद्देश्य लेंस को हटाने, NIR लेजर पर बारी, और NIR, जो एक अनुचित सेटिंग द्वारा अवरुद्ध नहीं किया जाना चाहिए मापने के लिए माइक्रोस्कोप मंच पर थर्मल ढेर बिजली मीटर संवेदक डाल दिया । (2) उद्देश्य लेंस स्थापित करने और माइक्रोस्कोप मंच पर 10 मिलीग्राम/एमएल UCNP समाधान से भरा एक पारदर्शी-नीचे cuvette डाल दिया । समाधान में एक तेज नीली बीम अगर प्रकाशिकी सब ठीक से स्थापित कर रहे है देखा जाएगा ।

Microinjection केवल विश्लेषण के लिए सीमित संख्या में कक्ष प्रदान कर सकता है । इंजेक्शन सफलता दर ऑपरेटर (या अनुभव)-निर्भर है, जो इस तकनीक की एक प्रमुख सीमा है । हालांकि, अब तक इसे बायपास करने के अलावा और कोई रास्ता नहीं है । कई वैज्ञानिकों का सुझाव है कि कण कोशिका की गर्मी का उपयोग कोशिकाओं कणों को ऊपर उठाने के लिए अनुमति देता है । हालांकि, यह एक व्यवहार्य दृष्टिकोण नहीं है । यहां तक कि अगर सेलुलर कण और अधिक होती है और ऊपर की राशि पर्याप्त है, यह endosomes/lysosomes में जमा होगा, लेकिन cytosol में नहीं । इस विशिष्ट संकेत transduction एंजाइम cytosol में स्थित होने की जरूरत है, नहीं endosomes, प्रभावी होने के लिए. इसके अलावा, जब PKA ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक परिपूर्ण भंडारण बफर में भंग कर रहा है, अपनी गतिविधि रातोंरात भंडारण के बाद पिछले नहीं है । कोशिका संस्कृति के माध्यम में एंजाइम स्थिरता भी कम है, और यह गर्मी दृष्टिकोण अव्यावहारिक बनाता है ।

इस वाद्य सेटअप, microinjection, और कळेनासे NIR photoactivation प्रोटोकॉल की रिपोर्ट आम तौर पर लागू किया जाना चाहिए, न केवल रासायनिक संशोधित कळेनासे के लिए, लेकिन यह भी अन्य प्रोटीन या एंजाइम वर्गों के लिए. इसके अलावा, यह सेलुलर अध्ययन जहां प्रत्यक्ष यूवी जोखिम अवांछनीय है में उपयोगी होगा । इसके अलावा, पिंजरा अप्रभावी-UCNP परिसर extracellular लक्ष्य के साथ बातचीत कर सकते हैं, जैसे झिल्ली प्रोटीन या झिल्ली रिसेप्टर्स, intracellular वितरण समस्या से बचने और vivo में उपयोग करने के लिए लागू मंच बनाने. I.V. इंजेक्शन के बाद, पिंजरा प्रोटीन हार्मोन या चिकित्सीय प्रोटीन केवल NIR-विकिरणित क्षेत्रों में अप्रभावी के सक्रिय रूप होगा ।

Microinjection इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम है । सटीक इंजेक्शन के लिए, सुई लदान के दौरान बुलबुले से बचें । लोड होने के बाद, तुरंत इंजेक्टर में सुई स्थापित करने और कॉलेस्ट्रॉल कारण होगा जो सुखाने से सुई टिप को रोकने के लिए मध्यम में सुई टिप विसर्जित कर दिया । Microinjection ऑपरेटर कौशल एक उच्च सफल इंजेक्शन दर के लिए महत्वपूर्ण है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम शिक्षा Sinica के नैनो विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम और वित्त पोषण के लिए ताइवान के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (101-2113-m-001-001-MY2; 103-2113-एम-001-028-MY2) का धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma 154563
Magnesium chloride hexahydrate Sigma M9272
MOPS Sigma M1254
HEPES Sigma H4034
Sodium chloride  Sigma 31434
Potassium chloride Sigma 12636
Yttrium acetate hydrate Sigma 326046 Y(C2H3CO2)3 · xH2O
Thulium(III) acetate hydrate Alfa Aesar 14582 Tm(CH3CO2)3 · xH2O
Ytterbium(III) acetate tetrahydrate Sigma 326011 Yb(C2H3O2)3 · 4H2O
1-Octadecene Sigma O806
Oleic acid Sigma 364525
Methanol  macron 304168
Sodium hydroxide Sigma 30620
Ammonium fluoride J.T.Baker 69804
IGEPAL CO-520 Sigma 238643
Cyclohexane J.T.Baker 920601
Ammonium hydroxide (28% - 30%) J.T.Baker 972101 Ammonia
Tetraethyl orthosilicate (TEOS) Sigma 8658
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
N-hydroxymaleimide (NHM) Sigma 226351 PKA activity blocking reagent
Prionex protein stabilizer solution from hog collagen Sigma 81662 Protein stabilizer solution
2-nitrobenzyl bromide (NBB) Sigma 107794 PKA caging reagent
8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt Sigma C3912 8-CPT-cAMP
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma P0294 PK/LDH
Adenosine 5'-triphosphate disodium Sigma A2387 ATP
β-NADH reduced from dipotassium Sigma N4505
Phosphoenolpyruvate Sigma P7127 PEP
Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL Thermo Scientific 23200 Bradford assay reagent
cAMP-dependent protein kinase Promega V5161 PKA activity control
pET15b-PKACAT plasmid Addgene #14921
pKaede-MC1 plasmid CoralHue AM-V0012
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo Scientific 10010023
DMEM, high glucose, pyruvate Gibco 12800-017 Cell culture medium
Leibovitz L-15 Medium Biological Industries 01-115-1A Cell culture medium
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1A
Paraformaldehyde ACROS 416785000
DAPI Invitrogen D1306 Nucleus staining dye
Alexa 594-phalloidin Invitrogen A12381 F-actin staining dye
5(6)-Carboxytetramethylrhodamine  Novabiochem 8.51030.9999
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Scientific 23200
CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da Membrane Filtration Products, Inc. 1430-33 Dialysis membrane
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized EMD Milipore SLHVX13NL
Equipment
Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS Malvern M104
Transmission Electron Microscope JEOL JEM-1400
Fluorescence Spectrophotometer Agilent Technologies 10075200 Cary Eclipse 
UV-Vis Spectrophotometer Agilent Technologies 10068900 Cary 50 
Fluorescence Microscope Olympus IX-71
950 nm longpass filter  Thorlabs FEL0950
850 nm dichroic mirror shortpass Chroma NC265609
RT3 color CCD system SPOT RT2520
Fluorescence Illumination PRIOR Lumen 200
980 nm Infra-red diode laser CNI MDL-N-980-8W
UV LED Spot Light Source UVATA UVATA-UPS412 With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2
Thermal pile sensor OPHIR 12A-V1-ROHS
Picospritzer III Parker Hannifin 052-0500-900 Intracellular Microinjection Dispense Systems
PC-10 Needle puller Narishige PC-10
MANOMETER Digital pressure gauge Lutron PM-9100
One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator Narishige MMO-220A
Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated Thermo Scientific 75002421

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
  2. Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
  3. Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
  4. Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
  5. Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
  6. Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
  7. Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
  8. Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
  9. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
  10. Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
  11. Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
  12. Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
  13. Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
  14. Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
  15. Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
  16. Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
  17. Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
  18. Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
  19. Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
  20. Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
  21. Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
  22. Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
  23. Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).

Tags

अभियांत्रिकी अंक १२६ पिंजरा एंजाइम सेलुलर प्रतिक्रिया microinjection photolysis प्रोटीन कळेनासे ए रूपांतरण नैनोकणों photoactivation
एक एकीकृत प्रणाली को दूर करने के लिए Intracellular संकेत Transduction द्वारा ट्रिगर Nanoparticle-मध्यस्थता कळेनासे Photoactivation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, H. D., Thanasekaran, P., Chen,… More

Gao, H. D., Thanasekaran, P., Chen, T. H., Chang, Y. H., Chen, Y. J., Lee, H. M. An Integrated System to Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction by Upconversion Nanoparticle-mediated Kinase Photoactivation. J. Vis. Exp. (126), e55769, doi:10.3791/55769 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter