Summary
このプロトコルではケージ プロテインキナーゼ A (PKA)、細胞信号伝達 bioeffector ナノ粒子表面に固定化した細胞質に microinjected、アップ コンバートされる紫外線近赤外線 (NIR) 照射からによって活性化を誘導します。細胞質の下流圧力繊維崩壊。
Abstract
アップコン バージョン ナノ粒子 (UCNP)-仲介された光はリモート コントロール bioeffectors はるかに少ない光毒性とより深いティッシュの浸透への新しいアプローチ。ただし、市場で既存のインストルメンテーションは容易にアップコン バージョンのアプリケーションとの互換性ではありません。したがって、市販の計測器を変更することは本研究のために不可欠です。この稿では、まず従来の蛍光の蛍光顕微鏡光子アップコン バージョン実験の互換性のために変更を示します。その後、近赤外線 (NIR) の合成について述べる-トリガー ケージ蛋白質キナーゼの触媒サブユニット (PKA) UCNP 複合体に固定化しました。マイクロインジェクションおよび近赤外光プロシージャのパラメーターも報告されています。ケージの PKA UCNP REF52 線維芽細胞に microinjected が、した後従来の UV 照射によりかなり優秀で、近赤外照射は効率的に細胞 PKA シグナル伝達経路をトリガーします。さらに、正と負の制御実験は、ストレスファイバーの崩壊につながる PKA 誘導経路が特に近赤外照射によってトリガーされることを確認します。したがって、蛋白質変更 UCNP の使用は、リモート光変調細胞実験、紫外線への直接露出を回避する必要がありますを制御する革新的なアプローチを提供します。
Introduction
センサー (PKA ケージ蛋白質など) をすることができます化学修飾されたタンパク質は細胞の生化学的なプロセス1,2 を非侵襲的操作する化学生物学の新たな分野として開発されています。、3。タンパク質をケージ使用光刺激はこれらの活性化と優れた時空間解像度を提供します。ただし、紫外線は、望ましくない形態学的変化、アポトーシスおよび細胞4,5への DNA 損傷を引き起こす可能性が。それ故に、photocaging グループの設計の最近の動向は、深部組織浸透6,7を増大させるため、同様の光毒性を軽減する長波長または 2 光子励起による電子スピンダイナミクスの有効化に焦点を当てます。私たちは適切な uncaging 神経波長 (すなわちチャンネル) を選択できるようにする選択的に波長が長く対応ケージのグループは bioeffectors 2 つをアクティブにしますより多くのケージ グループは、現在7。これらの便利な機能を与え、細胞活動8を制御するための反応のメカニズムを調査に至る生物学研究光化学的方法論で非常に重要な上流作業は、赤色光 photocaging の新しいグループを開発します。しかし、2 光子ケージ グループは縮合芳香環構造のためあまりにも疎水性通常、可視光ケージ グループは通常有機金属、芳香族配位子を。この疎水性/芳香族プロパティは適していません、bioeffector は蛋白質や酵素、酵素/タンパク質の活性化サイトを変化し、たとえ抱合と光分解はまだ2 の化学のレベルで動作、機能の損失が発生するとき ,9。
UCNPs は、近赤外励起光を UV に変換効果的なトランスデューサーです。UCNPs のこのユニークで魅力的なプロパティは、課題に対応する現実的な解像度 photoactivation に関連付けられているし、小分子、葉酸10シスプラチン誘導体11 の制御放出をトリガーに提供しています。、DNA/siRNA12、共重合体膜小胞13、および中空粒子14。ただし、我々 の知識の限り、酵素やタンパク質の UCNP シスト photoactivation 未テストところ。シリカ コーティングと化学修飾されたケージの酵素複合体から成るタンパク質/酵素コンストラクトの NIR トリガー活性化を実行する求められる私達を使って赤い光や近赤外光活性酵素の成功例がないので希土類をドープした UCNP の15。本研究では、UCNP は、ケージの PKA の形で急速に反応シグナル伝達キナーゼと共役だった。PKA は、グリコーゲン合成と細胞質16環状アデノシン リン酸 (キャンプ) 調節することによる外部からの刺激に応答する細胞骨格の調節をコントロールします。近赤外照射後の細胞実験で時空のマナーで酵素活性化の可能性を検討した.この光の UCNP 支援プラットフォーム NIR を使用して酵素 photoactivate する新しい方法であるし、従来 UV 照射2,4による細胞から不要な信号伝達応答を回避できます。
若し大 bioeffectors に非常に困難だ(例えば、蛋白質) 細胞の活動を制御する細胞膜を挟んだ。粒子を固定化したタンパク質は細胞質にエンドサイトーシスを介して若しやすくもありますが、エンドサイトーシスを破損やエンドソームわなに掛ける事とそれに伴うライソゾームの分解2,4を介して低下可能性があります。ケージのタンパク質が膜後まだ機能している場合でも転量が細胞応答2,17をトリガーするため十分ではないです。対照的に、マイクロインジェクションは細胞の細胞質に大規模な bioeffectors を提供する直接および定量的アプローチです。また、UCNP 固定化 bioeffector は、アクティブにするアップ コンバートされる光を必要とします。したがって、光学機器用はさらに変更を計測、可視化、およびアップコン バージョン光を利用する必要があります。この作品は、近赤外光用マイクロインジェクションと次の必須の分光法と顕微鏡の変更を使用してセルにケージ PKA UCNP 複合体の配信詳細に表示されます。
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Protocol
注: プロトコル記述 photoactivation のアップコン バージョン アシストの詳細な計測修正、合成手順を生成するケージ PKA UCNP、シリカ被覆 UCNP の透過型電子顕微鏡 (TEM)やケージの PKA UCNP サンプル、UV ・近赤外の光分解セットアップ、セル準備、PKA UCNP マイクロインジェクション、photoactivation 研究、REF52 細胞のストレスの繊維染色します
。1 蛍光アップコン バージョン スペクトル測定装置の
- レーザーは、キュベットの中に焦点を当てて、蛍光分光計のキュベット ホルダーの横に 4 X 対物レンズをインストールします。 。
- 対物レンズに対して 90 ° 0.5-8 W 980 nm レーザ ダイオードを配置します
。 注意: オペレーターは、レーザー安全知識を持ち、近赤外レーザーのゴーグルを着用する必要があります 。
- は、対物レンズとレーザーの光路交差点で完全反射ミラーをインストールします。分光法の励起ウィンドウをブロックし、内部パーツを保護するために黒アルマイト メタル プレートを配置します 。
- キュベット ホルダーにシリカ被覆 UCNP 溶液 (0.2 - 0.6 mg/mL) のキュベットを置いて、明るいアップコン バージョン ビーム可視化することができます、ミラー インストールに対して最高の光の調整に使用することができます 。
- は、分光学を PMT 電圧設定で最低発光モードに切り替える (信号が弱すぎる場合より高い設定を調整)。最高の配置、ここでビームはキュベットの中に、最も強力な信号を拾って、PMT にミラーを調整します 。
- は後、所望の電力設定でアップコン バージョン スペクトルを測定します。熱杭のパワーメータを使用して、レーザ電源の電気の現在の読みに対するレーザー力の検量線を構築します。パフォーマンスが校正の範囲内にあるかどうかを確認するレーザーの性能を常に確認します 。
2。顕微鏡のセットアップ
注: 次のセットアップは、2 層光パス搭載顕微鏡。ユーザーが近赤外レーザー、ハロゲン ランプは同じポートを共有する背面ポートの励起光源スイッチをインストールしようとすると場合、は、サンプルの発熱を低減するためのものですので、背面のポートにコリメータは大幅 NIR がブロックされます。ユーザーは、難しい選択を行う必要があります: コリメータをおいて、アップコン バージョンの非常に低い効率に苦しむ、コリメータを削除や励起、落射蛍光の光の強度を犠牲します
。注: 変更された蛍光、アップコン バージョン発光と近赤外光分解モードおよび実験装置と UV 光分解モード、落射蛍光顕微鏡の光路方式を示す断面図の図この実験に使われて 図 2 に示します
。 背面に監督- 装備金属のハロゲン化物ライトと蛍光顕微鏡ガイド ポート
注: この上位層の光パスの 1 つのキューブの位置は低階層光パスから来る NIR ように空でなければなりませんキューブ砲塔がある - は、オープン側ポートのコリメータで、右側のポートに可変 0.5 から 8.0 W 980 nm のレーザー ダイオードをインストールします
。 注: これは 10 倍の対物レンズを使用するレーザー光スポット約 500 μ m の直径を拡大します。このコリメータを取り外し、マイクロ メートルの範囲のスポット ライトの結果し、NIR 細胞照射ができなくなります。このコリメータは近赤外透過的です 。
- ダイクロイック ミラー (850 nm ショートパス) と低層の光パスの励起フィルター (950 nm 長いパス) をインストール
- では、UCNP ソリューションを使用して、近赤外光スポットを視覚化します。配置を完了するためのビューのフィールドで近赤外光ビームの中央にレーザーの位置を調整します 。
3。調製とキャラクタリゼーションのケージ PKA UCNP 構築
- 加温組換え PKA (9 μ M) ケージング バッファー (20 mM トリス塩酸、10 mM と 100 mM の NaCl、MgCl 2; pH 8.5) 25 で 1-2 時間で 0.5 mM 2-nitrobenzylbromide (NBB) と ° c. 焼入10 mM dthiothreitol (DTT) と過剰な NBB、4-(2-ヒドロキシエチル) dialyze、ピペラジン-1-ethanesulfonic 酸 (HEPES) バッファー (10 mM, pH 7.5) 余分な試薬と塩を削除する
。 注: ケージの溶液の pH が下がる 8.5 7.5 HEPES pH 7.5 以降の固定化反応のための透析中です 。
- ミックス、ランタノイド塩 Y(CH3CO2) 3 水和物 (99.9%、0.4527 g、1.38 ミリ モル)、Yb (CH 3 CO 2) 3 水和物 (99.9%、0.2533 g、0.60 モル)、および Tm (CH 3 CO 2) 3メタンハイド レート (99.9%、0.02 モル 0.0168 g)-octadecene (30 mL)、オレイン酸 (12 mL)、115 ° C、30 分の混合物を熱し、50 ° C にそれらを冷却次に、NaOH ペレット 0.2 g (5.0 m モル) とメタノール溶液 (20 mL) で反応混合物を溶解し、0.2964 g (8 モル) で 15 分間超音波処理によるフッ化アンモニウムの増加反応温度は 300 ° C まで (β NaYF 4 UCNP コアを取得するには: 1.0 %tm 3 +/30 %yb 3 +) ナノ粒子。
- は、シクロヘキサン (10 mL) 中の CO-520 (0.5 mL) のコア粒子 (25 mg) を溶解します。アンモニア (重量 30 %v/v、0.08 mL) とオルトケイ酸エチル (TEOS、0.04 mL) を追加し、シリカ被覆 β NaYF 4 を得るため室温で 12 時間一定の攪拌の適用: 1.0%Tm 3 +/30%Yb 3 + コア粒子 。
- PKA を孵化させなさい (6 nmol) または PKA をケージ (6 nmol) HEPES 緩衝液 (pH 7.5、10 mM) 静電相互作用 経由 での UCNP のシリカ被覆の PKA を固定する 3 h の 4 ° c で UCNP (1 mg) 15 と 。
- は、PVDF フィルター (0.45 μ m)、17,000 x g で 4 ° C で 10 分間遠心を使用して混合物をフィルター処理し、精製の PKA UCNP 複合体を取得する HEPES (pH 7.5、10 mM、50 μ L) 含む 0.1% 蛋白質安定剤でペレットを redisperse します。4 ° C で 10 分間 17,000 × g で遠心し、1.5 mL チューブのブラッドフォードの試金の上澄みを集めします 。
- 分析バック計算 UCNP 粒子の PKA 置換レベルに清のブラッドフォードの試金のステップ 3.5 から保存無制限の PKA の置換レベルが通常ある 〜 粒子の mg 当たり PKA の 4.5 nmol
。 注: ブラッドフォードの試金を明らかに脱着することがなく高いレベルで安定したタンパク質固定化を示唆しているペレットに強く青い色、PKA UCNP ソリューションは HEPES バッファー (に似た色を表示の上清分画ケージ中 図 4c 4e).
4。特性
注: キナーゼ試金はピルビン酸キナーゼの特定の活動を定量化するために使用します。簡単に言えば、ピルビン酸キナーゼ、乳酸脱水素酵素に結合は、ペプチドのリン酸化は、NADH の酸化の結果します。340 NADH の吸光度の減少を測定することにより後者の形成を監視 nm
。- 60 μ L 総量がアッセイ混合 4 morpholinepropanesulfonic 酸 (モップ、100 ミリメートル、pH 7.5) の PKA と PKA UCNP の活動を決定する KCl (100 mM)、(PEP、1 mM) はホスホエノールピルビン酸、アデノシン三リン酸 (ATP、1 mM)、β-ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド形態 (NADH, 0.8 mM)、塩化マグネシウム (MgCl 2、1 mM)、kemptide (0.4 mM)、およびピルビン酸キナーゼ/乳酸脱水素酵素混合物 (PK/LDH の 30/40 単位) を削減します 。
- は、アッセイ混合物に PKA ソリューション (2 μ L) の付加の後で時間をかけて NADH の吸光度の減少を測定します。直接測定対象キナーゼの活性を反映するように直線の傾きを計算します 。
- PKA UCNP 15 の活動と PKA 固有のネイティブ アクティビティおよび計算される PKA 表面被覆量の乗算製品にもマッチする必要があります全体の活性を測定します 。
5。光分解セットアップ
- 測定ure 光のすべての電源熱杭センサーを用いた源そして電力密度を計算する (PD = 電力 (W)/(cm 2)) 光スポット エリアに基づいて 18 。
- 365 nm の LED (200 mW/cm 2) 15 の商業システム の in vitro UV 光分解実験を実行します 。
- 顕微鏡ステージ上の UV 光を照らす商業キューブ 15 によってフィルター処理された励起光による PKA UCNP ソリューションです
。 注意: 電力密度は 〜 15 mW/cm 2、対物レンズ焦点なし 。
- 培養 顕微鏡段階の photoactivation、NIR の照らすダイクロイック ミラー (850 nm 短い-パス)、低階層光パスにインストールされているカスタマイズされたアップコン バージョン フィルター/ミラー設定で 980 nm のレーザーを使用して PKA UCNP ソリューションと励起フィルター (950 nm 長いパス).
注: 出力電力密度は 4 X 対物レンズ焦点を当て前に 5 W/cm 2 です。電力密度と推定される 〜 68 W/cm 2 X 対物レンズ焦点 4 後 。
6。細胞試料調製と PKA UCNP 錯体のマイクロインジェクション
- PKA 固定 (ステップ 3.5) 後、0.45 μ m のフィルターを通してサンプルをプレフィルターします 。
- インキュベート マイクロインジェクション インキュベーター外で安定した pH 制御期間 L-15 媒体を含む 10% 牛胎児血清 (FBS) にセルです
。 注: 顕微注入完了を確認する共同注入ネイティブ PKA UCNP、ケージ PKA-UCNP、またはペグインターフェロン UCNP (7.5 mg/mL) 15 5 6-carboxytetramethylrhodamine (耽羅) (10 μ M) のセルに 。
- は PKA UCNP 粒子の濃度を調整して、マイクロインジェクション後、ゾル性細胞質の濃度は 1-3 μ M PKA - 注入量は細胞容積の 1/10 であるという前提で、セルの PKA の生理的濃度範囲.
- 実行 (ステップ 6.2) 細胞へのマイクロインジェクション一次元油圧マイクロマニピュレーター ( 図 3) と相まってマイクロインジェクター デバイスを使用します 。
- ガラスシリンジによって適用される圧力を監視するデジタル圧力計が動作範囲内での使用 (50 〜 200 hPa) マイクロインジェクションの補正圧力を提供するためにカスタマイズされた加圧チャンバーにディスペンサー バルブのシール。引き手を使用して針を引いています 。
- 50 と 75 hPa、200-300 ms と毛管作用によって針に培養液の逆流を防ぐために 15 hpa 補正圧力の噴射時間の間注入圧力を維持します 。
- 外径 1.3 と 1.5 μ m、40 倍の対物レンズを用いて撮影によって確認することができます間があるように針の先端の開口部を確認します 。
- 10% を含む L-15 培地 2 mL でセルを洗浄して、インジェクション後 FBS。5 (6) - carboxytetramethyl - ローダミン (タムラ) マイクロインジェクション完了の確認をから細胞の蛍光イメージングを観察 。
7。Photoactivation のケージ PKA UCNP を使用して紫外線や生体細胞の近赤外光
PKA UCNP マイクロインジェクション後- UV の photoactivation 3.5 μ m の皿 REF52 細胞を成長、顕微鏡ステージ上に配置、によってフィルター UV 光照射条件対物レンズの焦点なし 3 分キューブ
。 注: セルが 10% を含む DMEM で維持された REF52 37 ° c 5% CO 2 インキュベーターとセルで FBS が継、confluency に 90% に達すると 2-3 日毎 。
- PKA UCNP インジェクション後の近赤外光低層フィルター/ミラーの設定から 980 nm レーザーで細胞を照らすは、ステップ 5.4 で説明したようします
。 注: 出力密度 10 × 対物レンズ焦点を当て前に 5 W/cm 2 は、対物レンズの中心 x 10 後 300 W/cm 2 と推定されています。アップコン バージョンは、大きな anti-Stoke シフトが必要な場合に特に高光子密度を必要とするプロセスです。Photoactivation の間に中心の必要したがって、. - 大きいスポット ライト (650 μ x 520 μ m) が必要な場合は、NIR 毎 5 分照射後 5 分暗い間隔 15 分許可コリメータと 10 倍の対物レンズで焦点を当てて加熱を避けるために、これらの細胞を照射します
。 注: 高の分解能 (細胞内光スポット) が必要な場合使用 40 X 対物レンズとピンホールを導べ光の出口の端に取り付けられている細胞次元光スポット (5 μ x 4 μ m) を生成します。この場合は 1 照射の s は、光子の高フラックスによる近赤外光のために十分 。
- 後紫外線や近赤外の光分解は、細胞応答を生成するための完全な媒体で 1 h の 37 ° C で 5% CO 2 インキュベーターで回復する細胞を許可します。その後、さらに染色する前に 4% パラホルムアルデヒド/リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 20 分の 1 mL でそれらを修正します
。 注意: パラホルムアルデヒドは猛毒です。皮膚、目、粘膜との接触を避けます。測定と準備の中に粉を吸い込まないようにします 。
8。近赤外光活性化によって引き起こされるストレス繊維崩壊の可視化
- 固定後、使用 Alexa 594 ファロイジン (6.6 μ M 原液の 5 μ L 200 μ L の PBS を加える染色; 室温で 25 分間インキュベート) 染色して繊維の応力を視覚化します。フィルタ セットを使用 Alexa 594 ファロイジン (Ex 581 nm/Em 609 nm) のイメージを視覚化します 。
- インキュベート 4 で 5 分間細胞 '、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 室温で。染色後サンプルは PBS を洗浄し、ストレスファイバーと核の蛍光画像を別々 に取ます 。
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Representative Results
ケージ酵素 UCNP の構造の設計は、図 1に示すです。PKA 酵素は、まず、使用頻度の低いケージの PKA を生成する 2-ニトロベンジル ブロマイドと反応したし、UCNP の表面に静電固定だったし。UCNPs は、アップ コンバートの発光し、その結果 photolytically o-ニトロベンジル基 Cys 199 と生成活性化 PKA システイン 343 を切断します。TEM 像とブラッドフォードの試金は、PKA とケージの PKA は UCNPs の表面に固定した、ケージの PKA UCNP ソリューション後 UV 光のキナーゼ活性アッセイ (図 4) を確認しました。PKA 固定後動的光散乱計測器はサイズと 120 に PKA 粒子複合体のゼータ電位を明らかにした nm と-16.0 mV、それぞれ。PKA UCNP ソリューションのブラッドフォードの試金は、高レベルで安定したタンパク質固定化を示唆している、粒子に強力な紫の色を示した。
REF52 ラット胚性線維芽細胞は、細胞実験で光の研究に選ばれました。この実験では PKA 経路オン (細胞膜透過性 8-CPT-キャンプの孵化によって引き起こした) 内因性の PKA 活性化またはアクティブまたはトリガー可能な PKA のマイクロインジェクションにできます。活性化 PKA (粒子固定化の有無にかかわらず) 繊維の応力を崩壊してより繊維状アクチン (アクチン) 表面と F アクチン高い染色信号を降伏と強く結合するため蛍光標識ファロイジンを公開します。8 CPT キャンプ孵化や無料 PKA、アクティブな PKA-UCNP、または紫外線アクティブ PKA UCNP (肯定的な制御実験) としてのマイクロインジェクション後、強い圧力繊維崩壊起因 PKA 経路の活性化 (図 5) の存在を確認しました。さらに内因性の PKA と microinjected の PKA の研究を示す粒子固定化 (アクティブな PKA UCNP と紫外線アクティブ PKA UCNP) の PKA が表示されますストレス繊維崩壊マイクロインジェクションのサイトでしか中の全細胞ストレス繊維崩壊UCNPs の PKA の安定固定化を示唆しています。近赤外光実験、ケージの PKA UCNP と近赤外照射のマイクロインジェクション後 UCNPs アップ コンバートされる光を発するし、システイン 199 とシステイン 343 o ニトロベンジル基を切断します。その結果、活性化 PKA を生成、崩壊、ストレスファイバーと蛍光標識ファロイジン染色 (図 6) でより高い信号を生成します。REF52 細胞の負の制御実験はストレス繊維の整合性に及ぼす影響を示さなかった照射の不在でケージ PKA UCNP と REF52 細胞と同様、UCNP ケージの PKA なしとし、近赤外照射と microinjected。
図 1.ケージ PKA UCNP デザインと PKA のアップコン バージョン支援調査の図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:光パス方式を示す断面図図。自分の実験のセットアップと同様、変更蛍光と (b) 顕微鏡のアップコン バージョン発光と近赤外光分解モード (左) および落射蛍光と UV 光分解モード (右)、(、)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:マイクロインジェクションの実験のセットアップ。インジェクション ホルダーを一次元油圧マイクロマニピュレーター 30 ° と 45 ° の角度で結合されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:UCNP における PKA 固定化の確認。シリカ被覆 (、) の TEM 画像 UCNP や (b) ケージの PKA を固定化した UCNP;(C) HEPES バッファー、ケージの PKA UCNP ソリューションのペレット (d) 画分巻き上げ、ケージ PKA UCNP ソリューションの (e)、上清画分のブラッドフォードの試金UV 光後のケージの PKA UCNP ソリューションのキナーゼ作業の試金を (f)。この図は、Gao は、h. d. から再現されていますら後、明示的なアクセス許可は、出版社は、米国化学会から得られました。スケール バー = 20 nmこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ストレス繊維染色 (緑) の DAPI REF52 細胞の核 (青) の染色、ストレス繊維崩壊と異なる PKA 活性化によって引き起こされる形態学的変化を示す蛍光イメージ。(は) 非導入細胞、(b) 8-(4-Chlorophenylthio) アデノシン 3', 5'-サイクリック一リン酸 (8-CPT-キャンプ)-( 、(d) アクティブな PKA UCNP microinjected セル (c) アクティブな PKA microinjected 細胞細胞を治療e) UV 照射後 PKA UCNP microinjected セルをケージします。(f j)光学濃度 (外径) 写真に由来 (a ~ e)、それぞれ。(k ・ o)青い矢印に沿って対応する強度曲線。白い矢印は、microinjected のセルを示します。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6:REF52 細胞の蛍光画像 Microinjected 様々 な PKA と。セル (、) と microinjected は、近赤外照射下における近赤外照射 (b) ペグをグラフトした UCNP 後 PKA UCNP をケージや (c) 照射なしのケージの PKA UCNP。(d f)(A から c) の (点線のボックス) の UCNP のアップ コンバートされる発光します。(g-i)ストレスファイバー (緑)、アップコン バージョン排出量 (赤)、複雑な UCNP の DAPI 染色核 (青) のイメージをマージします。650 μ m の照明の領域で細胞の近赤外光を行った x520 μ m 10 X 対物レンズを使用します。40 倍の対物レンズを用いた蛍光画像に買収されました。それ故に、破線の赤いボックスで示されているように 150 μ x 120 μ m 近赤外照射面積が減少しました。(C) のアップコン バージョン発光を見ることができます。ImageJ を用いた定量化研究外径写真 (j l) はそれぞれ (a から c) から派生しました。(J l) に示すように青い矢印に沿って強度曲線 (m ・ o) にプロットします。高い信号対雑音比 (S/N) は、このシステムが認められ、肯定的な反応と見なされます。このアプローチは、すべての Alexa 594 ファロイジン染色数量に適用されました。白い矢印は、microinjected のセルを示します。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
以前は、ホフマンと同僚が見つかりました無料 PKA19のマイクロインジェクション後 REF52 細胞における劇的な形態学的変化を認めたこと。別の研究では、ローレンス グループは、ケージ PKA 活性化使用される体内形態学的変化とストレスファイバー UV 光分解20に服従させたときの崩壊につながるを示した。以前のいくつかの UCNP シスト、ケージ、小さな分子 bioeffectors21,22,23活性化を示した photoactivation のためアップ コンバートされる紫外線を利用するについて報告します。ただし、bioeffector、酵素の最も重要なクラスの UCNP シストの photoactivation を使用するプロトコルでは、開発する必要があります。したがって、本研究では UCNPs を使用してケージの PKA の近赤外光を含む細胞実験プロトコルについて述べる。この近赤外光プラットフォームでケージ PKA20 UCNPs のシリカ被覆の表面に固定化がトリガーとして NIR を用いた細胞のシグナル伝達経路を制御することの実現可能性を実証する使用されました。ケージの PKA UCNP と microinjected REF52 の細胞構築し、細胞内ストレス繊維崩壊と形態学的変化に及ぼす影響を示した近赤外照射しました。さらに、正と負の制御実験は実行されストレスファイバーの崩壊につながる PKA 誘導経路が近赤外照射によってトリガーされることを証明しました。
楽器変更が本稿に記載されて、PKA、化学修飾、他の場所によくとり上げられる15。適切に設計された実験では、トラブルシューティングを必要とする場合まず問題から生成されたかどうかを識別する: (i) タンパク質 UCNP 複合体、(ii) マイクロインジェクション、または (iii) 光学機器用。タンパク質の photoactivation の問題がある場合: (1) 確かに PKA がアクティブになっている、(2) ケージの PKA が、残存活性を持っていることを確認 < UV アンケージ PKA が確かにその活動を復元すると、(4) の少なくとも 50% を持っていることをその元の値の 5% (3) 確認ケージの PKA は UCNP 表面に固定化する (ブラッドフォードの試金の実行)、および (5) ケージの PKA UCNP もリストア (紫外線) 活動の少なくとも 50% があることを確認します。マイクロインジェクションの問題: (1) 確かその針の先端が開いているとタンパク質 UCNP ソリューションが正しく読み込まれます。近赤外励起チャンネルで顕微鏡に読み込まれた針 (先端) を配置します。アップコン バージョン蛍光を観察すると、読み込みは正しいです。(2) 細胞にタンパク質 UCNP を注入し、co 注入した 5 6 carboxytetramethylrhodamine (耽羅) 染とアップコン バージョン粒子の蛍光強度を確認します。適切な注入は、セルに強烈な耽羅とアップコン バージョン粒子蛍光になります。顕微鏡光学変更のトラブルシューティング: (1) 削除対物レンズ近赤外レーザーをオンし、しない不適切な設定によってブロックされる必要があります、NIR を測定する顕微鏡ステージ上熱杭パワー メーター センサーを置きます。(2) 対物レンズをインストールし、顕微鏡ステージ上 10 mg/mL UCNP 液でいっぱい透明底キュベットを置きます。光学系すべてに正しくインストールがされている場合は、ソリューションのシャープな青いビームが見られます。
マイクロインジェクションのみ分析のため細胞の限られた数を提供できます。注入成功率はオペレーター (または経験)-この技術の主要な制限である依存。しかし、今のところ回避する他の方法はありません。多くの科学者は、粒子細胞培養の使用により粒子、吸収する細胞ことをお勧めします。ただし、これは実現可能な方法ではありません。たとえ細胞粒子の吸収が発生して吸収量十分であるが、エンドソーム/リソソーム, ではなく、細胞質に蓄積されます。この特定のシグナル伝達酵素はないエンドソーム、効果を発揮する細胞質内に存在する必要があります。さらに、PKA が 37 ° C で完璧なストレージ バッファーに解散したときは、スキーお預かり後の活動は更新されません。細胞培養液中の酵素の安定性はさらに短いとそれは、孵化アプローチは非現実的。
これは、機器のセットアップ、インジェクション、およびキナーゼ NIR photoactivation プロトコルは他のタンパク質や酵素のクラスにも、化学的に変更されたキナーゼのためだけでなく、一般的に適用されるべき報告。また、だろう細胞研究で役に立つ直接の紫外線暴露は望ましくありません。さらに、ケージの bioeffector-UCNP 複合体は、膜タンパク質や膜受容体、細胞内の配信の問題を回避し、体内利用に該当するプラットフォームなどの細胞外のターゲットと対話できます。静脈注射後ケージ タンパク質ホルモンまたは治療用タンパク質は近赤外照射領域でのみ、bioeffector のアクティブ フォームを与えられます。
マイクロインジェクションは、このプロトコルでは最も重要なステップです。正確な注入の針の読み込み中に泡を避けるため。読み込み後すぐにインジェクターに針をインストールし、目詰まりの原因となります乾燥から針先を防ぐために中に針の先端を浸します。マイクロインジェクション オペレーターのスキル成功した射出速度を向上させることが欠かせません。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
資金調達 (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2) ありがとうナノ科学と技術学院プログラムと科学省台湾の技術。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Ammonium hydroxide (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
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