Summary
I denne protokollen, bur protein kinase A (PKA), en cellular signal signaltransduksjon bioeffector, var immobilisert på hydrogenion underlag, microinjected i stoffer og aktivert ved upconverted UV lys fra nær infrarød (NIR) bestråling, inducing nedstrøms stress fiber oppløsningen i stoffer.
Abstract
Upconversion hydrogenion (UCNP)-mediert photoactivation er en ny tilnærming til eksternt kontroll bioeffectors med mye mindre Phototoksisitet og dypere vev gjennomtrenging. Men er eksisterende instrumentering på markedet ikke lett kompatibel med upconversion program. Derfor er endrer kommersielt tilgjengelige instrumentet viktig for denne forskningen. I dette papiret illustrere vi først endringene konvensjonelle fluorimeter og fluorescens mikroskop for å gjøre dem kompatible for Foton upconversion eksperimenter. Vi beskriver syntesen av en nær infrarød (NIR)-utløst bur protein kinase A katalytisk delenhet (PKA) immobilisert på et UCNP kompleks. Parametere for microinjection og NIR photoactivation prosedyrer rapporteres også. Etter den bur PKA-UCNP er microinjected i REF52 fibroblast celler, utløser NIR bestråling, som er betydelig bedre enn konvensjonelle UV bestråling, effektivt PKA signal signaltransduksjon veien i levende celler. I tillegg bekrefter positive og negative kontroll eksperimenter at PKA-indusert veien fører til oppløsningen av stress fiber er spesielt utløst av NIR bestråling. Dermed gir bruk av protein-endret UCNP en innovativ tilnærming for å fjernstyre lys-modulert mobilnettet eksperimenter, som direkte eksponering for UV lys må unngås.
Introduction
Kjemisk endret proteiner som kan photoactivated (f.eks PKA bur proteiner) har blitt utviklet som et nye felt i kjemisk biologi ikke-invasively manipulere intercellulære biokjemiske prosesser1,2 ,3. Ved hjelp av lys som en stimulans gir god spatiotemporal oppløsning når du aktiverer disse bur proteiner. UV lys kan imidlertid forårsake uønskede morfologiske endringer, apoptose og DNA skade celler4,5. Derfor, den siste utviklingen i utformingen av photocaging grupper fokus på aktivere photocleavage ved lengre-bølgelengde eller to-fotonet eksitasjon å redusere Phototoksisitet, så vel som for å øke dype vev penetrasjon6,7. Caging grupper som svarer til lengre bølgelengde tillater oss å velge passende uncaging bølgelengder (i.e.kanaler) å selektivt aktivere bioeffectors når to eller flere caging grupper er tilstede7. Gitt disse nyttige funksjoner, er utvikle nye røde lys photocaging grupper svært viktig oppstrøms arbeid i fotokjemisk metoder for biologiske studier fra undersøkelser mekanismer av reaksjoner å kontrollere mobilnettet aktiviteter8. Likevel, en to-fotonet caging gruppe er normalt for hydrofobe på grunn smeltet aromatiske ringen, og en synlig lys caging gruppe er normalt organometalliske, med aromatiske ligander. Hydrofobe/aromatiske egenskapen passer ikke når bioeffector er et protein eller enzym, som det denatures webområdet aktivering av enzym/protein og forårsaker tap av funksjon, selv om den bøyning og photolysis fortsatt fungerer på kjemiske nivå2 ,9.
UCNPs er effektive transdusere som konvertere NIR eksitasjon lyset til UV. Dette unike og spennende eiendom UCNPs har tilbudt realistisk løsninger på utfordringene knyttet til photoactivation og utløste kontrollert utgivelsen av små molekyler, inkludert folsyre10, cisplatin derivater11 , DNA/siRNA12copolymer blemmer13og hul partikler14. Imidlertid etter beste overbevisning, har UCNP-assistert photoactivation av enzymer og proteiner ikke blitt testet så langt. Fordi det ikke er noe vellykket tilfelle av bruker rødt lys eller NIR å fotoaktive et enzym, vi ble bedt om å utføre NIR-utløst aktivering av en protein/enzym konstruere består av kjemisk endret bur enzym komplekser med en silica-belagt, transisjonsmetall-dopet UCNP15. UCNP var konjugert med et raskt reagere signal signaltransduksjon kinase i form av bur PKA i denne studien. PKA styrer glykogensyntese og cellen cytoskjelett regulering som reagerer på eksterne stimuli via syklisk adenosin fosfat (cAMP) regulering i stoffer16. Vi studerte muligheten for enzym aktivisering i timelige og romlig oppførsel i en mobilnettet eksperiment etter NIR bestråling. Denne UCNP-assistert photoactivation-plattformen er en ny metode for å photoactivate et enzym bruker NIR, og unngår uønskede signal signaltransduksjon svaret fra celler forårsaket av konvensjonelle UV bestråling2,4.
Det er svært vanskelig å translocate store bioeffectors (f.eks proteiner) over cellemembranen kontrollere cellular aktivitet. Selv om partikkel-immobilisert protein kan være lettere å translocate via endocytose i stoffer, kan endocytose være skadet eller degradert via endosomal entrapment og påfølgende lysosomale fornedrelse2,4. Selv om bur protein er fremdeles funksjonell etter membran translokasjon, kan translocated beløpene ikke være nok til å utløse cellulær respons2,17. I skarp kontrast er microinjection en direkte og kvantitativ tilnærming til å levere store bioeffectors til cytoplasma i cellen. Videre krever UCNP-immobilisert bioeffector upconverted lys skal aktiveres. Derfor krever optisk instrumentering ytterligere endring måle, visualisere og utnytte upconversion lyset. I dette arbeidet beskrives levering av et bur PKA-UCNP kompleks til en celle med microinjection og følgende viktige spektroskopi og mikroskopi endringer for NIR photoactivation i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: protokollen beskriver en detaljert instrumentering modifikasjon for upconversion-assistert photoactivation, en syntetisk prosedyre for å generere bur PKA-UCNP, overføring elektronmikroskop (TEM) av silika-belagt UCNP og bur PKA-UCNP prøver, UV og NIR photolysis oppsett, celle forberedelse, PKA-UCNP microinjection, en photoactivation studie og stress fiber farging av REF52 celler.
1. Fluorimeter installasjonsprogrammet for Upconversion spektrum måling
- installere en 4 X linsen ved cuvette innehaver av fluorescens spectrometer slik at laseren er fokusert på midten av cuvette.
- Plasserer en tunable 0,5 - til 8-W 980-nm laserdiode 90° mot linsen.
FORSIKTIG: Operatoren må ha laser sikkerhet kunnskap og slitasje NIR laser beskyttelsesbriller. - Installere en full refleksjon speil i lys banen skjæringspunktet av linsen og laser. Plasser en svart anodisert metallplaten å blokkere vinduet excitation med spektroskopi og beskytte de innvendige delene.
- Plasserer cuvette av silisium-belagt UCNP løsning (0.2 - 0.6 mg/mL) i cuvette holderen slik at en lys upconversion strålen kan visualiseres og kan brukes til å justere beste lys for speilet installasjon.
- Bytte av spektroskopi luminescence modus med laveste avdrag Spenningsinnstillingen (avpass en høyere innstilling hvis signalet er for svakt). Justere speilet beste justeringen, der strålen er på midten av cuvette og avdrag plukker opp det sterkeste signalet.
- Måle upconversion spekteret, etter justering, med ønsket strøminnstillingen. Bruke en termisk haug makt meter for å bygge en kalibreringskurven av laser makt mot de elektriske gjeldende leser på strømforsyningen laser. Hele tiden sjekke laser ytelsen til at ytelsen skal innen kalibrert.
2. Mikroskopet Setup
Merk: følgende oppsett fungerer for mikroskop utstyrt med en to-lags optisk bane. Hvis brukeren forsøker å installere en eksitasjon lyskilde bryter i tilbake porten NIR laser og metallhalid lampen dele de samme port, blokkerer collimator på baksiden porten betydelig NIR fordi det er utformet for å redusere eksempel oppvarming. Brukeren må gjøre et vanskelig valg: holde collimator og lider av svært lav upconversion effektivitet, eller fjerne collimator og ofre intensiteten av eksitasjon lys for epifluorescence.
Merk: en cutaway diagram som viser lett bane oppsettet for en modifisert spectrofluorometer, mikroskopi for upconversion luminescence og NIR photolysis modus og epifluorescence og UV photolysis modus og eksperimentelle oppsett brukt til dette eksperimentet er illustrert i figur 2.
- Utstyrer fluorescens mikroskop med en metall metallhalid lys guide, rettet inn baksiden porten
Merk: I denne øvre-lags lys banen der det er en kube tårn, en kube posisjon må være tom å tillate NIR kommer fra de lavere lag lys søkesti. - Installere en tunable 0,5 til 8.0 W 980 nm laserdiode i høyre porten og side-port collimator åpne.
Merk: Dette forstørrer laser lys spot til rundt 500 µm i diameter når en 10 X linsen. Fjerne denne collimator resulterer i en mikrometer rekkevidde lys plass og gjør NIR celle bestråling upraktisk. Denne collimator er NIR-transparente. - Installere en dichroic speil (850-nm kort-pass) og et eksitasjon filter (950 nm lang-pass) i den nedre-lags lys søkesti.
- Bruker en UCNP løsning for å visualisere NIR lys stedet. Juster plasseringen av laser midtstille NIR lysstrålen i synsfeltet til slutt justeringen.
3. Forberedelse og karakterisering av bur PKA-UCNP bygge
- Incubate rekombinant PKA (9 µM) med 0,5 mM 2-nitrobenzylbromide (NBB) i caging bufferen (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl og 10 mM MgCl 2, pH 8.5) for 1-2 h på 25 ° C. Quench den overskytende NBB med 10 mM dthiothreitol (DTT) og deretter dialyze mot 4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-ethanesulfonic syre (HEPES) buffer (10 mM, pH 7.5) for å fjerne overflødig reagenser og salter.
Merk: pH i caging løsningen er senket fra 8.5 til 7.5 under dialyse med HEPES pH 7.5 for påfølgende immobilisering reaksjonen. - Blanding transisjonsmetall salter-Y(CH3CO2) 3 hydrat (99,9%, 0.4527 g, 1,38 mmol), Yb (CH 3 CO 2) 3 hydrat (99,9%, 0.2533 g, 0,60 mmol) og Tm (CH 3 CO 2) 3 hydrat (99,9%, 0.0168 g, 0.02 mmol)-octadecene (30 mL) og oljesyre (12 mL), varm blandingen til 115 ° C i 30 min og avkjøle dem til 50 ° C. Deretter oppløse reaksjonsblandingen i en methanolic løsning (20 mL) med 0.2 g (5.0 mmol) av NaOH pellets og 0.2964 g (8 mmol) av ammonium fluor ved sonication i 15 min. øke reaksjon temperaturen til 300 ° C å få UCNP kjernen (β-NaYF 4 : 1,0% Tm 3 + / 30% Yb 3 +) nanopartikler.
- Løses kjernen nanopartikler (25 mg) med CO-520 (0,5 mL) i cyclohexane (10 mL). Legge til ammoniakk (wt 30% v/v, 0,08 mL) og tetraethylorthosilicate (TAKHOS, 0.04 mL) og bruke konstant omrøring 12 h ved romtemperatur å få silika-belagt β-NaYF 4: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + kjernen nanopartikler.
- Ruge PKA (6 nmol) eller bur PKA (6 nmol) med UCNP (1 mg) 15 HEPES buffer (10 mM, pH 7.5) på 4 ° C for 3t til nakkens PKA på silisium-belagt UCNP via elektrostatisk interaksjoner.
- Filtrerer blandingen med PVDF filter (0,45 µm), sentrifuge 17000 x g for 10 min ved 4 ° C, og redisperse pellets i HEPES (50 µL, 10 mM, pH 7.5) med 0,1% protein stabilisator å få renset PKA-UCNP komplekset. Sentrifuge 17000 x g i 10 min på 4 ° C og samle nedbryting for en Bradford analysen i en 1.5-mL tube.
- Analysere ubegrenset PKA i nedbryting reddet fra trinn 3,5 med en Bradford analysen tilbake-beregner PKA substitusjon nivået på UCNP partikler, som normalt har en substitusjon ~ 4,5 nmol av PKA per mg av partikkel.
Merk: Bradford analysen avdekker en sterk blå farge på pellets, noe som tyder på et høyt nivå og stabil protein immobilisering uten desorpsjon, mens supernatant brøkdel av bur PKA-UCNP løsning viser en farge som ligner HEPES buffer ( Figur 4 c-4e).
4. Karakterisering
Merk: kinase analysen er brukt om å kvantifisere til aktiviteten av pyruvate kinase. I korte trekk resulterer fosforylering av peptid, som er koblet til pyruvate kinase og laktat dehydrogenase, i oksidasjon av NADH. Dannelsen av sistnevnte overvåkes av måler nedgang i absorbansen av NADH på 340 nm.
- Fastslå aktiviteten PKA og PKA-UCNP i en 60 µL totalvolum av analysen blandingen inneholder 4-morpholinepropanesulfonic acid (MOPS, 100 mM, pH 7.5), KCl (100 mM), phosphoenolpyruvate (PEP, 1 mM), adenosin trifosfat (ATP, 1 mM), β - nikotinamid adenine dinucleotide, reduseres skjemaet (NADH, 0,8 mM), magnesiumklorid (MgCl 2, 1 mM), kemptide (0.4 mM) og en pyruvate kinase/laktat dehydrogenase blanding (30/40 enheter av PK/LDH).
- Måler nedgang i NADH absorbansen over tid etter tillegg av PKA løsning (2 µL) til analysen blanding. Beregne stigningstallet for linjen til direkte gjenspeiler aktiviteten til kinase måles.
- Måle aktiviteten PKA-UCNP 15 og den totale aktiviteten, som bør være godt tilpasset med multiplikasjon produktet opprinnelig PKA-spesifikk aktivitet og beregnede PKA overflaten-belagt beløpet.
5. Photolysis Setup
- tiltakure all makt lys kilder med en termisk haug sensor og beregne makt tettheter (PD = Power (W) / området (cm 2)) 18 basert på lys spot området.
- Utfører i vitro UV photolysis eksperimenter på en kommersiell system med en 365 nm LED (200 mW/cm 2) 15.
- For UV photoactivation på mikroskopet scenen, belyse PKA-UCNP løsningen med magnetisering lys filtrert av en kommersiell kube 15.
Merk: Tetthet er ~ 15 mW/cm 2, uten linsen fokusere. - For i vitro NIR photoactivation på mikroskopet scenen, belyse PKA-UCNP løsningen bruker en 980 nm laser med tilpassede upconversion filter/speil innstillinger installert på lavere nivå lys banen, en dichroic speil (850 nm kort-pass), og et eksitasjon filter (950 nm lang-pass).
Merk: Utgang tetthet er 5 W/cm 2 før 4 X linsen fokus. Tetthet er anslått til ~ 68 W/cm 2 etter 4 X linsen fokusere.
6. Eksempel forberedelse og Microinjection av PKA-UCNP komplekser
- pre-filter prøvene gjennom et 0,45 µm filter etter PKA immobilisering (trinn 3,5).
- Ruge cellene i 10% fosterets bovin serum (FBS) som inneholder L-15 medium i microinjection perioden for stabil pH kontroll utenfor inkubator.
Merk: for å bekrefte microinjection ferdigstillelse, co injisere den opprinnelige PKA-UCNP, bur PKA-UCNP eller PEGylated UCNP (7.5 mg/mL) 15 med 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) (10 µM) i cellene. - Juster konsentrasjonen av PKA-UCNP partikler slik at etter microinjection, cytosolic konsentrasjonen er 1-3 μM PKA - mange fysiologiske konsentrasjon for PKA i en celle, med forutsetningen at injeksjon volumet er 1/10 av mobilnettet volum .
- Utføre microinjection inn i cellene (trinn 6.2) bruker en microinjector enhet kombinert med en en-aksen hydraulisk micromanipulator ( Figur 3).
- Bruker en digital manometer overvåke stort trykk som brukes av microinjector er i rekkevidden (~ 50-200 hPa) og forsegle dispenser ventilen i en tilpasset presse kammer å gi kompensasjon press for microinjection. Trekke tilbake nålen med en hevet.
- Trykkstøtte injeksjon mellom 50 og 75 hPa, med en injeksjon tid på 200-300 ms og kompensasjon trykket på 15 hPa å hindre kultur medium tilbakestrømming inn nålen kapillær handling.
- Undersøke tips åpningene pinner å sikre at de har en ytre diameter mellom 1,3 og 1,5 µm, som kan bekreftes ved å ta bilder ved hjelp av en 40 x linsen.
- Vask cellene med 2 mL L-15 medium som inneholder 10% FBS etter microinjection. Observere mobilnettet fluorescens avbilding fra 5 (6) - carboxytetramethyl - rhodamine (TAMRA) å bekrefte microinjection fullføring.
7. Photoactivation av bur PKA-UCNP bruker UV eller NIR lys i levende celler
- For UV photoactivation etter PKA-UCNP-microinjection vokse REF52 cellene i en 3,5 µm rett, legg dem på mikroskopet scenen og irradiate dem med UV lys filtrert etter kuben for 3 min uten linsen fokusere.
Merk: REF52 celler ble opprettholdt i DMEM som inneholder 10% FBS på 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator, og cellene var subcultured når confluency nådd 90% hver 2-3 dager. - For NIR photoactivation etter PKA-UCNP microinjection, lyse cellene i en 980-nm laser fra lavere lag filter/speil innstillinger, som beskrevet i trinn 5.4.
Merk: Tetthet utgangseffekt er 5 W/cm 2 før 10 X linsen fokus og er anslått til 300 W/cm 2 etter 10 x linsen fokus. Upconversion er en prosess som krever en høy Foton tetthet, spesielt når en større anti-Stoke endring er nødvendig. Derfor fokuserer kreves under photoactivation. - Når et større lys sted (650 µm x 520 µm) er nødvendig, irradiate disse cellene med NIR fokusert av en 10 x linsen med en collimator i 15 min. Tillat for en 5 min mørke intervall etter hver 5-min bestråling å unngå oppvarming.
Merk: Når en høy romlig oppløsning (subcellular lys spot) er nødvendig, bruker den 40 X linsen med et pinhole installert Avslutt slutt lys guide for å generere en subcellular dimensjon lys plass (5 µm x 4 µm). I dette tilfellet 1 s bestråling er nok for NIR photoactivation på grunn av høy fluks av fotoner. - Etter UV eller NIR photolysis, at cellene å komme i en 5% CO 2 inkubator på 37 ° C 1t komplett medium til mobilnettet svar. Deretter løse dem i 1 mL av 4% paraformaldehyde/fosfat-bufret saltvann (PBS) for 20 min før videre farging.
FORSIKTIG: Paraformaldehyde er svært giftig; unngå kontakt med hud, øyne og slimhinner. Unngå puste pulver måle og forberedelse.
8. Visualisering av Stress Fiber oppløsningen forårsaket av NIR Photoactivation
- etter fiksering, bruk Alexa 594-phalloidin (legger til 5 µL av 6.6 µM lagerløsning 200 µL av PBS til farging, ruge for 25 min ved romtemperatur) stain og visualisere stress fibrene. Se bildene på Alexa 594-phalloidin (Ex 581 nm/Em 609 nm) med en filteret.
- Ruge celler for 5 min med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i romtemperatur. Etter vask prøvene med PBS og separat ta fluorescerende bilder av stress fiber og atomkjerner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utformingen av bur enzym-UCNP Konstruer er illustrert i figur 1. PKA enzymet var første reagert med 2-nitrobenzyl bromide generere en inaktiv bur PKA, og det ble deretter elektrostatisk immobilisert på overflaten av UCNP. UCNPs avgir upconverted lys og følgelig cleave photolytically o-nitrobenzyl gruppene i Cys 199 og Cys 343, genererer den aktivert PKA. TEM bilder og Bradford analysen bekreftet at PKA og bur PKA var immobilisert onto overflaten av UCNPs, og kinase aktiviteten bur PKA-UCNP løsning etter UV photoactivation var assayed (Figur 4). Etter PKA immobilisering, en dynamisk lysspredning instrument avslørt størrelsen og zeta potensialet i PKA-partikkel anlegget skal 120 nm og-16.0 mV, henholdsvis. Bradford analysen av PKA-UCNP løsningen viste en sterk lilla farge på partikler, noe som tyder på et høyt nivå og stabil protein immobilisering.
REF52 rotten embryonale fibroblast celler ble valgt for å studere photoactivation i mobilnettet eksperimentet. I dette eksperimentet, kan PKA veien slås på endogene PKA Aktivisering (som utløses av inkubasjonstiden for celle-permeable 8-CPT-cAMP) eller microinjection av den aktive eller triggerable PKA. Aktivert PKA (med eller uten partikkel immobilisering) oppløses stress fibrene og eksponerer mer trådformede utgangen (F-utgangen) overflate og dermed fluorophore-merket phalloidin, som sterkt bindes til F-utgangen, gir et høyere flekker signal. Etter 8-CPT-cAMP inkubasjon eller microinjection gratis PKA, aktive PKA-UCNP eller UV-aktivert PKA-UCNP (som positivt-kontroll eksperimenter) bekreftet vi tilstedeværelse av sterke stress fiber oppløsningen skyldes PKA veien Aktivisering (figur 5). Både endogene PKA og microinjected PKA studier viser hele celle stress fiber oppløsning, mens partikkel-immobilisert PKA (aktiv PKA-UCNP og UV-aktivert PKA-UCNP) viser stress fiber oppløsningen bare på området microinjection, lengre antyder stabile immobilisering av PKA på UCNPs. NIR photoactivation eksperimentet, etter microinjection bur PKA-UCNP og NIR-bestråling UCNPs avgir upconverted lys og cleave o-nitrobenzyl gruppene i Cys 199 og Cys 343. Derfor de generere aktivert PKA, oppløst stress fiber, og gi en høyere signal av fluorophore-merket phalloidin flekker (figur 6). Negative-kontroll eksperimenter på REF52 celler microinjected med UCNP uten bur PKA og deretter NIR-bestrålt, samt REF52 celler med bur PKA-UCNP i fravær av bestråling, viste ingen effekt på stress fiber integritet.
Figur 1 . Illustrasjon av bur PKA-UCNP Design og Upconversion-assistert PKA Uncaging. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: En Cutaway Diagram som viser lett bane ordningen. (en) endret spectrofluorometer og (b) mikroskop upconversion luminescence og NIR photolysis modus (venstre) og for epifluorescence og UV photolysis modus (høyre), samt deres eksperimentelle oppsett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Eksperimentell oppsett for Microinjection. Innehaveren av injeksjon er kombinert med en en-aksen olje hydraulisk micromanipulator i en vinkel mellom 30° og 45°. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Bekreftelse av PKA immobilisering på UCNP. TEM bilder av (en) silisium-belagte UCNP og (b) bur PKA-immobilisert UCNP; Bradford analysen (c) HEPES buffer, (d) pellet brøkdel rørets bur PKA-UCNP løsning, og (e) nedbryting brøkdel av bur PKA-UCNP løsning; og (f) kinase aktivitet analysen bur PKA-UCNP løsning etter UV photoactivation. Dette tallet er gjengitt fra Gao, H.-D. et al. etter eksplisitt tillatelse er Hentet fra publisher, American Chemical Society. Skala bar = 20 nm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Fluorescens bilder av Stress Fiber flekker (grønn) og DAPI flekker av kjerner (blå) i REF52 celler, viser Stress Fiber oppløsning og morfologiske endringer som utløses av ulike PKA aktivisering. (en) Untreated celler, (b) 8-(4-Chlorophenylthio) adenosin 3', 5'-sykliske monofosfat (8-CPT-cAMP)-behandlet celler, (c) aktiv PKA-microinjected celler, (d) aktiv PKA-UCNP-microinjected celler og ( e) bur PKA-UCNP-microinjected celler etter UV bestråling. (f-j) Optisk densitet (OD) bilder avledet fra (a-e), henholdsvis. (ko) Tilsvarende intensitet kurvene langs den blå pilen. Den hvite pilen viser microinjected cellen. Baren skala = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Fluorescens bilder av REF52 celler Microinjected med ulike PKA former. Celler microinjected med (en) bur PKA-UCNP etter NIR bestråling, (b) PEG-podet UCNP under NIR bestråling, og (c) bur PKA-UCNP uten bestråling. (d-f) Upconverted utslipp av UCNP (i den stiplede boksen) (a-c). (g-i) Flettede bilder av stress fiber (grønn), upconversion utslipp (rød) av UCNP komplekse, og DAPI flekker av kjerner (blå). NIR photoactivation cellene ble gjennomført på en belyse området på 650 µm x520 µm ved hjelp av en 10 X linsen. Fluorescens bildene ble kjøpt med en 40 X linsen. Derfor ble NIR bestråling området redusert til 150 µm x 120 µm, som angitt i den stiplede røde boksen. Upconversion luminescence kan sees i (c). For kvantifisering studier med ImageJ, var OD bilder (j-l) avledet fra (a-c), henholdsvis. Intensitet kurver langs den blå pilen vises i (j-l) ble tegnet i (m-o). En høy signal-til-støy-forhold (S/N) ble observert for dette systemet, og anses å være en positiv respons. Denne tilnærmingen ble brukt for alle Alexa 594-phalloidin flekker quantifications. Den hvite pilen viser microinjected cellen. Baren skala = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere fant Hofmann og kolleger at dramatiske morfologiske endringer ble observert i REF52 celler etter microinjection av gratis PKA19. I en annen studie demonstrerte Lawrence gruppen at bur PKA kan være aktivert i vivo, fører til morfologiske endringer og oppløsningen av stress fiber når de utsettes for UV photolysis20. Tidligere rapporter om utnytte upconverted UV lys for photoactivation viste aktivering av flere UCNP-assistert, bur, små molekylære bioeffectors21,22,23. En protokoll for å bruke UCNP-assistert photoactivation i den viktigste klassen av bioeffector, enzymet, trenger imidlertid fortsatt skal utvikles. Derfor, i denne studien vi beskrive en mobilnettet eksperiment protokoll som inkluderer NIR photoactivation av bur PKA bruker UCNPs. I denne NIR photoactivation plattformen, ble bur PKA20 immobilisert på overflaten av silika-belagt UCNPs brukt til å demonstrere muligheten for å kontrollere signalet signaltransduksjon veien av cellen med NIR som en utløser. REF52 celler microinjected med en bur PKA-UCNP konstruere og bestrålt med NIR viste en effekt på stress fiber oppløsning, samt morfologiske endringer i cellene. I tillegg var positiv og negativ kontroll eksperimenter utført og viste at PKA-indusert veien fører til oppløsningen av stress fiber utløses ved NIR bestråling.
Instrumentet endringen er beskrevet i dette manuskriptet, mens PKA kjemisk endring er godt dokumentert andre steder15. Hvis en godt utformet eksperiment krever feilsøking, først finne ut om problemene genereres fra: (i) protein-UCNP komplekset, (ii) microinjection eller (iii) optisk instrumentering. Protein photoactivation problemer: (1) gjør sikker som PKA er aktiv, (2) bekrefte at bur PKA har gjenværende aktivitet som < 5% av den opprinnelige verdien, (3) konstatere at UV-uncaged PKA har minst 50% av sin virksomhet, restaurert, (4) gjør at som bur PKA er immobilized på UCNP overflaten (utføre en Bradford analysen), og (5) sikre at bur PKA-UCNP også har minst 50% av sin virksomhet, gjenopprettes (ved å utføre UV bestråling). Microinjection problemer: (1) pass at pinne-spissen er åpen og protein-UCNP løsningen er lastet riktig. Plass lastet nålen (tips) på et mikroskop med en NIR eksitasjon kanal. Hvis upconversion fluorescens er observert, er lasting korrekt. (2) injisere protein-UCNP i cellene og observere fluorescens intensiteten av co injisert 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) fargestoff og upconversion partikkel. Riktig injeksjon vil resultere i intens TAMRA og upconversion partikkel fluorescens i cellene. For feilsøking av mikroskopet optisk endring: (1) fjerne linsen, slå på NIR laser, og sette termisk haug makt meter sensoren på mikroskopet scenen å måle NIR, som ikke skal blokkeres av en upassende innfatning. (2) installere linsen og sette gjennomsiktig bunn søppel fylt med 10 mg/mL UCNP løsning på mikroskopet scenen. En skarp blå stråle i løsningen oppstår hvis optikk installeres riktig.
Microinjection kan bare gi en begrenset antall celler for analyse. Injeksjon suksessraten er operatør (eller erfaring)-avhengige, som er en stor begrensning av denne teknikken. Men er det ingen annen måte å omkjøringsvei det så langt. Mange forskere foreslår at bruken av partikkel-celle inkubasjon kan cellene til opptak partikler. Dette er imidlertid ikke en mulig tilnærming. Selv om mobilnettet partikkel opptak oppstår og opptak er nok, vil det akkumuleres i endosomes/lysosomer, men ikke i stoffer. Dette bestemte signal signaltransduksjon enzymet må ligge i stoffer ikke endosomes, å være effektive. Videre, når PKA oppløst i en perfekt lagring buffer på 37 ° C, sin virksomhet ikke varer etter overnatting lagring. Enzym stabilitet i celle kultur medium er enda kortere, og det gjør den inkubasjon tilnærmingen upraktisk.
Dette rapportert instrumental oppsett, microinjection og kinase NIR photoactivation protokollen bør være generelt gjelder, ikke bare for kjemisk endret kinase, men også for andre protein eller enzym klasser. Dessuten, det ville være nyttig i mobilnettet studier der direkte UV-stråling er uønsket. Videre kan bur bioeffector-UCNP komplekset samhandle med ekstracellulære mål som membran proteiner eller membran reseptorer, unngå intracellulær levering problemet og gjøre plattformen gjelder i vivo bruk. Etter IV injeksjon har bur protein hormoner eller terapeutisk proteiner aktivert form av bioeffector bare i NIR-bestrålt regioner.
Microinjection er det viktigste trinnet i denne protokollen. Presis injeksjon, unngå bobler mens p. Etter lasting, umiddelbart installere nålen i injektoren og fordype pinne-spissen til medium å hindre pinne-spissen tørker, som vil føre til tilstopping. Microinjection operatør dyktighet er avgjørende for en høyere vellykket injeksjon rate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Nano vitenskap og teknologi Program av Academia Sinica og departementet for vitenskap og teknologi av Taiwan for finansiering (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Ammonium hydroxide (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
