Summary
Neste protocolo, enjaulado proteína quinase A (PKA), um bioeffector de transdução de sinal de celular, foi imobilizada em uma superfície de nanopartículas, injetada no citosol e ativada pelo upconverted UV luz de irradiação de infravermelho próximo (NIR), induzindo desintegração de fibra de stress a jusante no citosol.
Abstract
Nanopartículas de upconversion (UCNP)-mediada photoactivation é uma nova abordagem para remotamente controle bioeffectors com muito menos fototoxicidade e com penetração mais profunda do tecido. No entanto, a instrumentação existente no mercado não é prontamente compatível com aplicação de upconversion. Portanto, modificar o instrumento comercialmente disponível é essencial para esta pesquisa. Neste trabalho, nós primeiro ilustram as modificações de um fluorímetro convencional e o microscópio de fluorescência para torná-los compatíveis para experimentos de upconversion de fóton. Em seguida, descrevemos a síntese de um infravermelho próximo (NIR)-desencadeada enjaulado proteína quinase A catalítica subunidade (PKA) imobilizada em um complexo UCNP. Parâmetros para microinjeção e NIR photoactivation procedimentos também são relatados. Depois que o PKA-UCNP enjaulado é injetada em células de fibroblastos REF52, a irradiação de NIR, que é significativamente superior ao convencional irradiação UV, dispara eficientemente via PKA de transdução de sinal em células vivas. Além disso, experimentos de controle positivos e negativos confirmar que o pathway induzida por PKA levando à desintegração de fibras de estresse especificamente é desencadeado por irradiação de NIR. Assim, o uso de proteínas modificadas UCNP fornece uma abordagem inovadora para controlar remotamente a luz modulada experimentos celulares, no qual deve-se evitar a exposição directa à luz UV.
Introduction
Proteínas quimicamente modificadas que podem ser fotoativados (por exemplo, as proteínas PKA enjaulado) foram desenvolvidas como um campo emergente na biologia química de forma não-invasiva, manipular processos bioquímicos intercelulares1,2 ,3. Usando a luz como um estímulo oferece excelente resolução spatiotemporal quando activar estas enjaulado proteínas. No entanto, a luz UV pode causar alterações morfológicas indesejáveis, apoptose e dano ao DNA de células4,5. Daí, desenvolvimentos recentes na concepção dos grupos photocaging focar permitindo que photocleavage sobre o mais longo comprimento de onda ou dois fotões excitação para reduzir fototoxicidade, bem como para aumentar a penetração de tecidos profundos6,7. Enjaulamento grupos que respondem ao comprimento de onda mais longo, permitindo-nos escolher o apropriado uncaging comprimentos de onda (ou seja, canais) seletivamente ativar bioeffectors quando dois ou mais grupos de enjaulamento estão presentes7. Tendo em conta estas características úteis, desenvolver novos grupos de photocaging de luz vermelha é muito importante trabalho upstream em fotoquímicas metodologias para estudos biológicos, que vão desde os mecanismos de reações de controle de atividades celulares8de sondagem. Apesar de tudo, um grupo de enjaulamento dois fotões é normalmente muito hidrofóbico devido à estrutura de anel aromático fundido, e um grupo de enjaulamento de luz visível é normalmente organometálico, com ligantes aromáticos. Esta propriedade hidrofóbica/aromático não é adequada quando o bioeffector é uma proteína ou enzima, que desnatura o site da ativação da enzima/proteína e provoca a perda de função, mesmo se a conjugação e fotólise continua a funcionar a nível químico2 ,9.
UCNPs são eficazes transdutores que convertem a luz de excitação de NIR aos raios UV. Esta propriedade única e fascinante de UCNPs ofereceu-se resoluções realistas para enfrentar os desafios associados a fotoativação e desencadeada a liberação controlada de moléculas pequenas, incluindo ácido fólico10, cisplatina derivados11 , DNA/siRNA12, copolímero vesículas13e partículas ocas14. No entanto, o melhor de nosso conhecimento, o photoactivation assistida por UCNP de enzimas ou proteínas não foi testado até agora. Porque não há nenhum caso de sucesso do uso de luz vermelha ou NIR a fotoativa uma enzima, recebemos indicações para executar a ativação de uma enzima/proteína de construção composta por complexos enzima enjaulado quimicamente modificado com uma sílica-revestido, acionadas por NIR dopado com lantanídeos UCNP15. Neste estudo, o UCNP foi conjugada com uma quinase de transdução de sinal reagir rapidamente sob a forma de PKA enjaulado. PKA controla a síntese de glicogênio e regulamento do citoesqueleto que responde a estímulos externos, através de regulamento de adenosina cíclico (cAMP) de fosfato no citosol16. Estudamos a viabilidade de activação enzimática em educação espacial e temporal em um experimento de celular após a irradiação de NIR. Esta plataforma photoactivation assistida por UCNP é uma nova metodologia para Fotoativar uma enzima usando NIR e evita a resposta de transdução de sinal indesejado de células causada por UV convencional irradiação2,4.
É muito difícil translocar bioeffectors grande (por exemplo, proteínas) através da membrana celular para controlar a atividade celular. Apesar de partícula-imobilizado proteína pode ser mais fácil para translocar através de endocitose no citosol, endocitose pode ser danificado ou degradada através de uma armadilha de CDDP e a consequente degradação lisossomal2,4. Mesmo se a proteína enjaulada é ainda funcional após translocação da membrana, os montantes translocados podem não ser suficiente para desencadear a resposta celular2,17. Em contraste, a microinjeção é uma abordagem direta e quantitativa para entregar grandes bioeffectors para o citoplasma da célula. Além disso, bioeffector UCNP-imobilizado requer upconverted luz para ser ativado. Portanto, a instrumentação óptica requer mais modificação para medir, Visualizar e utilizar a luz upconversion. Neste trabalho, a entrega de um complexo de PKA-UCNP enjaulado para uma célula utilizando microinjeção e as seguintes modificações essenciais de espectroscopia e microscopia para NIR photoactivation será descrita em detalhes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: O protocolo descreve uma modificação de instrumentação detalhada para photoactivation upconversion assistida, um procedimento sintético para gerar enjaulado PKA-UCNP, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) do UCNP de sílica-revestido e enjaulado amostras de PKA-UCNP, UV e NIR instalação de fotólise, preparação da pilha, microinjeção de PKA-UCNP, um estudo de fotoativação e a coloração de fibra de stress das células REF52.
1. fluorímetro instalação para medição do espectro Upconversion
- instalar um 4 X da lente objetiva ao lado o titular da cubeta do espectrómetro de fluorescência para que o laser está focado no meio da cuvete.
- Coloque um sintonizável 0,5 - 8 W 980 nm láser 90° contra a lente objetiva.
Atenção: O operador precisa ter conhecimento de segurança do laser e usar óculos de laser NIR. - Instalar um espelho de reflectância total na interseção feixe luminoso da lente objetiva e laser. Coloque uma placa metal anodizada preta para bloquear a janela da excitação da espectroscopia e proteger as partes interiores.
- Coloque a cubeta de sílica revestidos de solução UCNP (0,2 - 0,6 mg/mL) no suporte de cubeta para que um feixe luminoso upconversion pode ser visualizado e pode ser usado para ajustar o alinhamento de luz melhor para a instalação do espelho.
- Interruptor a espectroscopia de modo luminescência com PGTO tensão mais baixa (ajustar para um ajuste maior, se o sinal é muito fraco). Ajustar o espelho para o melhor alinhamento, onde o feixe no meio da cubeta e o pgto pega o sinal mais forte.
- Medir o espectro de upconversion, após o alinhamento, com a potência desejada. Use um medidor de energia térmica de pilha para construir uma curva de calibração da potência do laser contra a leitura de corrente elétrica na fonte de alimentação do laser. Verificar constantemente o desempenho do laser para certificar-se de que o desempenho está dentro da faixa calibrada.
2. Instalação do microscópio
Nota: A seguinte configuração funciona para microscópios equipados com percurso óptico de duas camadas. Se o usuário pretende instalar um interruptor de luz fonte de excitação na porta traseira para fazer o laser NIR e a lâmpada de iodetos compartilham a mesma porta, o colimador na porta traseira significativamente bloqueará o NIR porque ele é projetado para reduzir o aquecimento da amostra. O usuário deve fazer uma escolha difícil: manter o colimador e sofrem de upconversion muito baixa eficiência, ou remover o colimador e sacrificar a intensidade da luz para a epifluorescência excitação.
Nota: um diagrama de fraque, mostrando o esquema do trajeto da luz para um spectrofluorometer modificado, a microscopia para upconversion luminescência e modo de fotólise NIR e epifluorescência e modo de fotólise de UV e a instalação experimental utilizado para este experimento são ilustrados na Figura 2.
Guia- Equip o microscópio de fluorescência com um haleto de metal leve, dirigido na parte de trás porto
Nota: nesse caminho de luz camada superior onde há uma torre de cubo, uma posição de cubo deve estar vazia para permitir NIR vem o caminho da luz. camada inferior - Instalar um diodo 0.5 a 8.0 W 980 nm laser ajustável na porta do lado direito, com o colimador de porta lateral aberta.
Nota: Isto amplia o laser luz pontual para cerca de 500 µm de diâmetro quando é usado um 10 X da lente objetiva. Remover este colimador resulta em um ponto de luz-escala micrométrica e faz a irradiação de célula NIR impraticável. Este colimador é transparente para NIR. - Instalar um espelho dicroico (850 nm curto-pass) e um filtro de excitação (950 nm - passe longo) no caminho luz da camada inferior.
- Usar uma solução UCNP para visualizar o ponto de luz de NIR. Ajuste a posição do laser para o centro do feixe de luz de NIR no campo de visão para terminar o alinhamento.
3. Preparação e caracterização de PKA-UCNP Caged construir
- recombinante PKA incubar (9 µM) com 0,5 mM 2-nitrobenzylbromide (NBB) em enjaulamento buffer (20 mM Tris-HCl, NaCl de 100 mM e 10 mM MgCl 2; pH 8,5) para 1-2 h a 25 ° C. Quench a NBB em excesso com 10 mM dthiothreitol (TDT) e em seguida Dialize contra 4-(2-hidroxietil) tampão ácido etanesulfónico-1-piperazina (HEPES) (10 mM, pH 7,5) para remover os reagentes em excesso e sais.
Nota: O pH da solução de enjaulamento é reduzido de 8,5 para 7,5 durante a diálise com pH HEPES 7.5 para a reação de imobilização subsequente. - Mix o lantanídeos sais-Y(CH3CO2) 3 de cloral (99,9%, 0,4527 g, 1.38 mmol), Yb (CH 3 CO 2) 3 hidrato (99,9%, 0,2533 g, 0,60 mmol) e Tm (CH 3 CO 2) 3 hidratado (99,9%, 0,0168 g, 0,02 mmol)-octadecene (30 mL) e ácido oleico (12 mL), aquecer a mistura até 115 ° C por 30 min e resfriá-los a 50 ° C. Em seguida, dissolva a mistura de reação em solução metanólica (20 mL) com 0,2 g (5,0 mmol) de NaOH pelota e 0,2964 g (8 mmol) de fluoreto de pelo sonication durante 15 min. aumentar a temperatura de reação a 300 ° C para obter o núcleo UCNP (β-NaYF 4 : 1.0% Tm 3 + / 30% Yb 3 +) nanopartículas.
- Dissolver as núcleo nanopartículas (25 mg) com CO-520 (0,5 mL) em ciclo-hexano (10 mL). Adicionar amoníaco (wt 30% v/v, 0,08 mL) e tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) e aplique a agitação constante por 12 horas a temperatura ambiente para obter o silicone revestido β-NaYF 4: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + núcleo nanopartículas.
- Incubar o PKA (6 nmol) ou enjaulado PKA (6 nmol) com UCNP (1 mg) 15 em tampão HEPES (10 mM, pH 7,5) a 4 ° C por 3 h imobilizar o PKA em sílica revestidos UCNP através de interações eletrostáticas.
- Filtrar a mistura usando filtro de PVDF (0,45 µm), centrifugar 17.000 x g por 10 min a 4 ° C e redisperse a pelota em HEPES (50 µ l, 10 mM, pH 7,5) contendo 0,1% proteína do estabilizador para obter o complexo de PKA-UCNP purificado. Centrifugar a 17.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C e recolher o sobrenadante para um ensaio de Bradford em um tubo de 1,5 mL.
- Analisar o PKA ilimitado no sobrenadante salvou da etapa 3.5 com um ensaio de Bradford para trás-calcular o nível de substituição de PKA das partículas de UCNP, que normalmente têm um nível de substituição de ~ 4,5 nmol de PKA por mg de partícula.
Nota: O ensaio de Bradford revela uma forte cor azul sobre as pelotas, que sugere uma imobilização de alta proteína nivelada e estável sem dessorção, enquanto a fração sobrenadante de presos solução PKA-UCNP mostra uma cor semelhante a HEPES buffer ( Figura 4 c-4e).
4. Caracterização
Nota: O ensaio da quinase é usado para quantificar a atividade específica de piruvato quinase. Em breve, a fosforilação do peptide, que é acoplado ao piruvato quinase e lactato desidrogenase, resulta na oxidação do NADH. Formação destes últimos é monitorizada medindo-se a diminuição de absorbância do NADH a 340 nm.
- Determinar a atividade de PKA e PKA-UCNP em um volume total de 60 µ l da mistura de ensaio contendo ácido 4-morpholinepropanesulfonic (MOPS, 100 mM, pH 7,5), KCl (100 mM), fosfoenolpiruvato (PEP, 1mm), trifosfato de adenosina (ATP, 1mm), β - dinucleótido de nicotinamida e adenina, reduzido a forma (NADH, 0.8 mM), cloreto de magnésio (MgCl 2, 1mm), kemptide (0,4 mM) e uma mistura de desidrogenase do piruvato quinase/lactato (30/40 unidades de PK/LDH).
- Medir a diminuição de absorbância do NADH ao longo do tempo após a adição da solução PKA (2 µ l) para a mistura de ensaio. Calcular o declive da linha que refletem diretamente a atividade da quinase sendo medida.
- Medir a atividade do PKA-UCNP 15 e a atividade global, que deve ser bem combinada com o produto da multiplicação da atividade de PKA específico nativa e o montante calculado de superfície revestida de PKA.
5. Instalação de fotólise
Meas- URE, todo o poder da luz fontes usando um sensor térmico de pilha e calcular a densidade de potência (PD = potência (W) / área (cm 2)) 18 com base na área local luz.
- Realizar em vitro UV fotólise experiências em um sistema comercial com LED (200 mW/cm 2) 365 nm 15.
- Photoactivation para UV no palco microscópio, iluminar a solução PKA-UCNP com a excitação luz filtrada por um cubo comercial 15.
Nota: A densidade de potência é ~ 15 mW/cm 2 sem foco da lente objetiva. - Para em vitro photoactivation NIR no palco microscópio, iluminar a solução de PKA-UCNP usando um 980 nm laser com upconversion personalizado configurações de filtro/espelho instaladas sobre o trajeto da luz de nível inferior, um espelho dicroico (850 nm curto-pass), e um filtro de excitação (950 nm-passe longo).
Nota: A densidade de potência de saída é de 5 W/cm 2 antes 4 X lente objetiva com foco. A densidade de potência é estimada em ~ 68 W/cm 2, depois 4 X com foco da lente objetiva.
6. Preparação da amostra e microinjeção de complexos de PKA-UCNP celular
- pré-filtrar as amostras através de um filtro de 0,45 µm após imobilização PKA (passo 3.5).
- Incube as celulas em 10% de soro fetal bovino (FBS) contendo meio de L-15 durante o período de microinjeção para controle de pH estável fora da incubadora.
Nota: para confirmar a conclusão de microinjeção, co injetar o PKA-UCNP nativo, enjaulado PKA-UCNP ou PEGylated UCNP (7,5 mg/mL) 15 5 6-tetrametilrodamina (TAMRA) (10 µM) em células. - Ajustar a concentração de partículas de PKA-UCNP tal que, depois da microinjeção, a concentração citosólica é 1-3 μM PKA - um intervalo de concentração fisiológica para PKA em uma cela, com a suposição de que o volume de injeção é 1/10 do volume celular .
- Realizar a microinjeção dentro das células (passo 6.2) usar um dispositivo de microinjector juntamente com um micromanipulador hidráulico de um eixo ( Figura 3).
- Use um medidor digital de pressão para monitorar a pressão aplicada pelo microinjector está na gama de funcionamento (~ 50-200 hPa) e feche a válvula do distribuidor em uma câmara pressionando personalizada para fornecer pressão de compensação para o microinjection. Puxe a agulha usando um extrator.
- Manter a pressão de injeção entre 50 e 75 hPa, com um tempo de injeção de 200-300 ms e a pressão de compensação a 15 hPa para evitar o refluxo do meio de cultura na agulha por acção capilar.
- Examinar as aberturas da ponta da agulha para garantir que eles têm um diâmetro externo entre 1,3 e 1,5 µm, que pode ser confirmado por tomar imagens usando uma lente objetiva de 40 x.
- Lavar as células com 2 mL de meio de L-15, contendo 10% FBS depois da microinjeção. Observar a imagem de fluorescência celular de 5 (6) - carboxytetramethyl - rodamina (TAMRA) para confirmar a conclusão de microinjeção.
7. Photoactivation de Caged PKA-UCNP usando UV ou luz NIR em células vivas
- para UV photoactivation depois da microinjeção de PKA-UCNP, crescem as células REF52 em um prato de 3,5 µm, colocá-los no palco microscópio e eles a irradiação com luz UV filtrado por o cubo para 3 min sem foco da lente objetiva.
Nota: REF52 células foram mantidas em DMEM contendo 10% FBS a 37 ° C em uma incubadora de 2 CO 5% e as células foram repicagem quando a confluência chegou a 90% a cada 2-3 dias. - Para NIR photoactivation depois da microinjeção de PKA-UCNP, iluminar as células em um laser de 980 nm de configurações de filtro/espelho de nível inferior, conforme descrito na etapa 5.4.
Nota: A saída de densidade de potência é 5 W/cm 2 antes 10 X lente objetiva com foco e é estimada em 300 W/cm 2 após a focagem da lente objetiva de 10x. Upconversion é um processo que requer uma densidade de fóton alta, especialmente quando é necessária uma maior mudança de anti-Stoke. Concentrando-se, portanto, é necessário durante a fotoativação. - Quando é necessário um ponto de luz maior (650 µm x 520 µm), irradiar estas células com NIR focada por uma lente objetiva de 10x com um colimador de 15 min. permitir para um intervalo de 5 min escuro após cada irradiação 5 min para evitar aquecimento.
Nota: Quando uma alta resolução espacial (ponto de luz subcellular) é necessário, usar o 40 X da lente objetiva com uma pinhole instalado na extremidade de saída da guia de luz para gerar um ponto de luz subcellular-dimensão (5 µm x 4 µm). Neste caso, 1 s de irradiação é suficiente para NIR photoactivation devido ao elevado fluxo de fótons. - Depois de UV ou NIR fotólise, permitem que as células para se recuperar em uma 5% CO 2 incubadora a 37 ° C por 1 h no meio completo para gerar respostas celulares. Posteriormente, corrigi-los em 1 mL de 4% paraformaldeído/fosfato-salino (PBS) por 20 min antes de manchar mais.
Cuidado: Paraformaldehyde é altamente tóxico; Evite o contacto com a pele, olhos ou mucosas. Evitar respirar o pó durante a medição e preparação.
8. Visualização de desintegração da fibra Stress causado por NIR Photoactivation
- após a fixação, utilizar Alexa 594-faloidina (adicionar 5 µ l de solução-mãe 6.6 µM a 200 µ l de PBS para coloração; incubar durante 25 min à temperatura ambiente) a mancha e Visualize as fibras de estresse. Visualizar as imagens de Alexa 594-faloidina (Ex 581 nm/Em 609 nm) usando um conjunto de filtro.
- Incube as celulas por 5 min em 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) à temperatura ambiente. Depois da coloração, lavar as amostras com PBS e separadamente fazer imagens fluorescentes de fibras de stress e núcleos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O projeto de construção de gaiolas enzima-UCNP é ilustrado na Figura 1. A enzima PKA foi primeiro reagiu com brometo de 2-nitrobenzil para gerar um PKA enjaulado inativo, e então estava eletrostaticamente imobilizado na superfície de UCNP. UCNPs emitem a luz de upconverted e consequentemente photolytically cleave os grupos ó-nitrobenzil em 199 Cys e 343 Cys, gerando o PKA registrado. TEM imagens e ensaio de Bradford confirmaram que o PKA e enjaulado PKA foram imobilizados na superfície do UCNPs, e a atividade da quinase do enjaulado solução PKA-UCNP após fotoativação UV foi analisada (Figura 4). Após imobilização de PKA, um instrumento de difusão dinâmica da luz revelou o tamanho e o potencial zeta do complexo PKA-partícula ser 120 nm e-16.0 mV, respectivamente. Ensaio de Bradford da solução PKA-UCNP mostrou uma forte cor roxa das partículas, o que sugere uma imobilização de alta proteína nivelada e estável.
Células de fibroblastos embrionários de rato REF52 foram Selecionadodas para o estudo de fotoativação no experimento de celular. Neste experimento, via PKA pode ser ativada por ativação de PKA endógena (que é desencadeada pela incubação da célula-permeável 8-CPT-cAMP) ou a microinjeção de PKA do ativo ou triggerable. PKA registrado (com ou sem imobilização de partícula) se desintegra as fibras de stress e expõe mais filamentoso superfície de actina (F-Actina) e a faloidina fluoróforo-rotulados, portanto, que se liga fortemente aos F-Actina, produzindo um sinal maior coloração. Após incubação de 8-CPT-cAMP ou microinjection de PKA livre, PKA-UCNP ativo, o PKA-UCNP UV-ativado (como experimentos de controle positivo), confirmamos a presença de desintegração de fibra forte stress causada pela ativação do caminho PKA (Figura 5). Tanto endógena PKA e microinjected estudos PKA mostram desintegração de fibra de célula inteira de estresse, enquanto a partícula-imobilizado PKA (PKA-UCNP ativo e PKA-UCNP UV-ativado) exibe stress fibra desintegração somente no local da microinjeção, mais sugerindo a imobilização estável de PKA sobre os UCNPs. Para o experimento de fotoativação NIR, depois da microinjeção do PKA enjaulado-UCNP e a irradiação de NIR, UCNPs emitem luz upconverted e decompor os grupos ó-nitrobenzil em 199 Cys e Cys 343. Consequentemente, eles geram o PKA registrado, desintegrou-se fibras de estresse e produzem um sinal mais elevado pela faloidina fluoróforo-rotulado coloração (Figura 6). Experiências de controle negativo com REF52 células injetadas com UCNP sem o PKA enjaulado e então NIR irradiados, bem como células REF52 com PKA-UCNP enjaulado na ausência de irradiação, não mostrou nenhum efeito na integridade de fibra de stress.
Figura 1 . Ilustração de PKA enjaulado-UCNP Design e PKA Upconversion assistida Uncaging. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Um Cutaway diagrama mostrando o esquema do trajeto da luz. (um) modificada spectrofluorometer e (b) microscópio para upconversion luminescência e NIR modo de fotólise (à esquerda) e epifluorescência e modo de fotólise de UV (direito), bem como sua instalação experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Instalação experimental para o Microinjection. O titular de injeção é acoplado com um micromanipulador hidráulico óleo de um eixo em um ângulo entre 30° e 45°. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Confirmação de imobilização de PKA na UCNP. UCNP sílica-revestido de imagens TEM de (um) e (b) enjaulados UCNP PKA-imobilizado; Ensaio de Bradford de (c) HEPES buffer, ressuspensão de fração (d) a pelota de solução de PKA-UCNP enjaulada e fração (e) o sobrenadante da solução enjaulada de PKA-UCNP; e (f) ensaio de atividade da quinase de enjaulado solução PKA-UCNP após a fotoativação de UV. Esta figura tem sido reproduzida do Gao, H.-D. et al. Depois que obteve-se a permissão explícita do editor, a American Chemical Society. Barra de escala = 20 nm clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Imagens de fluorescência de Stress fibra coloração (verde) e DAPI coloração dos núcleos das células REF52 (azul), mostrando a desintegração de fibras de estresse e mudanças morfológicas desencadeadas pela ativação da PKA diferente. (um) Untreated células, (b) 8-(4-Chlorophenylthio) adenosina 3', 5'-cíclica monofosfato (8-CPT-cAMP)-tratados ( , (c) ativo PKA-injetadas células, (d) ativo PKA-UCNP-injetadas células e células e) enjaulados PKA-UCNP-injetadas células após a irradiação UV. (f-j) As fotos de densidade óptica (D.O.) derivado (a-e), respectivamente. (k-o) As correspondentes curvas de intensidade ao longo da seta azul. A seta branca indica a célula microinjected. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagens de fluorescência de REF52 células injetadas com várias formas PKA. As células injetadas com (um) enjaulados PKA-UCNP após a irradiação do NIR, (b) UCNP PEG-enxertadas sob irradiação de NIR, e (c) enjaulados PKA-UCNP sem irradiação. (d-f) A emissão de upconverted de UCNP (na caixa tracejada) para (a-c). (g-i) Imagens mescladas de fibras de estresse (verdes), emissões upconversion (vermelhas) do complexo do UCNP e DAPI coloração de núcleos (azul). NIR photoactivation das células foi conduzido em uma área iluminante de 650 µm x520 µm usando uma lente de objetiva X 10. As imagens de fluorescência foram adquiridas usando uma lente de objetiva X 40. Daí, a área de irradiação de NIR foi reduzida a 150 µm x 120 µm, conforme indicado na caixa tracejada vermelha. A luminescência upconversion pode ser vista em (c). Para estudos de quantificação, usando o ImageJ, fotos OD (j-l) foram derivadas (a-c), respectivamente. Curvas de intensidade ao longo de seta azul mostrada em (j-l) foram plotadas em (m-o). Uma alta relação sinal-ruído (S/N) observou-se para este sistema e é considerada uma resposta positiva. Esta abordagem foi aplicada para todos os Alexa 594-faloidina coloração quantificações. A seta branca indica a célula microinjected. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anteriormente, Hofmann e colegas de trabalho encontraram que dramáticas mudanças morfológicas foram observadas em células REF52 após a microinjeção da enciclopédia PKA19. Em outro estudo, o grupo de Lawrence demonstrou que PKA enjaulado pode ser registrados na vivo, levando a alterações morfológicas e a desintegração de fibras de estresse quando submetido a UV fotólise20. Anteriores relatórios sobre explorando upconverted UV luz para photoactivation mostrou a ativação de vários UCNP assistida, enjaulado, pequenas bioeffectors molecular21,22,23. No entanto, um protocolo para usar o photoactivation assistida por UCNP na classe mais importante de bioeffector, a enzima, ainda precisa ser desenvolvido. Portanto, neste estudo, descrevemos um protocolo de experiência celular que inclui o photoactivation NIR de PKA enjaulado usando UCNPs. Nesta plataforma de fotoativação NIR, enjaulado PKA20 imobilizada na superfície da sílica revestidos UCNPs foi usado para demonstrar a viabilidade de controlar a via de transdução de sinal da célula usando o NIR como um gatilho. REF52 células injetadas com uma PKA de enjaulado-UCNP construir e irradiados com NIR mostrou um efeito sobre a desintegração de fibras de estresse, bem como alterações morfológicas nas células. Além disso, positivo e negativo controle experimentos foram realizados e provou que a via induzida por PKA, levando à desintegração de fibras de stress é desencadeada por irradiação de NIR.
A modificação do instrumento é descrita neste manuscrito, enquanto o PKA modificação química é bem documentada em outros lugares15. Se um experimento bem-desenvolvida requer resolução de problemas, primeiro identificar se os problemas gerados a partir de: (i) o complexo proteína-UCNP, (ii) microinjeção ou instrumentação (iii) óptica. Em caso de problemas de fotoativação de proteína: (1) fazer certeza que o PKA é ativo, (2) confirma que o PKA enjaulado tem atividade residual que é < 5% do seu valor original, (3) determinar que o PKA UV-uncaged tem pelo menos 50% da sua actividade restaurado, (4) fazer claro que o PKA enjaulado é imobilizada na superfície de UCNP (realizar um ensaio de Bradford) e (5) garantir que o PKA enjaulado-UCNP também tem pelo menos 50% da sua actividade restaurado (através da realização de irradiação UV). Para problemas de microinjeção: (1) Make certeza que ponta de agulha é aberta e a solução de proteína-UCNP é carregada corretamente. Coloque a agulha carregada (dica) em um microscópio com um canal de excitação de NIR. Se for observada upconversion fluorescência, o carregamento está correto. (2) injetar a proteína-UCNP as células e observar a intensidade da fluorescência de 5 co injetado 6-tetrametilrodamina (TAMRA) tintura e upconversion partícula. Injeção adequada resultará em fluorescência de partícula TAMRA e upconversion intensa nas células. Para microscópio óptica modificação de solução de problemas: (1) remover a lente objetiva, ligue o laser NIR e colocar o sensor de medidor de potência térmica de pilha no palco microscópio para medir o NIR, que não deve ser bloqueado por uma configuração incorreta. (2) instalar a lente objetiva e colocar uma cubeta transparente-fundo preenchida com 10 mg/mL de solução de UCNP na fase de microscópio. Um feixe azul afiado na solução será visto se a ótica está todos instalada corretamente.
Microinjeção só pode fornecer um número limitado de células para análise. A taxa de sucesso de injeção é o operador (ou experiência)-dependente, que é uma grande limitação dessa técnica. No entanto, não há nenhuma outra maneira de contorná-lo até agora. Muitos cientistas sugerem que o uso de incubação de partícula-célula permite as células para captação de partículas. No entanto, isto não é uma abordagem viável. Mesmo se ocorre absorção de partículas celulares e a quantidade de absorção é suficiente, ele irá acumular em endossomos/lisossomos, mas não no citosol. Esta enzima de transdução de sinal específico precisa ser localizado no citosol, não endossomos, para ser eficaz. Além disso, quando o PKA é dissolvido em um buffer de armazenamento perfeito a 37 ° C, sua atividade não dura depois de armazenamento durante a noite. A estabilidade da enzima em meio de cultura celular é ainda mais curta, e isso faz com que a abordagem de incubação impraticável.
Isso relatado instrumental instalação, microinjeção e quinase NIR photoactivation protocolo deve ser geralmente aplicável, não só para a quinase quimicamente modificada, mas também para outras classes de proteína ou enzima. Além disso, seria útil em estudos celulares onde a exposição direta UV é indesejável. Além disso, o complexo de bioeffector-UCNP enjaulado pode interagir com alvos extracelulares, como proteínas de membrana ou receptores de membrana, evitando o problema de entrega intracelular e tornando a plataforma aplicável para uso na vivo . Após injeção intravenosa, hormônios proteicos enjaulado ou proteínas terapêuticas terá a forma ativada do bioeffector apenas nas regiões de NIR irradiados.
Microinjeção é o passo mais crítico neste protocolo. Para injeção de precisa, evite bolhas durante o carregamento de agulha. Após o carregamento, imediatamente instalar a agulha para o injector e mergulhe a ponta da agulha entram no meio, para evitar que a ponta da agulha de secagem, que irá causar entupimento. Habilidade do operador de microinjeção é fundamental para uma maior taxa de sucesso de injeção.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Agradecemos a Nano ciência e tecnologia programa de Academia Sinica e o Ministério da ciência e tecnologia de Taiwan de financiamento (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Ammonium hydroxide (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
