Summary
В этом протоколе, клетке протеинкиназа A (PKA), bioeffector трансдукции сигнала сотовой, иммобилизованных на поверхности наночастиц, microinjected в цитозоль и активированную upconverted УФ света от ближней ИК-области спектра (NIR) облучения, вызывая вниз по течению стресс волокна дезинтеграции в цитозоль.
Abstract
Upconversion наночастиц (UCNP)-опосредованной photoactivation представляет собой новый подход для удаленного управления bioeffectors с гораздо меньше Фототоксичность и глубокое проникновение в ткани. Однако существующие измерительные приборы на рынке не легко совместимы с приложением upconversion. Таким образом изменение коммерчески доступных инструмент имеет важное значение для этого исследования. В этой статье мы сначала проиллюстрировать изменения обычных fluorimeter и флуоресценции Микроскоп, чтобы сделать их совместимыми для фотонных upconversion экспериментов. Затем мы опишем синтез возле ИК-области спектра (NIR)-срабатывает клетке протеин киназы A каталитического субъединицы (PKA) иммобилизованных на UCNP комплекс. Сообщается также о параметры микроинъекции и НИР photoactivation процедур. После того, как клетке PKA-UCNP microinjected в REF52 фибробластов клетки, NIR облучения, который значительно превосходит обычные УФ облучения, эффективно вызывает PKA путь трансдукции сигнала в живых клетках. Кроме того положительной и отрицательной контроля эксперименты подтверждают, что PKA-индуцированной путь, ведущий к дезинтеграции стресс волокон специально инициируется NIR облучения. Таким образом использование белков модифицированных UCNP обеспечивает новаторский подход к удаленно контролировать свет модулированных клеточных экспериментов, в которых необходимо избегать прямого воздействия ультрафиолета.
Introduction
Химически модифицированных белков, которые могут быть photoactivated (например, белки PKA клетке) были разработаны как новые поля в химической биологии неинвазивно манипулировать межклеточных биохимические процессы1,2 ,3. С помощью света, как стимул обеспечивает отличное разрешение пространственно-временных при активации эти клетке белков. Однако УФ света может привести к нежелательным морфологические изменения, апоптоз и повреждение ДНК клеток4,5. Таким образом последние события в дизайн photocaging групп сосредоточена на включение photocleavage на больше длины волны или два Фотон возбуждения для уменьшения Фототоксичность, а также увеличить проникновение глубокой ткани6,7. Арретирование групп, которые отвечают больше длины волны, позволяя нам выбрать подходящий uncaging волн (т.е., каналы) выборочно активировать bioeffectors, когда два или более арретирование группы являются настоящей7. Учитывая эти полезные функции, разработка новых групп photocaging красный свет является очень важной подготовительной работы в фотохимических методологий для биологических исследований, начиная от прощупывания механизмов реакций для контроля клеточной деятельности8. Тем не менее двух Фотон арретирование группа обычно слишком гидрофобные благодаря структуре плавленого ароматическое кольцо, и видимый свет арретирование группа обычно металлоорганические, с ароматическими лигандами. Это свойство гидрофобные/ароматические не подходит, когда bioeffector белков и ферментов, как он денатурирует активация сайт белка фермента и приводит к потере функции, даже если спряжение и фотолиз по-прежнему работают на химическом уровне2 ,9.
UCNPs являются эффективным преобразователи, которые преобразуют свет возбуждения NIR УФ. Это уникальный и увлекательный свойство UCNPs предлагает реалистичные резолюций для решения проблем, связанных с photoactivation и вызвали контролируемого высвобождения малых молекул, включая фолиевой кислоты10, цисплатин производные11 ,12, сополимер везикулы13и полые частицы14ДНК/siRNA. Однако в меру наших знаний, при содействии UCNP photoactivation энзимов или протеинов не тестировалась так далеко. Потому что есть нет успешным примером использования красный свет или NIR фотоактивного фермент, мы были пробуждены для выполнения НИР срабатывает активации белка/фермента конструкции, состоящие из химически модифицированных клетках фермента комплексов с кремний покрытием, легированный лантаноиды UCNP15. В этом исследовании UCNP был проспряганное с быстро реагирующих киназы трансдукции сигнала в виде клетке PKA. PKA управляет синтеза гликогена и цитоскелета регулирование, которое реагирует на внешние раздражители через циклические аденозина фосфат (лагерь) регулирование в цитозоль16. Мы изучили возможности активации фермента в временных и пространственных формах в клеточном эксперимент после облучения НДК. Эта помощь UCNP photoactivation платформа является новой методологии photoactivate фермент, используя НИР и позволяет избежать нежелательного сигнала трансдукции ответ от клеток, вызванные обычным УФ облучения2,4.
Это очень трудно перемещать большие bioeffectors (например, белки) через клеточную мембрану для управления клеточную активность. Хотя лишенных подвижности частиц белка может быть легче перемещать через эндоцитоза в цитозоль, эндоцитоза могут быть повреждены или деградировали через от англ захвата и последующего лизосомальных деградации2,4. Даже если клетке белка до сих пор функционирует после транслокации мембраны, translocated суммы не могут быть достаточно, чтобы вызвать клеточный ответ2,17. В противоположность микроинъекции является прямым и количественный подход к доставить большие bioeffectors в цитоплазму клетки. Кроме того UCNP-прикол bioeffector требует upconverted свет, чтобы быть активированы. Таким образом оптическое приборостроение требует дальнейшего изменения измерения, визуализировать и использовать света upconversion. В этой работе будет подробно доставки клетке PKA-UCNP комплекса в ячейку с помощью микроинъекции и следующие основные изменения микроскопии и спектроскопии для NIR photoactivation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Протокол описывает подробный инструментария модификация для помогал upconversion photoactivation, синтетические процедуры для создания клетке PKA-UCNP, просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) из кремний покрытием UCNP и в клетке PKA-UCNP образцы, НДК и УФ установки фотолиз, подготовка клетки, микроинъекции PKA-UCNP, photoactivation исследование и стресс окрашивание волокна из REF52 клеток.
1. Fluorimeter установки для измерения спектра Upconversion
- установить 4 X объектив рядом с держатель кювет спектрометр флюоресценции, так что лазер ориентирован на середине кювета.
- Место перестраиваемый 0,5 - 8-W 980 нм лазерный диод 90° против объектива.
Предупреждение: Оператор должен иметь лазерной безопасности знаний и носить очки Лазер NIR. - Установить зеркало полного отражения в пересечении пути света объектив и лазера. Место черный анодированный металлической пластиной блокировать окна возбуждения спектроскопии и для защиты деталей интерьера.
- Место кювет раствора кремний покрытием UCNP (0,2 - 0,6 мг/мл) в держатель кювет, так, что яркий upconversion луча могут быть визуализированы и может использоваться для регулировки лучший свет выравнивание для установки зеркала.
- Спектроскопия переключиться в режим свечения с минимальное значение напряжения ПЛТ (приспособиться к выше параметра, если сигнал слишком слабый). Отрегулируйте зеркало лучшее выравнивание, где луч на середине кювет и PMT подбирает наиболее сильным сигналом.
- Измерения спектра upconversion, после выравнивания, с требуемой мощности. Используйте измеритель мощности теплового ворс для построения калибровочной кривой мощности лазерного против электрического текущего чтение на лазерный источник питания. Постоянно проверять производительность лазерной чтобы убедиться, что производительность находится в пределах калиброванные.
2. Микроскоп Setup
Примечание: следующие установки работает для микроскопов, оснащена двухуровневой оптического пути. Если пользователь намеревается установить переключатель источника света возбуждения в задней порт сделать лазер НИР и металлогалогенные лампы разделяют тот же порт, Коллиматор в задней порту значительно будет блокировать НДК, потому что она призвана уменьшить Отопление образца. Пользователь должен сделать нелегкий выбор: сохранять коллиматором и страдают от очень низких upconversion эффективность, или удалить коллиматор и пожертвовать интенсивность возбуждения света для эпифлуоресцентного.
Примечание: визитка диаграмма, показывающая путь света схема для модифицированных spectrofluorometer, микроскопия upconversion люминесценции и NIR фотолиз режиме и эпифлуоресцентного и ультрафиолетового фотолиза режим и экспериментальной установки используется для этого эксперимента проиллюстрированы на рис. 2.
- Оборудовать флуоресцентным микроскопом с металлогалогенные света руководство, направлен в заднюю порт
Примечание: В этом пути света верхнего уровня где есть башенкой Куба, Куба на одну позицию должен быть пустым для NIR, из легких path. нижнего уровня - Установить перестраиваемый 0,5-8,0 W 980 нм лазерный диод в правой части порта с коллиматор стороне порт открыт.
Примечание: Это увеличивает лазерного света место около 500 мкм в диаметре, когда используется 10 X объектив. Удаление этого коллиматор приводит микрометр диапазон света месте и делает непрактичным NIR клеток облучения. Это коллиматорные прозрачен NIR. - Установить дихроичное зеркало (850-нм короткий перевал) и возбуждения фильтр (950 Нм Лонг перевал) в легких path. нижнего уровня
- Использовать UCNP решение для визуализации NIR света месте. Отрегулируйте положение лазерного центра НИР луч света в поле зрения для завершения выравнивания.
3. Подготовка и квалификация в клетке построить PKA-UCNP
- инкубировать рекомбинантных PKA (9 мкм) с 0,5 мм 2-nitrobenzylbromide (НББ) в останов буфера (20 мм трис-HCl, 100 мм NaCl и 10 мм MgCl 2; рН 8,5) для 1-2 ч при 25 ° C. Quench избыток НББ с 10 мм dthiothreitol (DTT) и затем dialyze против 4-(2-гидроксиэтилкрахмала) буфера пиперазина-1-ethanesulfonic кислота (HEPES) (10 мм, pH 7.5), чтобы удалить избыток реагентов и соли.
Примечание: РН раствора арретирование опускается от 8,5 до 7,5 во время диализа с HEPES pH 7.5 для последующей иммобилизацией реакции. - Смесь лантаноиды соли Y(CH3CO2) 3 гидрат (99.9%, 0.4527 g, 1.38 ммоль), Yb (CH 3 CO 2) 3 гидрат (99.9%, 0.2533 g, 0,60 ммоль) и ТМ (CH 3 CO 2) 3 гидрат (99.9%, 0,0168 g, 0,02 ммоль)-в octadecene (30 мл) и олеиновой кислоты (12 мл), Нагрейте смесь до 115 ° C в течение 30 мин и охладить их до 50 ° C. Далее, распустить реакционной смеси в метанольного раствора (20 мл) с 0,2 г (5,0 ммоль) NaOH гранул и 0.2964 g (8 ммоль) Фторид аммония в sonication на 15 мин увеличение температуры реакции до 300 ° C, чтобы получить ядро UCNP (β-NaYF 4 : 1,0% Tm 3 + / Yb 30% 3 +) наночастицы.
- Распустить ядро наночастиц (25 мг) с CO-520 (0,5 мл) в циклогексан (10 мл). Добавление аммиака (wt 30% v/v, 0,08 мл) и tetraethylorthosilicate (Теос, 0,04 мл) и применять постоянном перемешивании в течение 12 ч при комнатной температуре для получения кремния покрытием β-NaYF 4: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + основные наночастиц.
- Инкубировать PKA (6 нмоль) или клетке PKA (6 нмоль) с 15 UCNP (1 мг) в HEPES буфера (10 мм, pH 7.5) при 4 ° C 3 h для иммобилизации PKA на кремний покрытием UCNP через электростатических взаимодействий.
- Фильтр смесь, с помощью фильтра PVDF (0,45 мкм), центрифуги на 17.000 g x 10 мин при температуре 4 ° C и redisperse гранулы в HEPES (50 мкл, 10 мм, pH 7.5) содержащий 0.1% белковый стабилизатор для получения очищенного PKA-UCNP комплекс. Центрифуга на 17.000 g x 10 мин при температуре 4 ° C и собирать супернатант для assay Брадфорд в 1,5 мл.
- Анализа неограниченных PKA в надосадке спас от шаг 3.5 с assay Брадфорд обратно-рассчитать уровень замещения PKA на UCNP частицы, которые обычно имеют уровень замещения ~ 4,5 нмоль PKA на мг частицы.
Примечание: Assay Брадфорд раскрывает сильным синим цветом на гранулы, которая предполагает высокий уровень и стабильного белка иммобилизации без десорбции, в то время как супернатанта часть клетке PKA-UCNP решение показывает цвет похож на HEPES буфера ( Рисунок 4 c-4e).
4. Характеристика
Примечание: пробирного протеинкиназы используется для количественного определения удельной активности пируваткиназой. Короче говоря фосфорилирование пептид, который связан с пируваткиназой и лактатдегидрогеназа, приводит окисление НАДН. Формирования последнего контролируется путем измерения уменьшение поглощения NADH на 340 Нм.
- Определить деятельность PKA и PKA-UCNP в 60 мкл суммарный объем пробы смеси, содержащей 4-morpholinepropanesulfonic кислота (МОПЫ, 100 мм, pH 7.5), KCl (100 мм), phosphoenolpyruvate (ОПТОСОЗ, 1 мм), аденозин трифосфата (АТФ, 1 мм), β - Никотинамидадениндинуклеотид, уменьшена форма (NADH, 0,8 мм), хлорид магния (MgCl 2, 1 мм), kemptide (0,4 мм) и пирувата смесь киназы/лактат дегидрогеназа (30/40 единицы PK/ЛДГ).
- Мера уменьшение поглощения NADH со временем после добавления раствора (2 мкл) PKA смеси assay. Рассчитать наклон линии непосредственно отражает активность протеинкиназы измеряемого.
- Измерения активности PKA-UCNP 15 и общая деятельность, которая должна быть хорошо подобраны с продуктом умножения родной PKA-конкретной деятельности и расчетной величины PKA с покрытием поверхности.
5. Фотолиз установки
- МЭСЮр, все силы света источников с помощью датчика тепловой ворс и рассчитать плотность мощности (PD = мощность (W) / район (2 см)) 18 основанные на площади пятна света.
- Выполнять в экстракорпорального ультрафиолетового фотолиза эксперименты в коммерческой системе с 365 нм светодиодные (200 МВт/см 2) 15.
- Photoactivation для УФ на микроскопа, освещают PKA-UCNP решение с возбуждением света, отфильтрованных по коммерческой куб 15.
Примечание: Плотность мощности является ~ 15 МВт/см 2, без фокусировки объектива. - Для в пробирке photoactivation NIR на микроскопа, освещают PKA-UCNP решения с помощью 980 нм лазер с заказной upconversion фильтр/зеркало параметры установлены на пути света нижнего уровня, дихроичное зеркало (850 нм короткий перевал), и возбуждения фильтр (950 Нм Лонг пасс).
Примечание: Плотность выходной мощности, 5 Вт/см 2 до 4 X объектив упором. Удельная мощность оценивается в ~ 68 Вт/см 2 после 4 X объектив упором.
6. Сотовый пробоподготовки и микроинъекции PKA-UCNP комплексы
- Предварительный фильтр образцы через 0.45 мкм фильтр после PKA иммобилизации (шаг 3.5).
- Инкубировать клетки в 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), содержащие L-15 Средний период микроинъекции для управления стабильным рН за пределами инкубатора.
Примечание: для подтверждения завершения микроинъекции, совместно внедрить родной PKA-UCNP, клетке PKA-UCNP или Пегилированный UCNP (7,5 мг/мл) 15 с 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (ТАМРА) (10 мкм) в ячейки. - Регулировка концентрации частиц PKA-UCNP, таким образом, что после микроинъекции, цитозольной концентрация составляет 1-3 мкм PKA - физиологическая концентрация диапазон для PKA в ячейке, в предположении, что объем впрыска составляет 1/10 клеточных тома .
- Выполнять микроинъекции в клетки (шаг 6.2) с помощью microinjector устройства в сочетании с гидравлическим микроманипулятор одной оси ( рис. 3).
- Использования цифровой манометр для контроля давления, применяемых в microinjector находится в рабочем диапазоне (~ 50-200 гПа) и уплотнение клапана дозатор в камере заказной давление для обеспечения компенсации давления для микроинъекции. Тянуть обратно иглой с помощью съемника.
- Поддерживать давление впрыска между 50 и 75 гПа, время впрыска 200-300 мс и компенсации давления на 15 гПа для предотвращения обратного потока питательной среды в иглы действием капиллярных.
- Изучить отверстия кончик иглы для обеспечения, что они имеют наружный диаметр между 1,3 и 1,5 мкм, которые могут быть подтверждены путем принятия изображений с помощью 40 x объектив.
- Мыть ячейки с 2 мл L-15 среды, содержащие 10% FBS после микроинъекции. Соблюдать сотовой флуоресценции изображений от 5 (6) - carboxytetramethyl - родамин (ТАМРА) для подтверждения завершения микроинъекции.
7. Photoactivation в клетке PKA-UCNP с помощью УФ или NIR свет в живущих клетках
photoactivation- для УФ после PKA-UCNP микроинъекции, растут REF52 клеток на блюде 3,5 мкм, разместить их на микроскопа и облучить их с УФ-излучением, отфильтрованных по куб на 3 мин без фокусировки объектива.
Примечание: REF52 клетки были сохранены в среде DMEM, содержащие 10% FBS при 37 ° C в 5% CO 2 инкубатора и клетки были subcultured когда confluency достигла 90% каждые 2-3 дня. - Photoactivation для NIR после PKA-UCNP микроинъекции, освещают клетки на 980 нм лазер из настроек фильтра/зеркало нижнего уровня, как описано в шаге 5.4.
Примечание: Плотность мощности 5 Вт/см 2 до 10 X объектив упором и оценивается в 300 Вт/см 2 после 10 x объектив упором. Upconversion является процессом, который требует высокой Фотон плотности, особенно когда требуется больше сдвиг anti-Stoke. Следовательно, сосредоточив внимание необходима во время photoactivation. - , Когда требуется больше света месте (650 мкм x 520 мкм), излучают эти клетки с НДК, сосредоточено 10 x объектив с коллиматором 15 мин разрешить для интервала темный 5 мин после облучения каждого 5-мин, чтобы избежать Отопление.
Примечание: При высоких пространственным разрешением (субцеллюлярные света месте) необходимо использовать 40 X объектив с точечным, установленных в выход конце света руководства для создания субцеллюлярные измерения света месте (5 мкм x 4 мкм). В данном случае, 1 s облучения является достаточно для NIR photoactivation из-за высокого потока фотонов. - После УФ или NIR фотолиз, позволяют клеткам восстанавливаться в 5% CO 2 инкубатора при 37 ° C 1 ч в полной среды для создания клеточных реакций. Впоследствии, исправить их в 1 мл 4% параформальдегида/фосфат амортизированное saline (PBS) за 20 мин до дальнейшего окрашивания.
Предупреждение: Параформальдегида высоко токсичен; Избегайте контакта с кожей, глазами или слизистых оболочек. Избегать вдыхания порошка во время измерения и подготовка.
8. Визуализация стресс волокна дезинтеграции вызванных NIR Photoactivation
- после фиксации, используют Alexa 594-Фаллоидин (5 мкл 6,6 мкм Стоковый раствор для 200 мкл PBS для пятнать; Инкубируйте 25 мин при комнатной температуре) пятно и Визуализируйте напряжение волокон. Визуализировать изображения Alexa 594-Фаллоидин (Ex 581 Нм/Em 609 Нм) с помощью фильтра набора.
- Инкубации клеток для 5 минут в 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) при комнатной температуре. После окрашивания, стирать образцы с PBS и отдельно принимать люминесцентные изображения стресс волокон и ядер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Дизайн конструкции клетке фермент UCNP показано на рисунке 1. PKA фермента сначала реагирует с 2-nitrobenzyl бромид для создания неактивного клетке PKA, и он был затем электростатически лишенных подвижности на поверхности UCNP. UCNPs излучают свет upconverted и следовательно фотолитически прилепится o-nitrobenzyl групп на Cys 199 и Cys 343, генерации активированное PKA. ТЕА изображения и assay Брадфорд подтвердил, что PKA и клетке PKA были иммобилизованных на поверхность UCNPs, и активность киназы клетке PKA-UCNP решения после того, как был photoactivation УФ assayed (рис. 4). После иммобилизации PKA, инструмент динамического рассеяния света показали, размер и Зета потенциал комплекса PKA-частица, чтобы быть 120 Нм и-16.0 МВ, соответственно. Assay Брадфорд PKA-UCNP решения показал сильный фиолетовый цвет на частицы, которая предполагает иммобилизацию высокого уровня и стабильного белка.
REF52 крыса эмбриональных фибробластов клетки были отобраны для исследования photoactivation в клеточной эксперимент. В этом эксперименте PKA путь может быть включен эндогенного PKA активации (которая инициируется инкубации клеток проницаемой 8-CPT-лагерь) или микроинъекции PKA активной или triggerable. Активированное PKA (с или без иммобилизации частиц) распадается на стресс волокон и предоставляет более нитчатые актина (F-миозина) поверхность и следовательно Флюорофор меченых Фаллоидин, который сильно привязывается к F-актина, уступая сигнал выше окрашивание. После инкубации 8-CPT-лагерь или микроинъекции бесплатно PKA, активные PKA-UCNP или УФ активированный PKA-UCNP (как позитивные управления экспериментов) мы подтвердили наличие распада волокна сильный стресс, вызванные PKA пути активации (рис. 5). Эндогенные PKA и microinjected PKA исследования показывают поклеточного стресс волокна дезинтеграции, а частицы прикол PKA (активные PKA-UCNP и УФ активированный PKA-UCNP) отображает стресс волокна дезинтеграции только на сайте микроинъекции, далее предлагая стабильной иммобилизации PKA на UCNPs. Для эксперимента photoactivation NIR, после микроинъекции клетке PKA-UCNP и облучения NIR UCNPs излучать свет upconverted и прилепится o-nitrobenzyl групп на Cys 199 и Cys 343. Следовательно они порождают активированное PKA, распался стресс волокна и дают высокий сигнал на Флюорофор меченых Фаллоидин окрашивание (рис. 6). Отрицательные управления экспериментов на REF52 клетки microinjected с UCNP без клетке PKA и затем NIR-облучению, а также REF52 клетки с клетке PKA-UCNP в отсутствие облучения, показали не влияет на целостность волокна стресс.
Рисунок 1 . Иллюстрация клетке PKA-UCNP дизайн и помогал Upconversion PKA Uncaging. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Разрезе диаграмма, показывающая путь света схема. () изменено spectrofluorometer и (b) микроскоп для upconversion люминесценции и NIR фотолиз режим (слева) и эпифлуоресцентного и ультрафиолетового фотолиза режим (справа), а также их экспериментальной установки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Экспериментальная установка для микроинъекции. Держатель инъекций в сочетании с гидравлической микроманипулятор нефти одной оси на угол между 30° и 45°. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Подтверждение PKA иммобилизации на UCNP. ТЕА изображения () кремния покрытием UCNP и (b) в клетке PKA-прикол UCNP; Assay Брадфорд буфера (c) HEPES, (d) гранулы фракция ресуспендирования клетке PKA-UCNP раствора и (e) супернатант часть клетке PKA-UCNP раствора; и (f) киназы деятельности пробирного клетке PKA-UCNP решения после УФ photoactivation. Эта цифра была воспроизведена с Гао, х.-д. и др. После того, как явное разрешение было получено от издателя, американского химического общества. Шкалы бар = 20 Нм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Флуоресценции изображения стресс волокна, окрашивание (зеленый) и DAPI окрашивания ядер (синий) REF52 клеток, показывая стресс волокна дезинтеграции и морфологических изменений, вызванных различными PKA активации. () неочищенные клеток, (b) 8-(4-фосфодиэстеразы) аденозина 3', 5'-циклических монофосфат (8-CPT-лагерь)-лечение клетки, (c) активные PKA-microinjected клетки, клетки активные PKA-UCNP-microinjected (d) и ( e) клетке PKA-UCNP-microinjected клеток после УФ-облучения. (f-j) Оптическая плотность (O.D.) фотографии происходит от (a-e), соответственно. (k-o) Соответствующие кривые интенсивности вдоль синей стрелкой. Белая стрелка указывает microinjected клеток. В баре шкалы = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Изображения флуоресценции клеток REF52 Microinjected с различными формами PKA. Клетки microinjected с () клетке PKA-UCNP после облучения NIR, (b) ПЭГ привитые UCNP под облучением NIR, и (c) в клетке PKA-UCNP без облучения. (d-f) Upconverted выброс UCNP (в пунктирной коробки) для (a-c). (g-i) Объединенного изображения стресс волокон (зеленый), выбросы upconversion (красный) UCNP комплекс и DAPI окрашивания ядер (синий). НИР photoactivation клеток проводилась на Площадь освещающей 650 мкм x520 мкм с использованием 10 X объектив. Флуоресценции изображения были приобретены с использованием 40 X объектив. Следовательно области облучения NIR был сокращен до 150 мкм x 120 мкм, как указано в поле красной пунктирной линией. Upconversion свечения можно увидеть в (c). Для количественной оценки исследований с использованием ImageJ фотографии O.D. (j-l) были получены из (a-c), соответственно. (M-o) были нанесены кривые интенсивности вдоль синей стрелкой показано (j-l). Высокое соотношение сигнал шум (S/N) было отмечено для этой системы и считается положительный ответ. Этот подход был применен для всех Alexa 594-Фаллоидин окрашивание количественной. Белая стрелка указывает microinjected клеток. В баре шкалы = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ранее Hofmann и coworkers обнаружил, что драматические морфологические изменения наблюдались в REF52 клетках после микроинъекции бесплатно PKA19. В другом исследовании Лоуренс группа продемонстрировала, что клетке PKA может быть активирована в естественных условиях, ведущих к морфологические изменения и дезинтеграция стресс волокон при воздействии ультрафиолетового фотолиза20. В предыдущих докладах по эксплуатации upconverted УФ-излучения для photoactivation показал активации нескольких UCNP-помощь, клетке, маленькие молекулярные bioeffectors21,22,23. Однако протокол для использования при содействии UCNP photoactivation на наиболее важных класса bioeffector, фермента, все еще необходимо разработать. Следовательно в этом исследовании, мы описываем протокол сотовой эксперимент, который включает НДК photoactivation клетке PKA с помощью UCNPs. В этой платформе photoactivation NIR клетке PKA20 лишенных подвижности на поверхности кремния покрытием UCNPs был использован для демонстрации возможности контролировать путь трансдукции сигнала ячейки, используя НИР в качестве триггера. REF52 клетки, microinjected с клетке PKA-UCNP построить и облученных NIR, показал влияние на стресс волокна дезинтеграции, а также морфологические изменения в клетках. Кроме того положительной и отрицательной контроля эксперименты были выполнены и доказал, что PKA-индуцированной путь, ведущий к дезинтеграции стресс волокон инициируется NIR облучения.
Модификация инструмент описан в этой рукописи, а PKA химическая модификация документально других15. Если хорошо продуманных эксперимент требует устранения неполадок, сначала определить ли проблемы создаются из: (i комплекс белков UCNP, (ii) микроинъекции или (iii) оптических приборов. В случае белка photoactivation проблемы: (1) сделать конечно что PKA активен, (2) подтверждают, что клетке PKA остаточная активность, это < 5% от его первоначального значения, (3) удостовериться, что УФ отключенную PKA имеет по крайней мере 50% своей деятельности восстановлен, (4) сделать уверен что клетке PKA иммобилизованных на поверхности UCNP (выполнять assay Брадфорд) и (5) обеспечить что клетке PKA-UCNP также имеет по крайней мере 50% своей деятельности, восстановлен (выполняя УФ-облучения). Микроинъекции проблемы: (1) убедитесь, что что кончик иглы это открытым и белок UCNP решения загружается должным образом. Место загружен иглы (tip) на микроскопе с каналом возбуждения НДК. Если наблюдается upconversion флуоресценции, Загрузка является правильным. (2) inject белок UCNP в клетки и наблюдать интенсивности флуоресценции совместно вводят краситель 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (ТАМРА) и upconversion частицы. Надлежащего инъекции приведет к интенсивным ТАМРА и upconversion флуоресценции частиц в ячейках. Для устранения неполадок оптических модификации микроскопа: (1) Извлеките объектив, включите лазер NIR и положил тепловой ворс датчик мощности метр на микроскопа для измерения NIR, который не должен быть заблокирован неправильная настройка. (2) установите объектив и положить прозрачное дно кювета, заполнены с 10 мг/мл UCNP раствора на микроскопа. Резкое голубой луч в решении будет рассматриваться, если оптика установлены правильно.
Микроинъекции только может предоставить ограниченное количество клеток для анализа. Скорость впрыска успеха является оператор (или опыт)-зависимых, который является основным ограничением этой методики. Однако существует другой способ обойти его пока. Многие ученые предполагают, что использование инкубации частиц клеток позволяет клетки для поглощения частицы. Однако это не реальный подход. Даже если происходит поглощение сотовой частиц и поглощение суммы достаточно, она будет накапливаться в endosomes/лизосомы, но не в цитозоль. Этот фермент трансдукции конкретного сигнала должен быть расположен в цитозоле, не endosomes, чтобы быть эффективным. Кроме того когда PKA растворяется в идеальный для хранения буфера при 37 ° C, его деятельность не последний после ночи хранения. Фермент стабильность в среде культуры клеток еще короче, и это делает инкубации подход непрактичным.
Это сообщили, что инструментальные установки, микроинъекции и киназы NIR photoactivation протокол должен быть общеприменимых, не только для химически модифицированных киназы, но и для других классов белка или фермента. Кроме того было бы полезно в сотовых исследования где прямое воздействие УФ лучей является нежелательным. Кроме того комплекс клетке bioeffector-UCNP может взаимодействовать с внеклеточного целей, таких как мембранных белков или мембранных рецепторов, избегая проблемы внутриклеточных доставки и делая платформы в естественных условиях использования. После инъекции и.в. клетке белков гормоны или терапевтических белков будет иметь активированные формы bioeffector только в НИР облученных регионах.
Микроинъекции является наиболее важным этапом в этом протоколе. Для точного инъекций Избегайте пузырей во время загрузки иглы. После загрузки, немедленно Установите иглу в инжектор и погрузите кончик иглы в средство для предотвращения кончик иглы от высыхания, что приведет к засорению. Микроинъекции оператор мастерство имеет решающее значение для более высокий тариф успеха инъекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Nano науки и технологии программы Синика и Министерство науки и технологий Тайваня за финансирование (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Ammonium hydroxide (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
