Summary
עבודה זו מתארת פרוטוקול רצף של methyl-cpG-bonding (MBD) של פרוטוקול רצף וציר חישובי, כדי לזהות אזורים עשירים ב- CpG באופן דיפרנציאלי בחולי לוקמיה כרונית של לימפוציטים (CLL).
Abstract
תפקידם של RNAs ארוך noncoding (lncRNAs) בסרטן מגיע לחזית עקב העניין הגובר בהבנת הפונקציות המכניסטיות שלהם במהלך התפתחות סרטן התקדמות. למרות זאת, הרגולציה האפיגנטית העולמית של lncRNAs ורצפים חוזרים בסרטן לא נחקרה היטב, במיוחד בלוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL). מחקר זה מתמקד בגישה ייחודית: הלכידה המבוססת על immunoprecipitation של שברי דנ"א דו-תקועים, מתילציה, באמצעות חלבונים מסוג Methyl-bond (MBD), ואחריהם רצף הדור הבא (MBD-seq). דגימות CLL המשתייכות לשתי קבוצות משנה פרוגנוסטיות (5 IGVH דגימות מוטציה + 5 IGVH דגימות unmutated) שימשו במחקר זה. ניתוח גילה 5,800 hypermethylated ו 12,570 hypomethylated CLL ספציפיים דיפרנציאלי methylated גנים (cllDMGs) לעומת בקרות בריא נורמלי. חשוב לציין, תוצאות אלה זיהו מספר CLL ספציפי, lncRNAs methylated דיפרנציאלי, מחדשאלמנטים חיוניים, וגנים המקודדים חלבונים בעלי ערך פרוגנוסטי פוטנציאלי. עבודה זו מתארת פרוטוקול מפורט עבור צינור MBD-seq ו bioinformatics שפותח עבור ניתוח מקיף של פרופילים מתילציה העולמי באזורים CpG עשיר מאוד באמצעות דגימות החולים CLL. לבסוף, גן מקודד חלבון ו- lncRNA אומתו באמצעות pyrosequencing, שהיא שיטה כמותית מאוד לנתח את רמות מתילציה CpG כדי לאשש את הממצאים מן הפרוטוקול MBD-seq.
Introduction
השימוש בטכניקות רצף הדור הבא לנתח פרופילים מתילציה דנ"א גלובלי כבר יותר ויותר פופולרי בשנים האחרונות. גנום רחב מבחני מתילציה, כולל microarray- ולא מבוססי שיטות microarray, פותחו על בסיס הבאות: המרה bisulfite של DNA גנומי, מתילציה רגיש הגבלת אנזים עיכול, ואת immunoprecipitation של דנ"א מתילציה באמצעות מתיל CpG ספציפי נוגדנים .
מתילציה של דנ"א סוטה היא אחד מסימני ההיכר של לוקמיה ולימפומות, לוקמיה לימפוציטית כוללנית (CLL). מוקדם יותר, כמה קבוצות, כולל שלנו מאופיינים פרופילים מתילציה DNA של קבוצות שונות CLL פרוגנוסטי נורמלי, בריא B- שולטת תאים באמצעות המרה bisulfite של DNA גנומי, ואחריו מיקרו מבוססי מערך שיטות או כל גנום רצף 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. המרה bisulfite של הדנ"א הגנומי מוביל deamination של ציטוזינים ללא שינוי כדי uracil, עוזב את ציטוסינים methylated שונה בגנום. לאחר המרה, מצב מתילציה של ה- DNA יכול להיקבע על ידי הגברה PCR ו רצף בשיטות כמותיות או איכותיות שונות, כגון מיקרו מבוסס מערך מבוסס או כל הגנום bisulfite רצף (WGBS). למרות bisulfite שיטות מבוססות המרה יש יתרונות רבים נמצאים בשימוש נרחב סוגים שונים של סרטן לנתח את רמות מתילציה DNA, יש כמה חסרונות הקשורים בטכניקה זו. רצף WGBS מאפשר רזולוציה בסיסית עם זוג אחד עם כמויות נמוכות יותר של DNA והוא האפשרות המתאימה ביותר לניתוח מספר גדול של דגימות. עם זאת, שיטה זו אינה מבדילה את השינויים בין 5 mC ו 5 רמות hmc בגנום 5 , 6 . בנוסף, שיטות מבוססות microarray לא מציעים להשלים גיתר על המידה של הגנום.
במחקר שנערך לאחרונה במעבדה שלנו 7 , שיטות immunoprecipitation מבוסס, ולא המרה bisulfite, שימשו לזהות מאוד CpG עשיר, דיפרנציאלי methylated אזורים בקנה מידה עולמי בחולים CLL ובריאים בריא שולט. Inmethyl-CpG- מחייב תחום (MBD) הדור הבא רצף (MBD-seq), העשרה של DNA מקוטעת כפול תקועים תלוי במידת מתילציה CpG. שיטה זו יכולה להתגבר על החסרונות של שיטת המרה bisulfite והוא יכול גם לספק כיסוי גנום רחב של מתילציה CpG בצורה בלתי משוחדת ו- PCR עצמאית. בנוסף, בניגוד לשיטות microarray המבוססות על המרה המבוססות על bisulfite, ניתן להשתמש ב- MBD-seq כדי לנתח את מצב המתילציה של אלמנטים חוזרים, כגון אלמנטים גרעיניים ארוכים (LINE), אלמנטים גרעיניים קצרים (SINE), חוזי מסוף ארוכים (LTRS) וכו ' . עם זאת, לעומת שיטות המרה bisulfite,פרוטוקול MBD-seq דורש כמות גדולה יחסית של קלט DNA. כמו כן, איכות רצף קורא את הנתונים תלויים הספציפיות, זיקה, ואיכות של נוגדנים בשימוש.
המחקר הנוכחי מסביר פרוטוקול מפורט MBD-Seq להעשרת דנ"א methylated עבור הדור הבא רצף. היא משתמשת methylated דנ"א העשרה העשרה קיט (המפורטים בטבלה חומרים ), כמו גם צינור חישובית לדמיין ולפרש נתונים רצף מתילציה לזהות CLL ספציפיים היפר ו- hypomethylated אזורים לעומת בקרות בריאים נורמליים. ביסודו של דבר, שיטה זו עושה שימוש ביכולת של MBD של אינטראקציה חלבון MBD2 האדם עם CpG מתיל כדי לחלץ דנ"א מועשר עם CpGs מתיל, וזה ואחריו רצף תפוקה גבוהה של DNA מתיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
האישור המוסרי לאיסוף דגימות ה- CLL הוא בין השנים 2007-05-21, עם מספר הרישום הבא: EPN Gbg dnr 239/07. כל חולי ה- CLL אובחנו בהתאם לקריטריונים המתוקנים לאחרונה 8 , והדגימות נאספו בזמן האבחון. החולים במחקר נכללו במחלקות המטולוגיות שונות במערב שוודיה לאחר קבלת הסכמה בכתב. רק דגימות CLP היקפיות של תאי דם מונונוקלריים (PBMC) עם אחוז גידולים של תאים לויקמיים ≥ 70% נבחרו במחקר זה.
1. הכנות
- לבודד PBMCs עבור חילוץ דנ"א מ CLL ו רגיל, בריא דגימות דם היקפיים באמצעות ערכת בידוד מסחרי (ראה טבלת חומרים ), על פי הוראות היצרן.
- Autoclave 1.5 מ"ל צינורות. להפשיר את כל ריאגנטים בערכת דנ"א methylated מחייב ערכת (ראה את לוח החומרים )/ Li>
- השתמש במים ללא DNase להכין 10 מ"ל של חיץ 1x לשטוף חרוז מן החיץ כביסה 5x המניות המסופקים על ידי ערכת לשטוף חרוזים לדלל את חלבון MBD המסופק על ידי ערכת.
- השג או להכין את הפריטים הבאים מראש: 3 M אצטט נתרן, אתנול מוחלט, ואתנול 70% עבור משקעים דנ"א ( טבלת חומרים ).
2. גנומי DNA הפקה ו Sonication
- השתמש בערכה זמינה דנ"א זמין מסחרית ( טבלת חומרים ) לבודד DNA גנומי מ דגימות PBMC המטופל ו רגיל על פי פרוטוקול של היצרן. לכמת את ה- DNA הגנומי באמצעות ספקטרופוטומטר ב 260 ננומטר.
הערה: קיבולת הדנ"א מיצוי קיבולת הוא 5-6 מיליון תאים, מקסימום; לכן, חשוב להשתמש יותר מעמודה אחת עבור דגימות עם יותר מ -5 מיליון תאים. Elute ה- DNA פעמיים בכמויות שוות בהיקף של 100 μL של 10 מ"מ טריס EDTA (TE) חיץ. חלבון MBD-biotin המשמש מתילערכת כורה עבור רצף MBD לא להיקשר DNA חד גדילי. לכן, חשוב מאוד לשמור את הדנ"א eluted או קפוא או 4 ° C כדי לשמר את אופי כפול תקועים שלה. - לדלל 5 מיקרוגרם של DNA גנומי מדגם זה לסך של 200 μL באמצעות חיץ TE (pH 8), נותן ריכוז סופי של 25 ng / μL.
- בצע sonication בצינורות שתוכננו במיוחד באמצעות sonicator ( לוח חומרים ) עבור סכום כולל של 30 מחזורים (30 על 30 ו - s לכל מחזור, לאחר כל 5 מחזורים, לסובב בקצרה את הצינורות כדי לאסוף את הדגימות לתחתית).
הערה: פעולה זו תייצר DNA מקוטע הנעה בין 150 bp ל 300 bp, שהוא אופטימלי עבור פרוטוקול זה. - בדוק את טווח sonication עבור כל הדגימות לפני שתמשיך לשלב הבא של רצף MBD על ידי הפעלת 1 μL של דגימות DNA מקוטעת סולם גודל DNA על זמינות מסחרית מראש, יצוק מראש 2% agarose ג'ל באמצעות הדנ"א אלקטרופורמציה הדמיה ציוד. Visualזציה tהוא DNA באמצעות transilluminator UV רגיל.
3. הכנת חרוז לפני מחייב עם חלבון MBD-biotin
- Resuspend חרוזים streptavidin מגנטי מן צינור המניות המסופק על ידי ערכת, בעדינות pipetting מעלה ומטה כדי להשיג השעיה הומוגנית. אל מערבולת החרוזים או לאפשר להם להתייבש.
- מקום 50 μL של חרוזים (עבור כל 5 מיקרוגרם של מדגם DNA מקוטעת) ב נפרד, נקי, שכותרתו 1.5 צינורות מ"ל. הוסף 50 μL של חיץ 1x לשטוף את החרוז להגיע לנפח הסופי של μL 100.
הערה: בעת שימוש קטן 0.5 מ"ל פולימראז התגובה שרשרת (PCR) פסים לשטיפת חרוזים, סביב 150-200 μL של חיץ לשטוף לכל צינור משמש, כאמור בפרוטוקול ערכת. עם זאת, במקרה של צינורות 1.5 מ"ל, להוסיף לפחות 250 μL ל 300 μL של חיץ לשטוף לכל צינור לשטוף את החרוז. - מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי למשך דקה אחת כדי לאפשר את כל חרוזים מגנטיים להתרכז על הקיר הפנימי של הצינורמול המגנט. הסר את הנוזל, ללא נגיעה החרוזים, באמצעות פיפטה 200 μL.
- הסר את צינורות מן המעמד המגנטי, להוסיף 250 μL של חיץ 1x לשטוף חרוז, ומערבבים את החרוזים בעדינות עם פיפטה.
- חזור על שלבים 3.3 ו 3.4 לפחות 4-5 פעמים עבור כל דגימות ולבסוף resuspend μL 250 של חיץ 1x לשטוף חרוז. שמור אותם על הקרח.
4. מחייב את חלבון MBD-biotin אל החרוזים שטף
- הוסף 35 μL של חלבון MBD (7 μL עבור 1 מיקרוגרם של דגימת DNA) כדי להפריד צינורות ולהביא את נפח הכולל עד 250 μL באמצעות חיץ 1x לשטוף חרוז.
- הוסף 250 μL של חלבון MBD מדולל μL 250 של חרוזים שטפו ולהשאיר אותם על סיבוב מקצה לקצה בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות.
- לאחר ערבוב חרוזים וחלבון במשך שעה 1, לשטוף את ביוטין חלבון MBD קשור עם חרוזים streptavidin מגנטי.
- מניחים את הצינורות על המעמד המגנטי דקות 1 ולהסיר tהוא נוזלי בלי לגעת החרוזים באמצעות פיפטה. הוסף 250 μL של חיץ לשטוף 1x חרוז ומקום צינורות על סיבוב מיקסר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלב 4.3.1 שתי פעמים יותר ולבסוף resuspend שטף MBD ביוטין חרוזים μL 200 של חיץ 1x לשטוף חרוז, מה שהופך את החרוזים מוכנים לכידת DNA methylated.
הערה: כביסה 2-3 פעמים באופן זה מסיר את כל הרקע מאוגד חרוזים חלבון MBD ומשפר את הכריכה היעילה של חלבון MBD מצמידים חרוזים עם DNA גנומי מקוטעת.
5. מחייב MBD ביוטין חרוזים עם DNA גנומי מקוטע
- ב נקי 1.5 מ"ל DNase ללא צינור, להוסיף 100 μL של חיץ לשטוף 5x חרוז 180 μL של הדנ"א הגנומי מקוטעת (שלב 2.3). תביא את נפח הסופי 500 μL באמצעות מים חינם DNase.
- הוסף 380 μL של מים ללא DNase עד 20 μL הנותרים של הדנ"א הגנומי מקוטעת להקפיא אותם. השתמש דגימות אלה כמו DN קלטפקדים להאיץ אותם מאוחר יותר יחד עם דגימות DNA הסופי methylated eluted (ראה שלב 7.1).
- מניחים את הצינורות המכילים שטף MBD ביוטין חרוזים (שלב 4.4) על מעמד מגנטי דקות 1 ולהסיר את הנוזל מבלי להפריע חרוזים. הוסף 500 μL של DNA גנומי מקוטעת מדולל חיץ לשטוף חרוז.
- אטום את כל הצינורות בחוזקה עם סרט פרפין ולהשאיר אותם בן לילה ב 4 ° C על סיבוב מקצה לקצה לעמוד בסל"ד 8-10.
הערה: DNA ו- biotin חרוז התגובה ניתן לעשות במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר, אבל עוזב אותו ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה יכול לשפר את ההתאוששות של ה- DNA הסופי מתיל.
6. הסרת דנ"א לא מאולתר ומשחררת את דנ"א מתילציה מן החרוזים
- לאחר הדנ"א ו- MBD חרוז התגובה מחייב, מניחים את הצינורות על המדף מגנטי במשך 1 דקות כדי לרכז את כל החרוזים על הקיר הפנימי של הצינור.
- הסר את נוזל supernatant עם פיפטה בלי לגעתאת החרוזים ולשמור את זה דגימת דנ"א מאוחד חלק מדגם על הקרח.
- הוסף 200 μL של חיץ 1x לשטוף את החרוז ואת המקום צינורות על סיבוב לעמוד במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. מניחים את הצינורות על המעמד המגנטי להסיר את הנוזל. חזור על לשטוף עוד פעמיים כדי להסיר את דנ"א נשאר unbound.
- לאחר לשטוף הסופי, להוסיף 200 μL של חיץ elution מלח גבוהה (2,000 מ"מ NaCl), מסופק בערכה כדי elute את ה- DNA.
- מניחים את הצינורות על דוכן מסתובב במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מניחים אותם על מעמד מגנטי דקות 1 ולהשתמש פיפטה בזהירות להעביר את supernatant לצינור חדש, נקי 1.5 מ"ל.
- הוסף 200 μL של חיץ elution מלח גבוהה וחזור על elution ידי סיבוב צינורות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. מוסיפים את elute השני באותה צינור המכיל 200 μL של elute הראשון.
הערה: μL הסופי 400 של DNA eluted סה"כ מוכן עכשיו משקעים אתנול לחלץ מטוהריםDNA מתאים לרצף הדור הבא.
7. אתנול משקעים והעשרה של דנ"א מתיל
- הוסף 1 μL של גליקוגן (20 מיקרוגרם / μL, הכלול בערכה); 40 μL של 3 M אצטט אצטט, pH 5.2; ו 800 μL של אתנול מוחלט קר כקרח ל 400 μL של DNA eluted וגם μL 400 של דגימות DNA קלט מוכן בשלב 5.2.
- מערבבים את הצינורות היטב על ידי vortexing ו דגירה אותם -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- צנטריפוגה צינורות ב 12,000 XG (מהירות מקסימלית) ו 4 ° C. מחק supernatant בזהירות, מבלי להפריע גלולה, להוסיף 500 μL של אתנול 70%, ו מערבולת צינורות.
- צנטריפוגה שוב במהירות מקסימלית במשך 15 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant בזהירות על ידי שימוש pipette.Centrifuge צינורות במהירות מקסימלית במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את אתנול שיורית לחלוטין באמצעות קצה פיפטה.
- האוויר יבש את גלולה במשך 5 דקות בטמפה החדרRature. הוסף 10 μL של מים ללא DNase כדי גלולה דנ"א. המשך לכימות דנ"א methylated (שלב 7.6), MBD רצף (שלב 7.7), וניתוח (סעיפים 8 ו - 9).
- לכמת את הדגימות הסופי התאושש דנ"א methylated באמצעות ערכת מסחרית fluitometric זמין quantitation (ראה את לוח החומרים ), על פי הוראות היצרן.
- הערה: באמצעות פרוטוקול זה, 30-50 ng של ה- DNA הסופי היה התאושש מכל מדגם. דגימות DNA מוכנים לשלוח על קרח יבש עבור הספרייה במורד הזרם ואת התפוקה גבוהה MBD רצף
- ביצוע דנ"א הספריה בנייה גבוהה התפוקה MBD רצף באמצעות פלטפורמה מסחרית ( טבלת חומרים ), כמתואר בהתייחסות 9 .
הערה: עבור בקרת האיכות הראשונית של ה- DNA methylated הסופי, לבצע ההכנות הספרייה באמצעות 50-BP סוף סוף רצף עבור כל הדגימות. לעבד את הנתונים הגולמיים עבור בקרת איכות לאחר רצף, אשל שלב 8.1, וכן לעבד אותו באמצעות גישות ביואינפורמטיקה ושיטות סטטיסטיות, כפי שמתואר להלן (שלבים 8.2-9.6).
8. ביואינפורמטיקה ניתוח שיטה 1: זיהוי CLL הקשורים דיפרנציאלי Methylated אזורים (cllDMRs)
- נקה את הקריאות 49-BP שהתקבלו (FASTQ פורמט) עבור מתאמים באמצעות כלים זמינים בקרת איכות, כגון Trimmomatic 10 או Cutadapt. Crosscheck את האיכות של trimmed קורא באמצעות ערכת כלים FastQC:
Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adapters.fasta: 2: 30: 10 - יישר את הקבצים FASTQ ניקה עם קצר לקרוא גנום aligner Bowtie נגד התייחסות הגנום 11 . ציין את הפרמטרים הבאים:
- אפשר עד שתי אי-התאמות (פרמטר Bowtie: -v 2).
- הגבל את הדיווח שש יישור הטוב ביותר לכל קריאה (פרמטר Bowtie: -M 6) לשלוטעבור מרובה מיפוי קורא.
Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq> SAMPLE.sam
הערה: המר את קבצי SAM שנוצרו עבור דגימות בודדות לאחר היישור ל- BAM באמצעות SAMtools.
תצוגת samtools -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam
- השתמש ניתוח המבוסס על המודל של שיחת צ 'ק (MACS) שיחת שיא על דגימות מיושר (BAM) לחזות מועשר / מתילאטד אזורים מתוך תת הקבוצות CLL 12 .
הערה: השוואה: I השתמש במדגם קלט כקבוצת הביקורת, והן אצל החולה Normal ו- CLL דגימות כקבוצות טיפול. שלב זה הוא לאסוף את כל פסגות שליליות (peaks מועשר קלט / רקע). השוואה II: השתמש בקבוצת הדגימה הרגילה כקבוצת הביקורת וקבוצת הדגימה של CLL כקבוצת הטיפול. השיאים החיוביים המתקבלים הם אזורי היפר-מתיל CLL, ופסגות שליליות הם אזורים hypomethylated CLL על פני אזורים מתיללדלי נורמלי או דיפרנציאלי (DMRs).
Macs14-s SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam - פורמט BAM - g h - הסר השוואה אני פסגות רקע מאזורי מתילציה דיפרנציאלי (DMRs) באמצעות BEDtools 13 .
מחסור במיטות - a <CLL_enriched_regions> -b <Input_enriched_regions> - לחזות את אחוז האלמנטים החוזרים (SINE-Alu, LINE, וכו ' ) מועשר DMRs.
- השתמש fastacmd כדי לחלץ את רצף FASTA של DMRs על ידי הקואורדינטות הכרומוזומליות מן הגנום HG19 התייחסות.
Fastacmd-d HG19_genome.fa -s Chromosome -L התחלה, End -l 50000> DMRs.fasta - השתמש בכלי החוזר RepeatMasker כדי לחזות את אחוז האלמנטים החוזרים המופיעים ברצף ה- FASTA של DMR.
RepeatMasker -gc -gccalc -s-Species האדם -html DMRs.fasta
- השתמש fastacmd כדי לחלץ את רצף FASTA של DMRs על ידי הקואורדינטות הכרומוזומליות מן הגנום HG19 התייחסות.
- ביאורים את DMRs החזוי באמצעות הומר "annotatePeaks.pl" עם זמין Ensembl [PMC4919035]R Gencode [PMID 22955987] ביאור תמליל (חלבון קידוד ותמלילי noncoding).
AnnotatePeaks.pl DMRs.bed <GENOME> -gtf <Ensembl או Gencode GTF>
הערה: מידע זה מספק מידע על התפלגות השיאים על פני אזורים גנטיים שונים ( כלומר, מקדם, אקסון, אינטרון, UTRs 3 ', ו 5' UTRs) ואזורים intergenic. תמלילי או גנים הקשורים DMRs נקראים דיפרנציאלי methylated גנים (DMGs). - השתמש בכלי העשרה עם מסד הנתונים הפונקציונאלי המעודכן או הנוכחי כדי למצוא פונקציות מועשר על ידי CLG DMGs (רק גנים מקודדים חלבונים) 14 .
הערה: ג 'ין סט באשכולות המבוססת על ביאור פונקציונלי (GeneSCF) 14 הוא כלי מבוסס בזמן אמת על ניתוח העשרה תפקודית המשתמשת KEGG מעודכן ו אונטולוגיה אוין כמסמך התייחסות.
9. ביואינפורמטיקה ניתוח שיטה 2: זיהוי CLL הקשורים משמעותית דיףאזורים Methylated בעיקרון (clig sigdmr)
- בצע את השלבים 8.1-8.5 משיטה I (סעיף 8) והשתמש בהערכת דיפרנציאלית המבוססת על קריאה על ידי שימוש בכלים הזמינים, כמפורט בצעדים 9.2 - 9.6, כדי להוסיף רמה נוספת של נתונים לצנרת האנליזה.
- לכמת את מספר הקריאות ממופה פסגות בודדות או DMRs ב רגיל ו CLL דגימות המטופל באמצעות "FeatureCounts" מתוך "Subread" חבילה 15 .
Subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
הערה: ניתן לסנן מסנן איכות מיפוי כדי למנוע כימות של קריאות באיכות גרועה ( לדוגמה, -Q 30). בשלב זה, להכין קבצי SAF עבור DMRs שהתקבלו. לקבלת מידע נוסף על פורמט קובץ SAF, השתמש בקישור זה http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/. - השתמש בטבלת קריאה ספירה של RAW המכילה את מספר הקריאות עבור הפסגות האינדיבידואליות ב- Normal aD CLL חולים קבוצות מדגם קצה כמו קלט 16 .
הערה: השווה בין קבוצות דגימה נורמליות לעומת CLL למטופלים כדי למצוא sigDMRs. לצורך ניתוח העשרה דיפרנציאלית, עקוב אחר המדריך מ- edgeR לקבלת הוראות מפורטות מפורטות (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). - סינון sigDMRs באמצעות שיעור גילוי שווא (רוזוולט) ו לשנות קיפול לשנות חזה על ידי קצה 16 .
- ביאורים של sigDMR החזוי של שימוש הומר "annotatePeaks.pl" עם אננסמבל זמין או הערות Gencode תמליל (חלבונים, קידוד ותמלילי noncoding).
AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <Ensembl או Gencode GTF> -CpG
הערה: מידע זה מספק מידע על התפלגות השיאים על פני אזורים גנטיים שונים ( כלומר, מקדם, אקסון, אינטרון, UTRs 3 ', ו 5' UTRs) ואזורים intergenic. תמלילי או גנים הקשורים siGDMRs נקראים sigDMGs. - השתמש בכלי העשרה עם מסד הנתונים הפונקציונאלי המעודכן או הנוכחי כדי למצוא פונקציות מועשר על ידי CLD sigDMGs (רק חלבון קידוד גנים) 14 .
הערה: GeneSCF, אחד הכלים בזמן אמת עבור ניתוח העשרה תפקודית, משתמש KEGG ו אונטולוגיה גנים כמו מסמכי התייחסות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MBD-seq בוצע לאחרונה על חולי CLL ומתאים, נורמלי, בריא שולטת לזהות CLL ספציפי דיפרנציאלי היפר ו- hypomethylated גנים 7 . הצינור הניסויי והביואינפורמאטי המשמש לניתוח הנתונים הנוצרים מדגימות CLL ודגימות בריאות תקינות מוצג באיור 1 א ' וב -1 ב' . ניתוחים אלה זיהו מספר אזורי CLLDRRR ספציפיים של CLL (CllDMRs), אשר היו היפר / hypomethylated באופן משמעותי מ- IGHV- מוטציה ו- IGHV-unmutated דגימות לעומת דגימות בקרה, עם ערך p <0.00001. איור 2 א מציג את כל cllDMRs המתקבל משני תא B רגיל ו השוואות רגיל PMBC. כל cllDMRs היו ממופה על סוגים שונים של חלבון קידוד ו noncoding גנים, כפי שמוצג באיור 2 ב . חשוב לציין, בניתוח זה, ההשוואות היו perforonsMed באופן עצמאי בין דגימות החולים CLL, עם שני פקדים רגילים שונים, מיון תא B ו- PMBCs. באופן מעניין, הניתוח הביא לחפיפה גדולה של גנים מתמטיים דיפרנציאליים של CLL ספציפיים (cllDmGs, 851 hypermethylated ו- 2,061 hypomethylated) בהשוואה לשליטה רגילה בתאי B ובדגימות בקרה תקינות של PBMC ( איור 2 ג ' ), דבר המצביע על כך ש- cllDMGs אלה יכולים להיות אפשרי גנים החתימה CLL עם תפקידים משמעותיים פתוגנזה המחלה. כדי לחזק את הנתונים נותחו, כמה אתרי CpG הממוקם אחד hypermethylated חלבון קידוד הגן, SKOR1 , ו אחד hypomethylated ארוך noncoding lncRNA, AC012065.7 , אומתו בשיטת pyrosequencing, כמתואר בפרסומים קודמים 7 , 17 , 18 ( איור 3 א ו- B ). איור 4 מראה DNA לאחר פרוטוקול sonication. ה- DNA מקוטעת נע בין 150 ל 300 bp, מה שהופך אותו אידיאלי למטרות רצף.
איור 1: סקירה כללית של זרימת העבודה המשמשת במחקר זה. נתון זה, המתקבל בפרסום האחרון שלנו 7 , מראה את העיצוב של הניתוח הכולל המשמש לזיהוי האזורים מתילציה דיפרנציאלי (DMRs) בדגימות החולה הלוקמיה כרונית (CLL). ( א ) עיצוב ניסיוני של העשרת MBD מבוסס של דנ"א מתיל. ( ב ) צינור ניתוח ביואינפורמטיקה המשמש לזיהוי CLL ספציפיים דיפרנציאלי methylated אזורים (cllDMRs). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
.within-page = "1"> 
איור 2: Hypermethylated ו hypomethylated cllDMRs ו cllDMGs של דגימות CLL בהשוואה בהשוואה רגיל, בריא, ממוין תאים B 7 . ( א ) כל לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) - אזורים דיפרנציאליים מתילציה דיפרנציאלית עם ערכי p מובהקים (<0.00001) המתקבל מהשוואת דגימות CLH של מוטציות IGHV ובלתי ממוינות לתאי B רגילים ממוינים (פאנל עליון) ודגימות PBMC נורמליות (הלוח התחתון). העשרה המוצגת heatmap היו בתוך חלון 3 ± Kb מאזור מתילציה דיפרנציאלי (DMRs). ( ב ) דיאגרמת Venn מראה את החפיפה של גנים מתיליים דיפרנציאליים של CLL (cllDmGs, hypermethylated ו hypomethylated) בין קבוצות IGHV-mutated ו- IGHV. תרשים העוגה מייצג את אחוז הגנים השייכים לסיווג שונה, כגון קידוד חלבונים, RNA ארוך noncoding (lncRNA), pseudogenes, antisense, ו- RNAs אחרים ללא קידוד. ( ג ) דיאגרמת Venn המציגה את החפיפה בין גנים מתיליים דיפרנציאליים (IGHV-mutated ו- IGHV-Unmutated Prognostic group) בין השוואות B-cell ו- PBMC. הפאנל השמאלי של דיאגרמת ון מראה את חפיפה עבור גנים hypermethylated ואת הפאנל הימני עבור גנים hypomethylated. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: אימות של מתילציה דנ"א מצב עבור CpG בודדים אתרים על גנים היעד נבחרים באופן משמעותי דיפרנציאלי Methylated. נתונים Pyrosquencing עבור כימות של אחוז מתילציה דנ"א עבור שני גנים נבחרים באמצעות לימפוציטים כרוניים עצמאייםלוקמיה לוקאלית (CLL) המכילה 54 דגימות ו- 6 דגימות תא B, נורמליות, בריאים בהתאמה. ( א ) boxplots מייצגים את אחוז רמות מתילציה עבור 3 אתרים בודדים CpG של הגן hypermethylated SKOR1 באמצעות pyrosequencing. ( ב ) boxplot מראה את מידת המתילציה עבור 5 אתרים בודדים CpG של הגן hypomethylated AC012065.7 באמצעות pyrosequencing. הקופסאות מציינות את הטווח הבין-רבעוני (25-75%), ואילו הקו האופקי הפנימי מציין את הערך החציוני. השפם מייצג את ערכי המינימום והמקסימום. ערך p המקביל לדרגה של מתילציה דיפרנציאלית של דגימות CLL על פני תאי B נורמליים מוצגים boxplots עבור כל אתר CpG הפרט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MBD-seq הוא חסכוני, immunoprecipitation מבוסס טכניקה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד דפוסי מתילציה עם כיסוי גנום רחב כולו. הן MeDIP seq (immunoprecipitation DNA methylated ואחריו רצף) ו- MBD-seq התוצאה העשרה של CpG עשיר DNA methylated. עם זאת, MBD-seq מראה זיקה יותר כלפי מחייב מאוד CpG עשירים אזורים בהשוואה ל MeDIP 19 . באמצעות ערכת העשרה של מתיל, ניתן לחלק את הדנ"א לאזורים עשירים ב- CpG ו- CpG נמוך על-ידי השתלת DNA עם מאגרים של מלח גבוה ומלח נמוך, בהתאמה. בחקירה זו, רק elution חלק אחד בוצע ללכוד מאוד מועשר CpG עשיר באזורים המכסים את רוב האיים CpG.
MBD-seq יכול להיות חלופה רבת עוצמה WGBS, אשר משמש בדרך כלל CLL וחקר לוקמיה אחרים. למרות MBD-seq דורש כמויות גבוהות יחסית של ה- DNA קלט לעומת bisulfiteשיטות המבוססות על המרה, הוא מאפשר את החקירה של שינויים מתילציה גלובלית ספציפיים רק עבור 5 שינויים mC, ללא כל הגברה PCR הטיה שנוצרה לאחר ההמרה. לכן, MBD-seq היא שיטה אידיאלית לטיפול ב- cllDMGs, שעשויים להיות גנים ייחודיים המבוססים על אפיגנטים המבוססים על epigenetic עם ערך פרוגנוסטי.
הגורמים המכריעים לביצוע שיטה זו הם האיכות ואת טווח sonication של ה- DNA מקוטעת בשימוש לפני התגובה מחייב. כל הדגימות הראו טווחי שברים קצרים יותר, בין 150 ל 300 bp ( איור 4 ), וכתוצאה מכך תוצאות רצף באיכות טובה, עם סביב 25-33 מיליון ייחודי קורא לכל מיפוי מדגם לגנום לאחר סינון נתונים וניקיון.
לבסוף, מצב המתילציה של CllDMGs היפר ו- hypomethylated אומת עבור מספר גנים בשיטת pyrosequencing בקבוצות מדגם עצמאיות. שיטה זו נותנת את התפיסהמתילציה של דנ"א מתילציה, בהתאם היחס בין C ל- T על אתרים בודדים CpG מבוסס על כמות C ו- T משולבים במהלך הרחבה רצף. Hypermethylated cllDMGs הראה אחוז גבוה של מתילציה בדגימות CLL בהשוואה לדגימות הרגילות. כמו כן, clomDmG hypomethylated הראו את ההפך. נתונים Pyrosequencing עבור שני cllDMGs מוצג באיור 3 .
בהשוואה לשיטות מבוססות-מערך, שיטה זו מאפשרת בדיקה רחבה יותר של רצפים על פני הגנום, כולל אזורים שהודפסו קודם לכן על אזורי קידוד חלבונים ורצפים שאינם מסומנים על פני אלמנטים חוזרים ונשנים ו- lncRNA. לפיכך, גישה זו על חולי CLL זיהה מספר cllDMGs חדש פורש lncRNAs ואלמנטים חוזרים. מאז חקירות אלה לא בוצעו בעבר בדגימות החולים CLL, מחקר זה משמש משאב יקר ערך לזיהוי CLL הקשורות אזורים מתילציה דיפרנציאלי בקבוצות משנה שונות. CllDMGs אלה ישמשו ביומרקרים חדשים ויעדים לטיפול תרופתי אפיגנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מועצת המחקר השוודי, האגודה השבדית לסרטן, קרן קנוט ואליס ולנברג (KAW), ו FU VästraGötalandsregionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
- Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
- Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
- Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
- Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
- De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
- Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
- Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).
