Summary
이 연구는 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 환자에서 차별적으로 메틸화 된 CpG가 풍부한 부위를 확인하기 위해 최적화 된 메틸 -CpG 결합 도메인 (MBD) 시퀀싱 프로토콜과 계산 파이프 라인을 설명합니다.
Abstract
암에서의 긴 비 암호화 RNAs (lncRNAs)의 역할은 암 발달 및 진행 동안 그들의 기계적 기능을 이해하는데 점점 더 많은 관심을 가지고 있기 때문에 최전선에 서있다. 그럼에도 불구하고, lncRNA 및 암에서의 반복 서열에 대한 전 세계적 후성 조절은 특히 만성 림프 구성 백혈병 (CLL)에서 잘 조사되지 않았다. 이 연구는 독특한 접근 방식에 초점을 맞추고 있습니다 : 메틸 결합 도메인 (MBD) 단백질을 사용한 이중 가닥 메틸화 DNA 단편의 면역 침전 기반 포획, 차세대 시퀀싱 (MBD-seq). 2 개의 예후 소그룹에 속하는 CLL 환자 샘플 (5 개의 IGVH 돌연변이 샘플 + 5 개의 IGVH 돌연변이 샘플)이이 연구에 사용되었다. 분석 결과 정상 건강한 대조군에 비해 5,800 개의과 메틸화 및 12,570 개의 저 메틸화 CLL 특이 적 차별화 메틸화 유전자 (cllDMGs)가 밝혀졌습니다. 중요하게,이 결과는 몇몇 CLL 특이적이고 차별적으로 메틸화 된 lncRNA를 확인했다.소수성 요소 및 잠재적 인 예후 가치를 지닌 단백질 코딩 유전자를 포함한다. 이 연구는 CLL 환자 샘플을 사용하여 고도의 CpG가 풍부한 지역에서 전 세계적으로 메틸화 프로필을 포괄적으로 분석하기 위해 개발 된 MBD-seq 및 생물 정보학 파이프 라인에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 마지막으로, 코딩 코딩 유전자와 lncRNA는 파이로 시퀀싱 (pyrosequencing)을 사용하여 검증되었으며, 이는 MBD-seq 프로토콜의 결과를 뒷받침하기 위해 CpG 메틸화 수준을 분석하는 고도의 정량 방법이다.
Introduction
최근 전 세계적 DNA 메틸화 프로파일을 분석하기위한 차세대 시퀀싱 기술의 사용이 증가하고 있습니다. 게놈 DNA의 bisulfite 변환, 메틸화 민감성 제한 효소 소화 및 메틸 CpG 특이 적 항체를 이용한 메틸화 DNA의 면역 침전 (immunoprecipitation)을 바탕으로 마이크로 어레이 및 비 마이크로 어레이 기반의 방법을 포함한 게놈 차원의 메틸화 분석법을 개발했다. .
불규칙한 DNA 메틸화는 만성 림프 성 백혈병 (CLL)을 비롯한 백혈병 및 림프종의 특징 중 하나입니다. 이전에, 우리를 포함한 여러 그룹은 게놈 DNA의 bisulfite 전환을 사용하여 다른 CLL 예후 소그룹과 정상, 건강한 B 세포 컨트롤의 DNA 메틸화 프로파일을 특징으로했으며, 마이크로 어레이 기반 방법 또는 전체 게놈 시퀀싱 1 , 2 , 3 , <sup class = "xref"> 4. 게놈 DNA의 바이 설 파이트 전환은 변형되지 않은 시토신의 우라실로의 탈아 민화를 가져오고 변형 된 메틸화 시토신을 게놈에 남긴다. 일단 변환되면, DNA의 메틸화 상태는 마이크로 어레이 기반 또는 전체 게놈 바이 설 파이트 시퀀싱 (WGBS)과 같은 다른 양적 또는 질적 방법을 사용하여 PCR 증폭 및 시퀀싱에 의해 결정될 수있다. bisulfite conversion-based 방법은 많은 장점이 있으며 DNA 메틸화 수준을 분석하기 위해 다양한 암 유형에서 널리 사용되지만이 방법과 관련된 몇 가지 단점이 있습니다. WGBS sequencing은 적은 양의 DNA로 single-base-pair resolution을 가능하게하며 많은 수의 시료를 분석하는데 가장 적합한 옵션입니다. 그러나,이 방법은 게놈 5 , 6 에서 5mC와 5hmC 수준 사이의 변형을 구별하는데 실패합니다. 또한, 마이크로 어레이 기반의 방법은 완전한 c게놈의 과잉.
우리 연구실 7 의 최근 연구에서, 바이 설 파이트 전환보다는 면역 침전 기반 방법을 사용하여 CLL 환자 및 정상적인 건강한 대조군에서 전 세계적으로 매우 높은 CpG가 풍부한 차별적으로 메틸화 된 지역을 확인했습니다. Inmethyl-CpG-binding domain (MBD) 차세대 염기 서열 분석 (MBD-seq)은 CpG 메틸화 정도에 따라 다르다. 이 방법은 bisulfite 전환 방법의 단점을 극복 할 수 있으며 또한 편파 및 PCR 독립적 인 방식으로 CpG 메틸화의 게놈 범위를 제공 할 수 있습니다. 또한 bisulfite conversion-based microarray 방법과 달리 MBD-seq는 long interspersed nuclear elements (LINEs), 짧은 interspersed nuclear elements (SINEs), long terminal repeats (LTRS)와 같은 반복적 인 요소의 메틸화 상태를 분석하는데 사용될 수있다. 등 . 그러나, 바이 설 파이트 전환 방법과 비교하여,MBD-seq 프로토콜은 비교적 많은 양의 입력 DNA를 필요로합니다. 또한 시퀀싱의 품질 및 데이터는 사용 된 항체의 특이성, 친 화성 및 품질에 따라 달라집니다.
현재의 연구는 차세대 시퀀싱을 위해 메틸화 된 DNA를 풍부하게하기위한 상세한 MBD-seq 프로토콜을 설명합니다. 그것은 상업적으로 메틸화 된 DNA 결합 농축 키트 ( Materials Table 에 열거 됨)와 정상적인 건강한 대조군에 비해 CLL 특이 적 하이퍼 및 저 메틸화 부위를 확인하기 위해 메틸화 시퀀싱 데이터를 시각화하고 해석하는 전산 파이프 라인을 사용합니다. 기본적으로이 방법은 methylated CpGs가 풍부한 DNA를 추출하기 위해 methylated CpGs와 인간 MBD2 단백질 상호 작용의 MBD 능력을 이용합니다. 그리고 메틸화 DNA의 높은 처리량 시퀀싱이 뒤 따릅니다.
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Protocol
CLL 샘플 수집에 대한 윤리적 승인은 2007-05-21에서 다음 등록 번호와 함께 제공됩니다 : EPN Gbg dnr 239/07. 최근 개정 기준 8 에 따라 모든 CLL 환자를 진단하고 진단 당시 샘플을 수집했습니다. 연구에 참여한 환자들은 서면 동의를 얻은 후에 스웨덴 서부 지역의 여러 혈액학 부서에 포함되었습니다. 이 연구에서 백혈병 세포의 종양 백분율이 70 % 이상인 CLL 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플 만이 연구에서 선택되었다.
1. 준비 사항
- 제조 업체의 지침에 따라 상용 격리 키트 ( 재료 표 참조)를 사용하여 CLL 및 정상, 건강한 말초 혈액 샘플에서 DNA 추출을위한 PBMC를 분리합니다.
- 오토 클레이브 1.5 mL 튜브. 메틸화 DNA 결합 키트의 모든 시약을 해동하십시오 ( 재료 표 참조). </ li>
- DNase가없는 물을 사용하여 키트가 제공하는 5x 스톡 세척 완충액에서 1x 비드 세척 완충액을 준비하고 키트에서 제공하는 MBD 단백질을 희석하고 묽게하십시오.
- 다음 물품을 사전에 준비하거나 준비하십시오 : 3M 초산 나트륨, 절대 에탄올 및 DNA 침전을위한 70 % 에탄올 ( 재료 표 ).
2. 게놈 DNA 추출 및 Sonication
- 상업적으로 이용 가능한 DNA 추출 키트 ( 재료 표 )를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 환자 및 정상 PBMC 샘플의 게놈 DNA를 분리합니다. 260 nm에서 분광 광도계를 사용하여 게놈 DNA를 정량하십시오.
참고 : DNA 추출 컬럼 용량은 5-6 백만 셀, 최대; 따라서 5 백만 개가 넘는 셀을 가진 샘플에 대해 하나 이상의 컬럼을 사용하는 것이 중요합니다. 10 mM Tris EDTA (TE) 완충액 100 μL를 합하여 같은 양으로 DNA를 두 번 뺍니다. 메틸에 사용 된 MBD- 바이오틴 단백질MBD 시퀀싱을위한 광 키트는 단일 가닥 DNA에 결합하지 않습니다. 따라서 용리 된 DNA를 동결하거나 4 ℃에서 2 중 좌초 성을 유지하는 것이 매우 중요합니다. - 각 샘플에서 5 μg의 게놈 DNA를 TE 완충액 (pH 8)을 사용하여 총 200 μL로 희석하여 25 ng / μL의 최종 농도를줍니다.
- 총 30 사이클 (사이클 당 30 초, 30 초 꺼짐, 매 5 사이클 후, 시료를 수집하기 위해 튜브를 짧게 회전) 초음파 분석기 ( 재료 표 )를 사용하여 특수 설계된 튜브에서 초음파 처리를 수행하십시오.
참고 : 이것은 150 bp ~ 300 bp 범위의 단편 DNA를 생성하며,이 프로토콜에 최적입니다. - DNA 전기 영동 이미징 장비를 사용하여 상업적으로 이용 가능한 프리 캐스트 2 % 아가로 오스 겔에서 단편 DNA 샘플 1 μL 및 DNA 크기 사다리를 실행하여 MBD 시퀀싱의 다음 단계로 진행하기 전에 모든 샘플의 초음파 처리 범위를 확인하십시오. 시각화그는 표준 UV transilluminator를 사용하는 DNA입니다.
3. MBD - 바이오틴 단백질과 바인딩하기 전에 비드 준비
- 키트에서 제공하는 주식 튜브에서 마그네틱 streptavidin 구슬을 Resuspend 부드럽게 똑같은 현탁액을 얻기 위해 위아래로 pipetting. 구슬을 와동 시키거나 건조시키지 마십시오.
- 분리 된 깨끗한 1.5 ML 튜브에 구슬 50 μL (조각 DNA 샘플 각 5 μg에 대한)를 놓으십시오. 100 μL의 최종 볼륨에 도달하는 1x 비드 세척 버퍼 50 μL를 추가합니다.
참고 : 비드 세척을위한 작은 0.5 ML 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 줄무늬를 사용하는 경우, 키트 프로토콜에서 언급 한 것처럼 튜브 당 약 150-200 μL의 세척 완충액을 사용합니다. 그러나, 1.5 mL 튜브의 경우, 비드 세척을 위해 튜브 당 적어도 300 ㎕의 세척 완충액을 250 ㎕ 씩 넣으십시오. - 모든 자성 비드가 튜브의 내벽에 집중하도록 1 분 동안 튜브를 자성 스탠드 위에 놓습니다자석을 마주보고있다. 200 μL 피펫을 사용하여 구슬을 건드리지 않고 액체를 제거하십시오.
- 자성 스탠드에서 튜브를 제거하고, 1x 비드 세척 버퍼 250 μL를 추가하고 피펫으로 부드럽게 비즈를 섞는다.
- 모든 시료에 대해 3.3 ~ 3.4 단계를 반복하고 1x 비드 세척 완충액 250 μL에 최종적으로 resuspend하십시오. 얼음 위에 보관하십시오.
4. MBD - biotin 단백질을 세척 된 비드에 바인딩
- 튜브를 분리하기 위해 MBD 단백질 35 μL (DNA 샘플 1 μg에 대해 7 μL)를 추가하고 1x 비드 세척 버퍼를 사용하여 총 부피를 최대 250 μL로 가져옵니다.
- 씻은 구슬의 250 μL에 희석 MBD 단백질의 250 μL를 추가하고 1 시간 상온에서 종단 간 회전에 그들을 남겨주세요.
- 비즈와 단백질을 1 시간 동안 혼합 한 후 자기 streptavidin beads로 바인딩 된 MBD 단백질 바이오틴을 씻는다.
- 튜브를 자성 스탠드 위에 1 분 동안 놓고 T그는 피펫을 사용하여 구슬을 만지지 않고 액체. 1x 비드 세척 버퍼 250 μL를 추가하고 실온에서 5 분 동안 회전 믹서에 튜브를 놓습니다.
- 다시 4.3.1 단계를 두 번 반복하고 마지막으로 1x 비드 세척 버퍼 200 μL에 씻어 MBD - 비오틴 구슬을 resuspend, 구슬을 methylated DNA 캡처 준비.
참고 : 이러한 방식으로 2-3 번 세척하면 백그라운드 MBD 단백질 비드가 모두 제거되고 조각난 게놈 DNA가있는 MBD 단백질 결합 비즈가 효율적으로 결합됩니다.
5. 조각난 게놈 DNA와 MBD - biotin 구슬 바인딩
- 깨끗한 1.5 ML DNase - 무료 튜브에 5x 구슬 세척 버퍼와 단편 게놈 DNA (단계 2.3) 180 μL의 100 μL를 추가합니다. DNase가없는 물을 사용하여 최종 부피를 500 μL로 가져옵니다.
- 조각난 게놈 DNA의 나머지 20 μL에 DNase가없는 물 380 μL를 넣고 동결시킵니다. 이 샘플을 입력 DN으로 사용하십시오.A는 최종 용출 된 메틸화 DNA 샘플과 함께 나중에 조절하고 침전시킨다 (단계 7.1 참조).
- 씻은 MBD - 비오틴 비즈 (단계 4.4)가 들어있는 튜브를 자성 스탠드 위에 1 분 동안 놓고 비즈를 방해하지 않고 액체를 제거합니다. 비드 세척 버퍼로 희석 된 단편 게놈 DNA 500 μL를 첨가한다.
- 파라핀 필름으로 모든 튜브를 단단히 밀봉하고 4 ° C에서 밤새 방치하십시오. 8-10 rpm의 엔드 투 엔드 회전 스탠드.
참고 : DNA와 biotin-bead 결합 반응은 실온에서 1 시간 동안 수행 할 수 있지만 밤새 4 ℃에서 방치하면 최종 메틸화 된 DNA의 회수율을 향상시킬 수 있습니다.
6. 비 결합 DNA 제거 및 비드로부터 메틸화 DNA 용출
- DNA와 MBD - 비드 바인딩 반응 후 튜브의 내부 벽에 모든 구슬을 집중 1 분 동안 자기 랙에 튜브를 놓습니다.
- 만지지 않고 상등액을 피펫으로 제거한다.구슬은 얼음에 바인딩되지 않은 DNA 샘플 분수를 저장합니다.
- 비즈에 1x 비드 세척 버퍼 200 μL를 추가하고 상온에서 3 분 동안 회전 스탠드에 튜브를 놓습니다. 튜브를 자석 스탠드 위에 놓고 액체를 제거합니다. 잔여의 결합되지 않은 DNA를 제거하기 위해 또 다른 두 번 씻으십시오.
- 최종 세척 후 DNA를 용출하기 위해 키트에 제공된 고염 용출 완충액 (2,000 mM NaCl) 200 μL를 첨가하십시오.
- 튜브를 회전 스탠드 위에 실온에서 15 분 동안 놓습니다. 자성 스탠드 위에 1 분 동안 올려 놓고 신중한 1.5 mL 튜브에 뜨는 것을 조심스럽게 피펫으로 옮깁니다.
- 높은 소금 용출 버퍼 200 μL를 추가하고 15 분 동안 실온에서 튜브를 회전하여 용출을 반복하십시오. 첫 번째 용리 200 μL를 포함하는 동일한 튜브에 두 번째 용리를 추가합니다.
참고 : 총 용출 된 DNA의 최종 400 μL는 이제 에탄올 침전으로 정제 된차세대 시퀀싱에 적합한 DNA.
7. 에탄올 침전 및 메틸화 된 DNA의 농축
- 글리코겐 (20 μg / μL; 키트에 포함) 1 μL를 넣습니다. 3M 아세트산 나트륨 (pH 5.2) 40 μL; 400 μL의 용리 된 DNA에 800 μL의 얼음처럼 차가운 절대 에탄올을 넣고 5.2 단계에서 준비한 400 μL의 입력 DNA 샘플에 첨가합니다.
- vortexing하여 잘 혼합하고 -80 ° C에서 밤새 배양하십시오.
- 튜브를 12,000 xg (최대 속도) 및 4 ° C에서 원심 분리하십시오. 펠렛을 방해하지 않고 조심스럽게 상등액을 버리고 70 % 에탄올 500 μL를 넣고 튜브를 와동시킨다.
- 4 15 분 최대 속도로 다시 원심 분리기 ° C와 피펫 팁을 사용하여 잔여 에탄올을 완전히 제거 실온에서 1 분 최대 속도로 튜브를 pipette.Centrifuge 튜브를 신중하게 사용하여 뜨는을 제거합니다.
- 실내 온도에서 5 분 동안 펠렛을 공기 건조시킨다.성격. DNase가없는 물 10 μL를 DNA 펠렛에 넣으십시오. 메틸화 된 DNA 정량 (단계 7.6), MBD 시퀀싱 (단계 7.7) 및 분석 (제 8 및 9 절)으로 진행하십시오.
- 상업적으로 이용 가능한 형광 계량 키트 ( Materials Table 참조)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 최종 회수 된 메틸화 DNA 샘플을 정량하십시오.
- 참고 :이 프로토콜을 사용하여 각 샘플에서 30-50 ng의 최종 DNA를 회수했습니다. DNA 샘플은 다운 스트림 라이브러리 구축 및 높은 처리량 MBD 시퀀싱을 위해 드라이 아이스로 보낼 준비가되었습니다.
- 참고 문헌 9 에서 설명한대로 상업용 플랫폼 ( Materials Table )을 사용하여 DNA 라이브러리 구성 및 높은 처리량 MBD 시퀀싱을 수행합니다.
참고 : 최종 메틸화 된 DNA의 초기 품질 관리를 위해 모든 샘플에 대해 50-bp 쌍단 시퀀싱을 사용하여 라이브러리 준비를 수행하십시오. 포스트 시퀀싱 품질 관리를위한 원시 데이터 처리,단계 8.1에서 정교하고 아래에 설명 된대로 생물 정보학 접근법 및 통계 방법을 사용하여 추가로 처리합니다 (8.2-9.6 단계).
8. 생물 정보학 분석 방법 1 : CLL과 관련된 차별화 된 메틸화 지역 (cllDMRs)
- Trimmomatic 10 또는 Cutadapt와 같은 사용 가능한 품질 관리 도구를 사용하여 얻은 49-bp 판독 값 (FASTQ 형식)을 정리하십시오. FastQC 툴킷을 사용하여 트리밍 된 읽기의 품질을 교차 검사하십시오.
java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP : adapters.fasta : 2 : 30 : 10 - 세척 된 FASTQ 파일을 짧은 읽기 게놈 정렬 자 Bowtie와 기준 게놈 11 에 맞 춥니 다. 다음과 같이 매개 변수를 지정하십시오.
- 두 가지 불일치를 허용합니다 (Bowtie 매개 변수 : -v 2).
- 보고 당 최대 6 개의 정렬 (Bowtie 매개 변수 : -m 6)으로 제어하여 제어다중 매핑 읽기.
bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq> SAMPLE.sam
참고 : SAMtools를 사용하여 정렬 후 개별 샘플에 대해 생성 된 SAM 파일을 BAM으로 변환하십시오.
samtools보기 -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam
- 정렬 된 샘플 (BAM)에 대한 ChIP-Seq (MACS) 피크 발신자의 모델 기반 분석을 사용하여 CLL 하위 그룹의 농축 / 메틸화 지역을 예측하십시오.
참고 : 비교 I : 대조군으로 Input 샘플을 사용하고 치료 그룹으로 Normal 및 CLL 환자 샘플을 사용하십시오. 이 단계는 모든 음의 피크 (입력 / 배경이 풍부한 피크)를 수집하는 것입니다. 비교 II : 대조군으로 정상 샘플 그룹을 사용하고 치료 그룹으로 CLL 환자 샘플 그룹을 사용하십시오. 획득 된 양성 피크는 CLL과 메틸화 부위이며, 음성 피크는 정상 또는 차별적으로 메틸화 된 부위 (DMR)보다 CLL 저 메틸화 부위이다.
macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs - 비교 제거 I BEDtools를 사용하여 차별적으로 메틸화 된 영역 (DMR)의 피크를 배경으로 삼습니다.
bedtools subtract -a <CLL_enriched_regions> -b <Input_enriched_regions> - DMR이 풍부한 반복 요소 (SINE-Alu, LINE 등 )의 비율을 예측합니다.
- fastacmd를 사용하여 참조 게놈 HG19에서 염색체 좌표로 DMR의 FASTA 시퀀스를 추출하십시오.
fastacmd -d HG19_genome.fa -s 염색체 -L 시작, 끝 -l50000> DMRs.fasta - RepeatMasker 명령 줄 도구를 사용하여 DMR의 FASTA 시퀀스에있는 반복 요소의 비율을 예측합니다.
RepeatMasker -gc -gccalc -s -species 인간 -html DMRs.fasta
- fastacmd를 사용하여 참조 게놈 HG19에서 염색체 좌표로 DMR의 FASTA 시퀀스를 추출하십시오.
- Homer "annotatePeaks.pl"을 사용하여 예상되는 DMR에 사용 가능한 Ensembl [PMC4919035] o 주석을 달기r Gencode [PMID 22955987] transcript 주석 (단백질 코딩 및 비 코딩 성적서).
annotatePeaks.pl DMRs.bed <GENOME> -gtf <Ensembl 또는 Gencode GTF>
참고 : 이것은 다른 유전자 영역 ( 즉, 프로모터, 엑손, 인트론, 3'UTR 및 5'UTR) 및 유전자 간 영역에 걸쳐 피크 분포에 대한 정보를 제공합니다. DMR과 관련된 성적표 또는 유전자를 차별적으로 메틸화 된 유전자 (DMG)라고합니다. - CLL DMG (단백질 코딩 유전자 만)가 강화한 기능을 찾기 위해 업데이트 된 기능 데이터베이스와 함께 강화 도구를 사용하십시오.
참고 : Functional Annotation (GeneSCF) 14 를 기반으로 한 Gene Set Clustering은 업데이트 된 KEGG 및 Gene Ontology를 참조 데이터베이스로 사용하는 기능 강화 분석을위한 실시간 기반 도구입니다.
9. 생물 정보학 분석 방법 2 : CLL 연관 확인지역적으로 메틸화 된 지역 (cll sigDMR 's)
- 방법 I (섹션 8)의 8.1-8.5 단계를 따르고 9.2 - 9.6 단계에서 정한 사용 가능한 도구를 활용하여 분석 카운트 기반 차등 농축 분석을 사용하여 분석 파이프 라인에 하나 이상의 통계 수준을 추가하십시오.
- "Subread"패키지의 "featureCounts"를 사용하여 Normal 및 CLL 환자 샘플의 개별 봉우리 또는 DMR에 매핑 된 판독 횟수를 정량화합니다 15 .
subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
참고 : 매핑 품질 필터를 도입하여 품질이 나쁜 읽기 ( 예 : -Q 30)를 정량화하지 않도록 할 수 있습니다. 이 단계에서는 획득 한 DMR에 대한 SAF 파일을 준비하십시오. SAF 파일 형식에 대한 자세한 내용은 http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/ 링크를 사용하십시오. - Normal 피크의 개별 피크에 대한 읽기 수를 포함하는 RAW 읽기 수 테이블을 사용하십시오.d edgeR에있는 환자 샘플 그룹을 입력으로 사용하십시오 16 .
참고 : 정상 대 CLL 환자 샘플 그룹을 비교하여 sigDMR을 찾습니다. 차별 농축 분석을 위해 자세한 단계별 지침 (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf)을 보려면 edgeR의 가이드를 따르십시오. - EdgeR에 의해 예측 된 FDR (false discovery rate) 및 로그 배수 변경을 사용하여 sigDMR을 필터링합니다.
- 예상되는 sigDMR에 Homer "annotatePeaks.pl"을 사용하여 사용 가능한 Ensembl 또는 Gencode transcript 주석 (단백질 코딩 및 비 코딩 기록)을 주석으로 작성합니다.
annotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <Ensembl 또는 Gencode GTF> -CpG
참고 : 이것은 다른 유전자 영역 ( 즉, 프로모터, 엑손, 인트론, 3'UTR 및 5'UTR) 및 유전자 간 영역에 걸쳐 피크 분포에 대한 정보를 제공합니다. si와 관련된 성적표 또는 유전자gDMR을 sigDMG라고합니다. - CLL sigDMG (단백질 코딩 유전자 만)가 강화 된 기능을 찾기 위해 업데이트 된 또는 현재 기능 데이터베이스와 함께 농축 도구를 사용하십시오.
참고 : 기능 강화 분석을위한 실시간 도구 중 하나 인 GeneSCF는 KEGG 및 Gene Ontology를 참조 데이터베이스로 사용합니다.
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Representative Results
MBD-seq는 최근 CLL 환자와 일치하고 정상적인 건강한 대조군에서 CLL 특이 적으로 차별화 된 과민성 및 저 메틸화 유전자를 확인하기 위해 수행되었다. CLL과 정상 건강한 샘플에서 생성 된 데이터를 분석하는 데 사용되는 실험 및 생물 정보 파이프 라인은 그림 1A 및 1B 에 나와 있습니다. 이 분석은 IGHV- 돌연변이 및 IGHV- 돌연변이 된 샘플로부터 유의 적으로과 / 저 메틸화 된 몇몇 CLL 특이 적 차별 메틸화 부위 (cllDMRs)를 대조 샘플과 비교하여 p 값 <0.00001로 확인 하였다. 그림 2A 는 정상 B 세포와 정상 PMBC 비교에서 얻은 모든 cllDMRs를 보여줍니다. 모든 cllDMR은 그림 2B 와 같이 단백질 코딩 및 비 코딩 유전자의 다른 클래스에 매핑되었습니다. 중요하게,이 분석에서, 비교는 perfor두 개의 다른 정상 대조군, 정렬 된 B 세포 및 PMBC를 가진 CLL 환자 샘플간에 독립적으로 독립적으로 진행되었다. 흥미롭게도이 분석 결과 정상 B 세포 대조군과 정상 PBMC 대조군 샘플 ( 그림 2C )과 비교했을 때 일반적인 CLL 특이 적 차별화 메틸화 유전자 (cllDMGs, 851 hypermethylated 및 2,061 hypomethylated)가 크게 겹쳐서 cllDMG가 질병 병인에 중요한 역할을하는 가능한 CLL 시그니처 유전자. 분석 된 데이터를 강화하기 위해, 하나의과 메틸화 단백질 코딩 유전자 인 SKOR1 에 위치한 여러 CpG 사이트와 하나의 hypomethylated long noncoding lncRNA 인 AC012065.7을 이전의 출판물 7 , 17 , 18 에서 설명한대로 파이로 시퀀싱 방법을 사용하여 검증했다 ( 그림 3A 및 B ). 그림 4 는 전단 DNA를 보여줍니다sonication 프로토콜 후. 단편화 된 DNA의 범위는 150 ~ 300 bp이며 시퀀싱 목적에 이상적입니다.
그림 1 : 본 연구에서 사용 된 작업 흐름의 개요. 최근 발표 된 7 에서 얻은이 수치는 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 환자 샘플에서 차별적으로 메틸화 된 부위 (DMR)를 확인하는 데 사용되는 전반적인 분석 디자인을 보여줍니다. ( a ) 메틸화 된 DNA의 MBD 기반 농축의 실험적 설계. ( b ) 생물 정보학 분석 파이프 라인은 CLL 특이 적 차별화 메틸화 영역 (cllDMRs)을 확인하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 2 : 정상적이고, 건강한, 분류 된 B 세포와 비교 된 CLL 환자 샘플의과 메틸화 및 저 메틸화 cllDMR 및 cllDMGs 7 . ( a ) 모든 만성 림프 성 백혈병 (CLL)은 IGHV 돌연변이 및 불 활성화 된 CLL 샘플을 정상 분류 된 B 세포 (정상 패널) 및 정상 PBMC 샘플과 비교하여 얻어진 현저한 p 값 (<0.00001)을 갖는 차별적으로 메틸화 된 부위와 연관되었다. (하단 패널). 히트 맵에 표시된 농축 물은 차별적으로 메틸화 된 영역 (DMR)에서 ± 3kb의 범위 내에있었습니다. ( b ) IGHV 돌연변이 그룹과 IGHV 비 돌연변이 그룹 사이의 CLL 특이 적 차별화 메틸화 유전자 (cllDMG;과 메틸화 및 저 메틸화)의 중첩을 보여주는 벤 다이어그램. 원형 차트는 단백질 분류와 같은 다른 분류에 속하는 유전자의 비율을 나타냅니다, 긴 noncoding RNA (lncRNA), pseudogenes, antisense 및 기타 noncoding RNAs. ( c ) B 세포와 PBMC 비교 사이의 공통적으로 차별적으로 메틸화 된 유전자 (IGHV 변이 된 및 IGHV 비 변이 된 예후 집단)의 중첩을 보여주는 벤 다이어그램. 벤 다이어그램의 왼쪽 패널은과 메틸화 유전자의 중첩과 저 메틸화 유전자의 오른쪽 패널을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 3 : 선정 된 뜻 깊게 차별화 Methylated 표적 유전자에 개인적인 CpG 위치를위한 DNA 메틸화 상태의 확인. 독립된 만성 림프구를 사용하여 두 개의 선택된 유전자에 대한 DNA 메틸화 백분율을 정량화하기위한 파이로 쿼팅 데이터ic 백혈병 (CLL) 샘플 코호트 54 샘플과 정상, 건강한, 연령 - 일치 B 세포 샘플을 포함합니다. ( A ) 박스 플롯은 파이로 시퀀싱을 사용하여과 메틸화 된 SKOR1 유전자의 3 개의 개별 CpG 부위에 대한 메틸화 수준의 백분율을 나타낸다. ( B ) 박스 플롯은 파이로 시퀀싱을 이용하여 저 메틸화 된 AC012065.7 유전자의 5 개의 개별적인 CpG 부위에 대한 메틸화 정도를 나타낸다. 상자는 사 분위수 범위 (25 ~ 75 %)를 나타내며, 내부 수평선은 중앙값을 나타냅니다. 수염은 최소값과 최대 값을 나타냅니다. 정상적인 B 세포보다 CLL 샘플의 차별화 된 메틸화 정도에 해당하는 p 값은 각 개별 CpG 사이트의 박스 플롯에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
MBD-seq는 비용 효율적이고 면역 침전에 기초한 기술로 완전한 게놈 범위로 메틸화 패턴을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. MeDIP seq (methylated DNA immunoprecipitation과 sequencing)와 MBD-seq는 모두 CpG가 풍부한 methylated DNA를 풍부하게 만든다. 그러나, MBD-seq는 MeDIP seq 19 와 비교할 때 높은 CpG가 풍부한 영역에 대한 결합에 대해 더 많은 친화도를 나타낸다. 메틸 결합 농축 키트를 사용하여 DNA를 고염소 및 저염 완충액으로 각각 용리하여 높은 CpG 및 낮은 CpG가 풍부한 영역으로 DNA를 분별 할 수 있습니다. 이 조사에서 CpG 섬의 대부분을 차지하는 고농축 CpG가 풍부한 지역을 포획하기 위해 단 하나의 분획물의 용출 만 수행되었습니다.
MBD-seq는 CLL 및 기타 백혈병 조사에서 일반적으로 사용되는 WGBS의 강력한 대안이 될 수 있습니다. MBD-seq가 bisulfite와 비교하여 상대적으로 많은 양의 입력 DNA를 요구하더라도변환 기반 방법을 사용하면 변환 후에 생성 된 PCR 증폭 편향없이 5mC 변형에만 특유한 전 지구 적 메틸화 변화를 조사 할 수 있습니다. 따라서 MBD-seq는 예후에 영향을 미칠 수있는 epigenetic-based CLL signature 유전자 일 수있는 cllDMG를 다루기위한 이상적인 방법이다.
이 방법을 수행하는 데 중요한 요소는 결합 반응 전에 사용 된 단편화 된 DNA의 품질 및 초음파 처리 범위입니다. 모든 샘플은 150-300 bp의 짧은 단편 범위를 보여 ( 그림 4 ), 데이터 필터링 및 청소 후 게놈에 매핑되는 각 샘플에 대해 약 2 억 -3,300 만 개의 고유 판독 값으로 양질의 시퀀싱 결과를 나타냅니다.
최종적으로, 과발현 및 저 메틸화 cllDMG의 메틸화 상태는 독립적 인 샘플 코호트에서 파이로 시퀀싱 방법을 사용하는 소수의 유전자에 대해 확인되었다. 이 방법은 perce서열 확장 동안 결합 된 C 및 T의 양에 기초하여 개별적인 CpG 부위에서 C-to-T의 비율에 따라 DNA 메틸화의 정도를 결정할 수있다. 과 메틸화 된 cllDMG는 정상 샘플에 비해 CLL 샘플에서 메틸화율이 높았다. 마찬가지로, 저 메틸화 cllDMGs는 반대를 보였다. 두 cllDMG에 대한 파이로 시퀀싱 데이터가 그림 3 에 나와 있습니다.
배열 기반 방법에 비해,이 방법은 반복적 인 요소와 lncRNA에 걸친 단백질 코딩 영역과 비 주석 서열에 걸친 이전에 주석이 달린 영역을 포함하여 게놈을 가로 지르는 서열의 더 넓은 검사를 허용합니다. 따라서 CLL 환자에 대한이 접근법은 lncRNA와 반복적 인 요소에 걸친 몇 가지 새로운 cllDMG를 확인했습니다. 이러한 연구가 CLL 환자 샘플에서 이전에 수행되지 않았으므로이 연구는 CLL 관련 차별화 된 메틸화 된 부위를 확인하는 데 중요한 자원으로 사용됩니다.다른 예후 소그룹. 이들 cllDMG는 후생적인 약물 치료를위한 새로운 바이오 마커 및 표적 물로서의 역할을 할 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 스웨덴 연구 협의회 (Swedish Research Council), 스웨덴 암 협회 (Swedish Cancer Society), 크 누트 (Knut) 및 앨리스 월 렌버그 재단 (Alice Wallenberg Foundation) (KAW) 및 FoU VästraGötalandsregionen에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
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