Summary
Ce travail décrit un protocole de séquençage optimisé du domaine de liaison au méthyl-CpG (MBD) et une canalisation de calcul pour identifier des régions riches en CpG différentiellement méthylées chez les patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique (CLL).
Abstract
Le rôle des ARN non codants longs (lncRNAs) dans le cancer est à l'avant-garde en raison de l'intérêt croissant pour la compréhension de leurs fonctions mécanistes pendant le développement et la progression du cancer. Malgré cela, la régulation épigénétique globale des ARNnc et des séquences répétitives dans le cancer n'a pas été bien étudiée, en particulier dans la leucémie lymphocytaire chronique (CLL). Cette étude se concentre sur une approche unique: la capture à base d'immunoprécipitation de fragments d'ADN méthylés à double brin en utilisant des protéines de liaison au méthyl-liaison (MBD), suivi du séquençage de la prochaine génération (MBD-seq). Des échantillons de patients CLL appartenant à deux sous-groupes pronostiques (5 échantillons mutés IGVH + 5 échantillons non mutés IGVH) ont été utilisés dans cette étude. L'analyse a révélé 5 800 hyperméthylés et 12 570 gènes méthylés différentiellement spécifiques de CLL hypométhylés (cllDMGs) par rapport aux témoins sains normaux. Il est important de noter que ces résultats ont identifié plusieurs ARNc linéaires différenciés par CLL, différentiellement méthylés.Des éléments pétitionnels et des gènes codant pour des protéines ayant une valeur pronostique potentielle. Ce travail décrit un protocole détaillé pour un pipeline MBD-seq et bioinformatique développé pour l'analyse complète des profils globaux de méthylation dans des régions riches en CpG utilisant des échantillons de patients CLL. Enfin, un gène codant pour la protéine et un ARNmc ont été validés en utilisant le pyrosequencing, qui est une méthode hautement quantitative pour analyser les niveaux de méthylisation du CpG afin de corroborer davantage les résultats du protocole MBD-seq.
Introduction
L'utilisation de techniques de séquençage de la prochaine génération pour analyser les profils globaux de méthylation de l'ADN a été de plus en plus populaire au cours des dernières années. Des essais de méthylation à l'échelle du génome, y compris les méthodes à base de microarray et de microarray, ont été développés sur la base de ce qui suit: la conversion de bisulfite d'ADN génomique, les digestion enzymes de restriction sensibles à la méthylation et l'immunoprécipitation d'ADN méthylé en utilisant des anticorps spécifiques de méthyle CpG .
La méthylation d'ADN aberrante est l'une des caractéristiques de la leucémie et des lymphomes, y compris la leucémie lymphocytaire chronique (CLL). Plus tôt, plusieurs groupes, dont le nôtre, ont caractérisé les profils de méthylation de l'ADN de différents sous-groupes de pronostic de CLL et des contrôles de cellules B normaux et sains utilisant la conversion de bisulfite d'ADN génomique, suivis de méthodes à base de micro-ensembles ou de séquençage génomique complet 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. La conversion de bisulfite d'ADN génomique conduit à la désamination des cytosines non modifiées à l'uracile, laissant les cytosines méthylées modifiées dans le génome. Une fois converti, l'état de méthylation de l'ADN peut être déterminé par amplification et séquençage par PCR en utilisant différentes méthodes quantitatives ou qualitatives, telles que le séquençage de bisulfites à base de micro-ensembles ou de génome entier (WGBS). Bien que les méthodes basées sur la conversion du bisulfite présentent de nombreux avantages et sont largement utilisées dans différents types de cancer pour analyser les niveaux de méthylation de l'ADN, il existe quelques inconvénients associés à cette technique. Le séquençage WGBS permet une résolution par paire unique avec des quantités inférieures d'ADN et est l'option la mieux adaptée pour analyser un grand nombre d'échantillons. Cependant, cette méthode ne parvient pas à différencier les modifications entre les niveaux 5 mC et 5 hmC dans le génome 5 , 6 . En outre, les méthodes basées sur les microarray n'offrent pas complète cExcès de génome.
Dans une étude récente de notre laboratoire 7 , les méthodes basées sur l'immunoprécipitation, plutôt que la conversion des bisulfites, ont été utilisées pour identifier des régions hautement riches en CpG, différentiellement méthylées à l'échelle mondiale chez des patients CLL et des témoins sains normaux. Le séquençage de prochaine génération (MBD-seq) du domaine de liaison au méthyl-CpG (MBD), l'enrichissement de l'ADN fragmenté double brin dépend du degré de méthylation du CpG. Ce procédé peut surmonter les inconvénients du procédé de conversion du bisulfite et peut également fournir une couverture de la méthylisation du CpG à l'échelle du génome de manière indépendante et indépendante de la PCR. De plus, contrairement aux méthodes de microarray basées sur la conversion au bisulfite, MBD-seq peut être utilisé pour analyser l'état de méthylation des éléments répétitifs, tels que les longs éléments nucléaires entremêlés (LINE), les éléments nucléaires intermédiaires courts (SINE), les répétitions terminales longues (LTRS) Etc. Cependant, par rapport aux méthodes de conversion des bisulfites,Un protocole MBD-seq nécessite une quantité relativement importante d'ADN d'entrée. En outre, la qualité des lectures séquentielles et les données dépendent de la spécificité, de l'affinité et de la qualité des anticorps utilisés.
L'étude actuelle explique un protocole MBD-seq détaillé pour enrichir l'ADN méthylé pour le séquençage de la prochaine génération. Il utilise un kit commercial d'enrichissement en liaison d'ADN méthylé (répertorié dans la table Matériaux ), ainsi qu'un pipeline informatique pour visualiser et interpréter les données de séquençage de la méthylation afin d'identifier les régions hyper-hypométhylées spécifiques de CLL par rapport aux témoins sains normaux. Fondamentalement, cette méthode utilise la capacité de la MBD de l'interaction de la protéine MBD2 humaine avec les CpG méthylées pour extraire l'ADN enrichi en CpG méthylées, ce qui est suivi du séquençage à haut débit de l'ADN méthylé.
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Protocol
L'approbation éthique pour la collecte des échantillons CLL est de 2007-05-21, avec le numéro d'enregistrement suivant: EPN Gbg dnr 239/07. Tous les patients CLL ont été diagnostiqués selon les critères récemment révisés 8 , et les échantillons ont été recueillis au moment du diagnostic. Les patients de l'étude ont été inclus dans différents départements d'hématologie dans la partie ouest de la Suède après avoir obtenu un consentement écrit. Seuls les échantillons de cellules mononucléaires de sang périphérique CLL (PBMC) avec un pourcentage tumoral de cellules leucémiques ≥ 70% ont été sélectionnés dans cette étude.
1. Préparations
- Isoler les PBMC pour les extractions d'ADN de CLL et des échantillons de sang périphériques normaux et sains en utilisant un kit d'isolement commercial (voir la table des matériaux ), conformément aux instructions du fabricant.
- Autoclave de tubes de 1,5 mL. Décongeler tous les réactifs dans le kit de liaison à l'ADN méthylé (voir la table des matériaux ). </ Li>
- Utilisez de l'eau exempte de DNase pour préparer 10 ml d'un tampon de lavage de tampon 1x à partir du tampon de lavage 5x fourni par le kit pour laver les perles et diluer la protéine MBD fournie par le kit.
- Obtenez ou préparez les éléments suivants à l'avance: 3 M d'acétate de sodium, éthanol absolu et 70% d'éthanol pour la précipitation de l'ADN ( Tableau des matériaux ).
2. Extraction d'ADN génomique et sonication
- Utiliser un kit d'extraction d'ADN disponible dans le commerce ( Tableau des matériaux ) pour isoler l'ADN génomique des échantillons PBMC patients et normaux selon le protocole du fabricant. Quantifier l'ADN génomique à l'aide d'un spectrophotomètre à 260 nm.
NOTE: La capacité de la colonne d'extraction d'ADN est de 5 à 6 millions de cellules, maximum; Par conséquent, il est important d'utiliser plus d'une colonne pour les échantillons avec plus de 5 millions de cellules. Eluer l'ADN deux fois en volume égal à 100 μL de tampon 10 mM Tris EDTA (TE). La protéine MBD-biotine utilisée dans le méthylLe kit mineur pour le séquençage MBD ne se liera pas à l'ADN monocaténaire. Ainsi, il est très important de garder l'ADN élué soit congelé, soit à 4 ° C pour préserver sa nature double brin. - Diluer 5 μg d'ADN génomique de chaque échantillon à un total de 200 μL en utilisant un tampon TE (pH 8), en donnant une concentration finale de 25 ng / μL.
- Effectuez une sonication dans des tubes spécialement conçus à l'aide d'un sonicateur ( Table des matériaux ) pour un total de 30 cycles (30 s sur et 30 s par cycle, après 5 cycles, tournez brièvement les tubes pour collecter les échantillons en bas).
NOTE: Cela produira un ADN fragmenté compris entre 150 pb et 300 pb, ce qui est optimal pour ce protocole. - Vérifiez la plage de sonication pour tous les échantillons avant de passer à l'étape suivante du séquençage de MBD en exécutant 1 μL des échantillons d'ADN fragmentés et une échelle de taille d'ADN sur un gel d'agarose 2% pré-légué dans le commerce en utilisant un équipement d'imagerie par électrophorèse d'ADN. Visualiser tIl utilise un transilluminateur UV standard.
3. Préparation des perles avant la liaison avec la protéine MBD-biotine
- Remettre en suspension les billes magnétiques de streptavidine du tube stock fourni par le kit, en pipingant doucement vers le haut et vers le bas pour obtenir une suspension homogène. Ne pas tourbillonner les perles ou les laisser sécher.
- Placez 50 μL de perles (pour chaque 5 μg d'échantillon d'ADN fragmenté) dans des tubes séparés, propres et étiquetés de 1,5 mL. Ajouter 50 μL de 1x tampon de lavage de talons pour atteindre le volume final de 100 μL.
REMARQUE: Lors de l'utilisation de petites bandes de réaction à la chaîne de polymérase de 0,5 mL (PCR) pour le lavage des billes, on utilise environ 150-200 μL de tampon de lavage par tube, comme mentionné dans le protocole du kit. Cependant, dans le cas de tubes de 1,5 mL, ajouter au moins 250 μL à 300 μL de tampon de lavage par tube pour le lavage des talons. - Placez les tubes sur un support magnétique pendant une minute pour permettre à toutes les perles magnétiques de se concentrer sur la paroi interne du tubeFace à l'aimant. Retirez le liquide, sans toucher les perles, en utilisant une pipette de 200 μL.
- Retirez les tubes du support magnétique, ajoutez 250 μL de tampon de tampon 1x et mélangez doucement les billes avec une pipette.
- Répétez les étapes 3.3 et 3.4 au moins 4-5 fois pour tous les échantillons et résulez finalement dans 250 μL de tampon de lavage de talons 1x. Gardez-les sur la glace.
4. Relier la protéine MBD-biotine aux perles lavées
- Ajouter 35 μL de protéine MBD (7 μL pour 1 μg d'échantillon d'ADN) pour séparer les tubes et porter le volume total jusqu'à 250 μL en utilisant un tampon de lavage de béton 1x.
- Ajouter 250 μL de protéine MBD diluée aux 250 μL de perles lavées et les laisser sur une rotation de bout en bout à température ambiante pendant 1 h.
- Après avoir mélangé les perles et les protéines pendant 1 h, lavez la biotine de protéine MBD liée avec des billes magnétiques de streptavidine.
- Placez les tubes sur le support magnétique pendant 1 min et retirez tIl liquide sans toucher les perles à l'aide d'une pipette. Ajouter 250 μL de tampon de tampon 1x et placer les tubes sur un mélangeur rotatif pendant 5 min à température ambiante.
- Répétez l'étape 4.3.1 deux fois de plus et résulez finalement les billes de biotine MBD lavées dans 200 μL de tampon de lavage de béton 1x, ce qui rend les billes prêtes pour la capture d'ADN méthylé.
REMARQUE: le lavage 2-3 fois de cette manière supprime toutes les billes de protéines MBD non liées au fond et améliore la liaison efficace des billes couplées à la protéine MBD avec de l'ADN génomique fragmenté.
5. Relier des billes MBD-biotine avec de l'ADN génomique fragmenté
- Dans un tube propre de 1,5 mL sans DNase, ajouter 100 μL de tampon de lavage de perles 5x et 180 μL de l'ADN génomique fragmenté (étape 2.3). Apportez le volume final à 500 μL en utilisant de l'eau exempte de DNase.
- Ajouter 380 μL d'eau exempte de DNase aux 20 μL restants de l'ADN génomique fragmenté et les congeler. Utilisez ces échantillons comme DN d'entréeA les contrôle et précipite plus tard avec les échantillons d'ADN méthylé élué final (voir étape 7.1).
- Placer les tubes contenant des billes MBD-biotine lavées (étape 4.4) sur un support magnétique pendant 1 min et retirer le liquide sans perturber les perles. Ajouter 500 μl d'ADN génomique fragmenté dilué dans un tampon de lavage de bourrelets.
- Sceller tous les tubes avec un film de paraffine et les laisser pendant une nuit à 4 ° C sur un support de rotation de bout en bout à 8-10 tr / min.
NOTE: La réaction de liaison à l'ADN et à la biotine-perle peut être effectuée pendant 1 h à température ambiante, mais la laisser à 4 ° C pendant la nuit peut améliorer la récupération de l'ADN méthylique final.
6. Suppression de l'ADN non consolidé et élution de l'ADN méthylé des perles
- Après la réaction de liaison DNA et MBD-bead, placez les tubes sur le support magnétique pendant 1 min pour concentrer toutes les perles sur la paroi interne du tube.
- Retirer le liquide surnageant avec une pipette sans toucherLes perles et sauver cette fraction d'échantillon d'ADN non liée sur la glace.
- Ajouter 200 μL de 1x tampon de lavage de perles aux perles et placer les tubes sur le support rotatif pendant 3 min à température ambiante. Placez les tubes sur le support magnétique et enlevez le liquide. Répétez le lavage deux fois encore pour éliminer l'ADN résiduel non lié.
- Après le lavage final, ajouter 200 μl de tampon d'élution à haute teneur en sel (2 000 mM de NaCl), fourni dans le kit pour éluer l'ADN.
- Placez les tubes sur le support rotatif pendant 15 min à température ambiante. Placez-les sur le support magnétique pendant 1 min et utilisez une pipette pour transférer soigneusement le surnageant dans un tube nouveau et propre de 1,5 mL.
- Ajouter 200 μl de tampon d'élution à haute teneur en sel et répéter l'élution en faisant tourner les tubes à température ambiante pendant 15 min. Ajouter le second eluage au même tube contenant les 200 μL du premier élu.
NOTE: Les 400 uL finaux d'ADN élue total sont maintenant prêts pour la précipitation à l'éthanol pour extraire le purifiéL'ADN convient pour le séquençage de la prochaine génération.
7. Précipitation d'éthanol et l'enrichissement de l'ADN méthylé
- Ajouter 1 μl de glycogène (20 μg / μL, inclus dans le kit); 40 μl d'acétate de sodium 3 M, pH 5,2; Et 800 μl d'éthanol absolu glacé à 400 μl d'ADN élue et également aux 400 μl d'échantillons d'ADN d'entrée préparés à l'étape 5.2.
- Mélangez bien les tubes en faisant tourbillonner et les incuber à -80 ° C pendant la nuit.
- Centrifuger les tubes à 12 000 xg (vitesse maximale) et 4 ° C. Jeter soigneusement le surnageant, sans perturber la pastille, ajouter 500 μL d'éthanol à 70% et tourbillonner les tubes.
- Centrifuger à nouveau à la vitesse maximale pendant 15 min à 4 ° C et retirer le surnageant en utilisant soigneusement une pipette. Faire refroidir les tubes à la vitesse maximale pendant 1 min à température ambiante et enlever complètement l'éthanol résiduel à l'aide d'une pointe de pipette.
- Sécher à l'air la pastille pendant 5 min à température ambianteRature. Ajouter 10 μL d'eau exempte de DNase à la pastille d'ADN. Procéder à la quantification de l'ADN méthylé (étape 7.6), séquençage MBD (étape 7.7) et analyse (sections 8 et 9).
- Quantifier les échantillons d'ADN méthylés récupérés finalisés à l'aide d'un kit de quantification fluorimétrique disponible dans le commerce (voir la Table des matériaux ), selon les instructions du fabricant.
- Note: En utilisant ce protocole, 30 à 50 ng d'ADN final ont été récupérés de chaque échantillon. Les échantillons d'ADN sont prêts à envoyer sur de la glace sèche pour la construction de la bibliothèque en aval et le séquençage MBD à haut débit
- Effectuer la construction de la bibliothèque d'ADN et le séquençage MBD à haut débit en utilisant une plate-forme commerciale ( Table des matériaux ), comme décrit dans la référence 9 .
REMARQUE: pour le contrôle de qualité initial de l'ADN méthylique final, effectuer des préparations de bibliothèque en utilisant un séquençage par paire de 50 pb pour tous les échantillons. Traiter les données brutes pour le contrôle de qualité après séquençage, unS élaboré à la étape 8.1, et le traiter en utilisant les approches bioinformatiques et les méthodes statistiques, comme décrit ci-dessous (étapes 8.2-9.6).
8. Méthode d'analyse de la bioinformatique 1: identification des régions différenciées méthylées associées au CLL (cllDMR)
- Nettoyez les lectures de 49 pb obtenues (format FASTQ) pour les adaptateurs utilisant des outils de contrôle de qualité disponibles, tels que Trimmomatic 10 ou Cutadapt. Vérifiez la qualité des lectures taillées à l'aide de la boîte à outils FastQC:
Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adaptateurs.fasta: 2: 30: 10 - Alignez les fichiers FASTQ nettoyés avec un générateur de courtes lectures Bowtie contre un génome de référence 11 . Spécifiez les paramètres ci-dessous:
- Autoriser jusqu'à deux désadaptations (paramètre Bowtie: -v 2).
- Limiter les rapports aux six meilleurs alignements par lecture (paramètre Bowtie: -m 6) pour contrôlerPour les lectures multi-mappage.
Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq> SAMPLE.sam
REMARQUE: Convertissez les fichiers SAM générés pour les échantillons individuels après l'alignement en BAM à l'aide de SAMtools.
Vue samtools -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam
- Utilisez l'analyse par modèle de ChIP-Seq (MACS) sur les échantillons alignés (BAM) pour prédire les régions enrichies / méthylées des sous-groupes CLL 12 .
REMARQUE: Comparaison I: utilisez l'échantillon d'entrée comme groupe témoin et les échantillons de patients normal et CLL comme groupes de traitement. Cette étape consiste à collecter tous les pics négatifs (pics élevés en entrée / arrière-plan). Comparaison II: Utiliser le groupe d'échantillons normal comme groupe témoin et le groupe d'échantillons de patients CLL comme groupe de traitement. Les pics positifs obtenus sont des régions hyper-méthylées CLL, et les pics négatifs sont des régions hypométhylées de CLL sur des régions méthylées normales ou différentielles (DMR).
Macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs - Supprimer les pics de fond de Comparaison I des régions différenciées méthylées (DMR) à l'aide de BEDtools 13 .
Bedtools soustraient -a <CLL_enriched_regions> -b <Input_enriched_regions> - Prévoyez le pourcentage d'éléments répétés (SINE-Alu, LINE, etc. ) enrichis en DMR.
- Utilisez fastacmd pour extraire la séquence FASTA de DMR par les coordonnées chromosomiques du génome de référence HG19.
Fastacmd -d HG19_genome.fa -s Chromosome -L Start, End -l 50000> DMRs.fasta - Utilisez l'outil de ligne de commande RepeatMasker pour prédire le pourcentage d'éléments répétés présents dans la séquence FASTA des DMR.
RepeatMasker -gc -gccalc -s -species humain -html DMRs.fasta
- Utilisez fastacmd pour extraire la séquence FASTA de DMR par les coordonnées chromosomiques du génome de référence HG19.
- Annotez les DMR prévus en utilisant Homer "annotatePeaks.pl" avec l'Ensembl disponible [PMC4919035] oR Gencode [PMID 22955987] annotation de transcription (codage de protéines et transcriptions non codantes).
AnnotatePeaks.pl DMRs.bed <GENOME> -gtf <Ensembl ou Gencode GTF>
REMARQUE: cela fournit des informations sur la répartition des pics sur différentes régions génériques ( c.-à-d., Promoteur, exon, intron, UTR 3 'et UTR 5') et régions intergéniques. Les transcrits ou les gènes associés aux DMR sont appelés gènes méthylés différentiellement (DMG). - Utilisez l'outil d'enrichissement avec la base de données fonctionnelle actualisée ou actuelle pour trouver des fonctions enrichies par les DMG CLL (seuls les gènes codant pour les protéines) 14 .
REMARQUE: Le regroupement des ensembles de gènes basé sur l'annotation fonctionnelle (GeneSCF) 14 est un outil en temps réel pour l'analyse d'enrichissement fonctionnel qui utilise la KEGG mise à jour et Gene Ontology comme base de données de référence.
9. Méthode d'analyse de bioinformatique 2: identification de CLL-associée significativement DiffDe manière générale des régions méthylées (clD sigDMR)
- Suivez les étapes 8.1-8.5 de la méthode I (section 8) et utilisez l'analyse d'enrichissement différentiel basé sur le compte de lecture en utilisant les outils disponibles, tel qu'élaboré aux étapes 9.2 à 9.6, pour ajouter un autre niveau de statistiques au pipeline d'analyse.
- Quantifier le nombre de lectures mappées sur les pics individuels ou DMR dans les échantillons de patients normal et CLL en utilisant "featureCounts" du paquet "Subread" 15 .
Subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
REMARQUE: Un filtre de qualité de cartographie peut être introduit pour éviter de quantifier les lectures de mauvaise qualité ( p. Ex., -Q 30). Pour cette étape, préparez les fichiers SAF pour les DMR obtenus. Pour plus d'informations sur le format de fichier SAF, utilisez ce lien http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/. - Utilisez une table RAW read-count contenant le nombre de lectures pour les pics individuels dans Normal anD groupes d'échantillons de patients CLL dans edgeR comme entrée 16 .
REMARQUE: Comparez les groupes d'échantillons de patients normaux versus CLL pour trouver des sigDMR. Pour une analyse d'enrichissement différentiel, suivez le guide de edgeR pour obtenir des instructions détaillées détaillées (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). - Filtrer les sigDMR à l'aide du taux de découverte fausse (FDR) et du changement de pli de registre prédit par edgeR 16 .
- Annotez les sigDMR prévus à l'aide d'Homer "annotatePeaks.pl" avec l'annotation de transcription Ensembl ou Gencode disponible (transcriptions codant pour les protéines et non codantes).
AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <Ensembl ou Gencode GTF> -CpG
REMARQUE: cela fournit des informations sur la répartition des pics sur différentes régions génériques ( c.-à-d., Promoteur, exon, intron, UTR 3 'et UTR 5') et régions intergéniques. Transcriptions ou gènes associés à siLes gDMR sont appelés sigDMGs. - Utilisez un outil d'enrichissement avec la base de données fonctionnelle actualisée ou actuelle pour trouver des fonctions enrichies par les sigDMG CLL (seuls les gènes codant pour les protéines) 14 .
NOTE: GeneSCF, l'un des outils en temps réel pour l'analyse de l'enrichissement fonctionnel, utilise KEGG et Gene Ontology comme bases de données de référence.
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Representative Results
MBD-seq a récemment été réalisé sur des patients atteints de CLL et des témoins adaptés, normaux et sains pour identifier les gènes différentiellement hyper-hypométhylés spécifiques de CLL 7 . Le pipeline expérimental et bioinformatique utilisé pour analyser les données générées à partir de CLL et des échantillons sains normaux sont présentés à la figure 1A et 1B . Ces analyses ont identifié plusieurs régions méthylées différentiellement spécifiques de CLL (cllDMR), qui étaient significativement hyper / hypométhylées à partir d'échantillons mutés IGHV et IGHV non mutés par rapport aux échantillons témoins, avec une valeur p <0,00001. La figure 2A montre tous les cllDMR obtenus à partir des comparaisons normales de cellules B et de PMBC normales. Tous les cllDMR ont été mappés à différentes classes de gènes codant pour des protéines et non codantes, comme le montre la figure 2B . Il est important de noter que, dans cette analyse, les comparaisons ont été effectuéesMed indépendamment entre les échantillons de patients CLL, avec deux contrôles normaux différents, des cellules B triées et des PMBC. Il est intéressant de noter que l'analyse a abouti à un chevauchement important de gènes méthylés différentiels spécifiques de CLL (cllDMGs, 851 hyperméthylés et 2 061 hypométhylés) par rapport au témoin normal de la cellule B et aux échantillons de témoins PBMC normaux ( figure 2C ), ce qui suggère que ces cllDMG peuvent être Les gènes de signature CLL possibles avec des rôles importants dans la pathogenèse de la maladie. Pour renforcer les données analysées , plusieurs sites de CpG situés dans un gène codant pour la protéine hyperméthylée, SKOR1 et un lncRNA non codé long, hypométhylé , AC012065.7 , ont été validés en utilisant une méthode de pyrosequencing, comme décrit dans les publications précédentes 7 , 17 , 18 ( Figure 3A Et B ). La figure 4 montre l'ADN ciseléAprès le protocole de sonication. L'ADN fragmenté varie entre 150 et 300 pb, ce qui le rend idéal pour le séquençage.
Figure 1: Vue d'ensemble du flux de travail utilisé dans cette étude. Ce chiffre, tiré de notre publication récente 7 , montre la conception de l'analyse globale utilisée pour identifier les régions méthylées différentiellement (DMR) dans les échantillons de patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique (CLL). (A) Conception expérimentale de l'enrichissement à base de MBD d'ADN méthylé. ( B ) Le pipeline d'analyse de la bioinformatique utilisé pour identifier les régions méthylées différentiellement spécifiques au CLL (cllDMR). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: CllDMRs et cllDMG hyperméthylés et hypométhylés des échantillons de patients CLL par rapport aux cellules B normales, saines et classées 7 . (A) Toutes les régions méthylées différentielles associées à la leucémie lymphocytaire chronique (CLL) avec des valeurs p significatives (<0.00001) obtenues à partir de la comparaison des échantillons de CLL mutés et non mutagés par IGHV aux cellules B classées normales (panel supérieur) et aux échantillons PBMC normaux (Panneau inférieur). Les enrichissements présentés dans la carte thermique se trouvaient dans une fenêtre de ± 3 kb provenant de la région différentiellement méthylée (DMR). ( B ) diagramme de Venn montrant le chevauchement des gènes méthylés différentiellement spécifiques de CLL (cllDMGs, hyperméthylés et hypométhylés) entre les groupes IGHV-mutés et IGHV-non mutés. Le diagramme graphique représente le pourcentage de gènes appartenant à une classification différente, comme le codage des protéines, Un ARN non codant long (ARNm), des pseudogènes, des antisens et d'autres ARN non codants. ( C ) diagramme de Venn montrant le chevauchement des gènes méthylés différentiels communs (groupes de pronostic mutés IGHV et IGHV non mutés) entre les comparaisons des cellules B et des PBMC. Le panneau gauche du diagramme de Venn montre le chevauchement des gènes hyperméthylés et du panneau droit pour les gènes hypométhylés. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Validation du statut de méthylation d'ADN pour les sites CpG individuels sur les gènes cibles sélectionnés de façon différentiellement méthylée. Données sur la pyroséquençage pour la quantification du pourcentage de méthylation de l'ADN pour deux gènes sélectionnés en utilisant un lymphocyte chronique indépendantUne cohorte d'échantillon de leucémie (CLL) contenant 54 échantillons et 6 échantillons de cellules B normales, sains et adaptés à l'âge. ( A ) Les calques représentent le pourcentage de niveaux de méthylation pour 3 sites CpG individuels du gène SKOR1 hyperméthylé en utilisant le pyrosequencing. ( B ) Le calque montre le degré de méthylation pour 5 sites CpG individuels de gène hypométhylé AC012065.7 utilisant le pyrosequencing. Les cases indiquent la plage interquartile (25-75%), tandis que la ligne horizontale intérieure indique la valeur médiane. Les moustaches représentent les valeurs minimales et maximales. La valeur p correspondant au degré de méthylation différentielle des échantillons de CLL sur des cellules B normales est indiquée dans les cases de chaque site CpG individuel. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
MBD-seq est une technique rentable, basée sur l'immunoprécipitation qui peut être utilisée pour étudier les modèles de méthylation avec une couverture complète du génome. Les deux MeDIP seq (immunoprécipitation de l'ADN méthylé suivi du séquençage) et MBD-seq entraînent l'enrichissement de l'ADN méthylé riche en CpG. Cependant, MBD-seq montre plus d'affinité envers la liaison à des régions riches en CpG par rapport à MeDIP seq 19 . À l'aide d'un kit d'enrichissement en liaison de méthyle, on peut fractionner l'ADN dans des régions riches en CpG et à faible teneur en CpG en éluant de l'ADN avec des tampons à sel et à faible teneur en sel, respectivement. Dans cette enquête, seule une élution à une seule fraction a été réalisée pour capturer des régions riches en CpG hautement enrichies couvrant la plupart des îles CpG.
MBD-seq peut être une alternative puissante au WGBS, qui est couramment utilisé dans les enquêtes CLL et autres leucémies. Même si MBD-seq nécessite des quantités relativement plus élevées d'ADN d'entrée par rapport au bisulfiteLes méthodes basées sur la conversion, il permet l'étude des changements globaux de la méthylation spécifiques uniquement pour les modifications de 5 mC, sans aucune polarisation d'amplification par PCR créée après la conversion. Ainsi, MBD-seq est une méthode idéale pour traiter les cllDMG, qui pourraient être des gènes de signature CLL potentiels à base d'épigénétique avec une valeur pronostique.
Les facteurs cruciaux pour l'exécution de cette méthode sont la qualité et la gamme de sonication de l'ADN fragmenté utilisé avant la réaction de liaison. Tous les échantillons ont montré des intervalles de fragments plus courts, entre 150 et 300 pb ( Figure 4 ), ce qui a donné lieu à des résultats de séquençage de bonne qualité, avec environ 25 à 33 millions de lectures uniques pour chaque cartographie d'échantillons au génome après filtrage et nettoyage de données.
Enfin, le statut de méthylation des cllDMG hyper et hypométhylés a été validé pour quelques gènes en utilisant une méthode de pyrosequencing dans une cohorte d'échantillon indépendante. Cette méthode donne le perceNullité de la méthylation de l'ADN, en fonction du rapport de C-à-T dans des sites CpG individuels en fonction de la quantité de C et T incorporée lors de l'extension de séquence. Les cllDMG hyperméthylés ont montré des pourcentages élevés de méthylation dans des échantillons de CLL par rapport aux échantillons normaux. De même, les cllDMG hypométhylés ont montré le contraire. Les données de Pyrosequencing pour deux cllDMG sont présentées à la Figure 3 .
Par rapport aux méthodes basées sur le tableau, cette méthode permet un examen plus large des séquences à travers le génome, y compris les régions précédemment annotées couvrant les régions codant les protéines et les séquences non annotées couvrant les éléments répétitifs et les ARNmc. Ainsi, cette approche sur les patients atteints de CLL a identifié plusieurs nouveaux cllDMG couvrant les ARNc et les éléments répétitifs. Étant donné que ces recherches n'ont pas été effectuées précédemment dans des échantillons de patients CLL, cette étude constitue une ressource précieuse pour identifier les régions méthylées différentielles associées au CLL dansDifférents sous-groupes pronostiques. Ces cllDMG serviront de nouveaux biomarqueurs et de cibles pour le traitement médicamenteux épigénétique.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le Conseil suédois de la recherche, la Société suédoise du cancer, la Fondation Knut et Alice Wallenberg (KAW) et FoU VästraGötalandsregionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
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