Summary
यह काम एक अनुकूलित मिथाइल-सीपीजी-बाध्यकारी डोमेन (एमबीडी) अनुक्रमण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है और क्रोनिक लिम्फोसाइटैटिक ल्यूकेमिया (सीएलएल) रोगियों में अलग-अलग मेथिलेटेड सीपीजी-समृद्ध क्षेत्रों की पहचान करने के लिए एक कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन का वर्णन करता है।
Abstract
कैंसर के विकास और प्रगति के दौरान उनके यंत्रवत् कार्यों को समझने में बढ़ती हुई रुचि के कारण कैंसर में लंबे समय तक गैर-कोटिंग आरएनए (एलएनसीआरएनए) की भूमिका सबसे आगे आ रही है। इसके बावजूद, एलएनसीआरएनए के वैश्विक एपिनेटिक नियमन और कैंसर में दोहराए जाने वाले अनुक्रमों की अच्छी जांच नहीं हुई है, विशेषकर पुरानी लिम्फोसाइटैटिक ल्यूकेमिया (सीएलएल) में। यह अध्ययन एक अनूठे दृष्टिकोण पर केंद्रित है: मिथाइल बाध्यकारी डोमेन (एमबीडी) प्रोटीन का उपयोग करके डबल-फंसे हुए, मेथिलेटेड डीएनए टुकड़ों का प्रतिरक्षा-आधारित कब्जा, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एमबीडी-सीईसी) द्वारा पीछा किया गया। इस अध्ययन में दो पूर्वकल्पनात्मक उपसमूह (5 आईजीवीएच उत्परिवर्तित नमूनों + 5 आईजीवीएच अनमुरेटेड नमूनों) से संबंधित सीएलएल रोगी का नमूना उपयोग किया गया था विश्लेषण ने सामान्य स्वस्थ नियंत्रणों की तुलना में 5,800 हाइपमैथिलेटेड और 12,570 हाइपोमैथिलेटेड सीएलएल-विशिष्ट भिन्न मिथाइलेटेड जीन (सीएलएलडीएमजी) का पता चला है। महत्वपूर्ण रूप से, इन परिणामों ने कई सीएलएल-विशिष्ट, अलग-अलग मेथिलेटेड एलएनसीआरएनए की पहचान की, फिर सेपेटी तत्वों, और प्रोटीन-कोडिंग जीन संभावित भविष्यसूचक मूल्य के साथ यह काम एमएलडी-सीक और बायोइनफॉरमैटिक्स पाइप लाइन के लिए सीएलएल रोगी के नमूनों का उपयोग करते हुए अत्यधिक सीपीजी-समृद्ध क्षेत्रों में वैश्विक मेथिलिलेशन प्रोफाइल के व्यापक विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल की रूपरेखा है। अंत में, एक प्रोटीन-कोडन जीन और एक एलएनसीआरएनए पाइरोसेक्नेसिंग का उपयोग करके मान्य किया गया था, जो एमपीडी-सीक प्रोटोकॉल से निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए सीपीजी मेथिलिलेशन स्तर का विश्लेषण करने के लिए एक उच्च मात्रात्मक विधि है।
Introduction
हाल के वर्षों में वैश्विक डीएनए मेथिलिलेशन प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण तकनीकों का उपयोग तेजी से लोकप्रिय रहा है। जीनोम-व्यापी मेथिलिकेशन एलेक्स, जिसमें माइक्रोएरे- और गैर-माइक्रोएरे-आधारित विधियों शामिल हैं, निम्न के आधार पर विकसित किए गए: जीनोमिक डीएनए, मेथिलैक्शन-प्रतिबन्ध प्रतिबंध एंजाइम पचनों के बायसफ़ाइट रूपांतरण, और मेथिलैटेड डीएनए के इम्युनोपेरियैप्थ मिथाइल सीपीजी-विशिष्ट एंटीबॉडीज़ ।
एबरेन्ट डीएनए मेथाइलेशन, ल्यूकेमिया और लिम्फोमा के लक्षणों में से एक है, जिसमें चिरकालिक लिम्फोसाइटैटिक ल्यूकेमिया (सीएलएल) शामिल है। इससे पहले, हमारे सहित कई समूहों ने डीएलए मेथिलिलेशन प्रोफाइल को अलग सीएलएल प्रॉग्निगोस्टिक उपसमूहों और सामान्य, स्वस्थ बी सेल नियंत्रण को जीनोमिक डीएनए के बायसफ़ाइट रूपांतरण का उपयोग कर दिखाया, इसके बाद सूक्ष्म सरणी-आधारित तरीकों या संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण 1 , 2 , 3 , <Sup वर्ग = "xref"> 4 जीनोमिक डीएनए के बिसूफाइट रूपांतरण को असमापित साइटोसिंस के डीरमिनेशन को मूत्राल में ले जाता है, जो जीनोम में संशोधित मिथाइलेटेड साइटोसिन्स छोड़ देता है। एक बार परिवर्तित होने पर, डीएनए की मेथिलिकेशन स्थिति पीसीआर प्रवर्धन और सूक्ष्म-सरणी-आधारित या पूरे-जीनोम बीसफ़ाफ़्ट अनुक्रमण (डब्ल्यूजीबीएस) जैसे विभिन्न मात्रात्मक या गुणात्मक विधियों का उपयोग करके अनुक्रमणित किया जा सकता है। यद्यपि bisulfite रूपांतरण आधारित तरीकों के कई फायदे हैं और डीएनए मेथिलिकेशन स्तरों का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न कैंसर प्रकारों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, हालांकि इस तकनीक से जुड़े कुछ कमियां हैं। डब्ल्यूजीबीएस अनुक्रमण, एकल-आधार-जोड़ी रिजॉल्यूशन को कम मात्रा में डीएनए की अनुमति देता है और बड़ी संख्या में नमूने का विश्लेषण करने के लिए सबसे उपयुक्त विकल्प है। हालांकि, यह विधि 5 एमसी और 5 एचएमसी स्तरों के जीनोम 5 , 6 के बीच संशोधनों को अलग करने में विफल रहता है। इसके अतिरिक्त, माइक्रोएरे-आधारित विधियाँ पूरी तरह से सी प्रदान नहीं करती हैंजीनोम के अधिकतर
हमारे प्रयोगशाला 7 के हाल के एक अध्ययन में, बीसफ़्लैट रूपांतरण की बजाय, immunoprecipitation आधारित विधियों का उपयोग सीएलएल मरीजों और सामान्य स्वस्थ नियंत्रणों में वैश्विक स्तर पर अत्यधिक सीपीजी-अमीर, अलग-अलग मेथिलेटेड क्षेत्रों की पहचान करने के लिए किया गया था। Inmethyl-CpG- बाध्यकारी डोमेन (एमबीडी) अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (MBD-seq), डबल असहाय खंडित डीएनए का संवर्धन सीपीजी मेथिलिकेशन की डिग्री पर निर्भर करता है। यह विधि bisulfite रूपांतरण पद्धति की कमियों को दूर कर सकती है और एक निष्पक्ष और पीसीआर-स्वतंत्र तरीके से सीपीजी मेथिलिकेशन की जीनोम-विस्तृत कवरेज प्रदान कर सकती है। इसके अतिरिक्त, बाइसफ़ाइट रूपांतरण-आधारित माइक्रोएरे विधियों के विपरीत, एमबीडी-सीक दोहराए जाने वाले तत्वों की मेथिलिकेशन स्थिति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे परमाणु तत्वों (एनआईएनई), परमाणु तत्वों (एसईआर), लंबे टर्मिनल दोहराव (एलटीआरएस) आदि हालांकि, बिसूफ़ाइट रूपांतरण विधियों की तुलना में,एक एमबीडी-सीक प्रोटोकॉल को अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में इनपुट डीएनए की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, अनुक्रमण की गुणवत्ता पढ़ी जाती है और डेटा उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी की विशिष्टता, आत्मीयता और गुणवत्ता पर निर्भर करता है।
वर्तमान अध्ययन में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए मेथिलेटेड डीएनए को समृद्ध करने के लिए विस्तृत एमबीडी-सीक प्रोटोकॉल बताता है। यह एक वाणिज्यिक मेथिलेटेड डीएनए बाध्यकारी संवर्धन किट ( सामग्री तालिका में सूचीबद्ध) का उपयोग करता है, साथ ही सामान्य स्वस्थ नियंत्रणों की तुलना में सीएलएल-विशिष्ट हाइपर- और हाइपोमैथिलेटेड क्षेत्रों की पहचान करने के लिए मेथिलैशन अनुक्रमण डेटा को देखने और व्याख्या करने के लिए एक कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन का उपयोग करता है। असल में, यह विधि मैथिलाटेड सीपीजी के साथ संपन्न डीएनए को निकालने के लिए मानव एमबीडी 2 प्रोटीन इंटरैक्शन के एमबीडी की क्षमता का उपयोग करता है, और इसके बाद मेथिलेटेड डीएनए के उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के द्वारा किया जाता है।
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Protocol
सीएलएल नमूने एकत्र करने के लिए नैतिक अनुमोदन 2007-05-21 से है, निम्न पंजीकरण संख्या के साथ: ईपीएन जीबीजी डीएनआर 239/07 हालिया संशोधित मानदंडों के अनुसार सभी सीएलएल रोगियों का निदान किया गया, और निदान के समय नमूने एकत्र किए गए थे। स्वीडन के पश्चिमी भाग में लिखित सहमति प्राप्त करने के बाद अध्ययन में मरीजों को विभिन्न हेमटोलॉजी विभागों से शामिल किया गया था। केवल सीएलएल परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (पीबीएमसी) के नमूनों में ल्यूकेमिक कोशिकाओं के एक ट्यूमर प्रतिशत के साथ 70% इस अध्ययन में चयनित थे।
1. तैयारी
- सीएलएल से डीएनए निष्कर्षण के लिए पीबीएमसी को अलग करें और निर्माता के निर्देशों के मुताबिक वाणिज्यिक अलगाव किट ( सामग्री तालिका देखें ) का उपयोग कर सामान्य, स्वस्थ परिधीय रक्त के नमूने।
- आटोक्लेव 1.5 एमएल ट्यूब। मैथिलाटेड डीएनए बाध्यकारी किट में सभी अभिकर्मकों को पिघलाना ( सामग्री तालिका देखें )/ Li>
- किट द्वारा मुहैया धोने और किट द्वारा प्रदान की गई एमबीडी प्रोटीन को पतला करने के लिए प्रदान किए गए 5x स्टॉक वॉश बफर से 10 एमएल 1 एक्स बीड वॉश बफर को तैयार करने के लिए डीएनज मुक्त पानी का उपयोग करें।
- निम्नलिखित वस्तुओं को अग्रिम में प्राप्त करें या तैयार करें: डीएनए वर्षा ( सामग्री तालिका ) के लिए 3 एम सोडियम एसीटेट, पूर्ण इथेनॉल और 70% इथेनॉल।
2. जीनोमिक डीएनए निकालना और sonication
- निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार रोगी और सामान्य पीबीएमसी नमूनों से जीनोमिक डीएनए को अलग करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए निष्कर्षण किट ( सामग्री तालिका ) का उपयोग करें। 260 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए को बढ़ाएं।
नोट: डीएनए निकासी स्तंभ क्षमता 5-6 लाख कोशिकाओं, अधिकतम है; इसलिए 5 लाख से अधिक कोशिकाओं वाले नमूनों के लिए एक से अधिक कॉलम का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। 10 एमएम ट्रिस EDTA (TE) बफर के 100 μL के बराबर मात्रा में दो बार डीएनए को नमस्कार करें। मिथाइल में इस्तेमाल एमबीडी-बायोटिन प्रोटीनMBD अनुक्रमण के लिए खान में काम करनेवाला किट एकल-फंसे डीएनए को बाँध नहीं करेगा। इस प्रकार, एल्यूटेड डीएनए को जमे हुए या 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए अपने डबल फंसे प्रकृति को बनाए रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। - प्रत्येक नमूने से 5 माइक्रोग्राम जीनोमिक डीएनए को टीई बफर (पीएच 8) का उपयोग करते हुए कुल 200 μL में डालना, 25 एनजी / μ एल का अंतिम एकाग्रता दे।
- कुल 30 चक्रों (प्रत्येक चक्र में प्रति 30 एस और 30 एस बंद करने के लिए) के लिए विशेष रूप से डिजाइन किए ट्यूबों में सोनिक का प्रदर्शन करें (प्रत्येक 5 चक्रों के बाद, संक्षेप में ट्यूबों को नीचे के नमूने एकत्र करने के लिए स्पिन करें)।
नोट: यह 150 बीपी और 300 बीपी के बीच खंडित डीएनए का उत्पादन करेगा, जो इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूल है। - डीएनए वैद्युतकणसंचलन इमेजिंग उपकरण का उपयोग करके व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूर्व प्री-कास्ट 2% एगरोज जेल पर खंडित डीएनए नमूने के 1 μL और एक डीएनए आकार की सीढ़ी चलाने के द्वारा एमबीडी अनुक्रमण के अगले चरण पर जाने से पहले सभी नमूनों के लिए सोनाइज रेंज की जांच करें। टी कल्पना करेंवह एक मानक यूवी ट्रांसिल्युमिनेटर का उपयोग करके डीएनए
3. बीड तैयार करना एमबीडी-बायोटिन प्रोटीन के साथ बाध्य करने से पहले
- किट द्वारा प्रदान की गई स्टॉक ट्यूब से चुंबकीय स्ट्रेप्टिविडिन मोतियों को फिर से खोलें, एक समरूप निलंबन प्राप्त करने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे pipetting। मोती भंवर न करें या उन्हें सूखने दें।
- अलग, स्वच्छ, और लेबल 1.5 एमएल ट्यूब में 50 μL मोती (प्रत्येक 5 माइक्रोग्राम के विखंडित डीएनए नमूने के लिए) रखें। 100 μL की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए 50 μL का 1x बीड वॉश बफर जोड़ें।
नोट: किट प्रोटोकॉल में उल्लिखित, मोती धोने के लिए 0.5 एमएल पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) वाली पट्टियाँ का उपयोग करते समय, ट्यूब प्रति 150-200 μL धोने वाला बफर प्रति का उपयोग किया जाता है। हालांकि, 1.5 एमएल ट्यूबों के मामले में, मोती धोने के लिए कम से कम 250 μL से 300 μL धोने बफर प्रति ट्यूब जोड़ें। - ट्यूब के भीतर की दीवार पर ध्यान केंद्रित करने के लिए सभी चुंबकीय मोतियों को एक मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर रखेंचुंबक का सामना करना पड़ रहा है 200 μL विंदुक का उपयोग करते हुए, मोतियों को छूने के बिना तरल निकालें।
- ट्यूबों को चुंबकीय स्टैंड से हटा दें, 250 μL 1x बीड वॉश बफर को जोड़ें और मिक्स्ड को एक विंदुक के साथ धीरे से मिलाएं।
- सभी नमूनों के लिए कम से कम 4-5 बार चरण 3.3 और 3.4 दोहराएं और अंत में 250 μL 1x बीड धो बफर में पुन: उन्हें बर्फ पर रखें
4. एमबीडी-बायोटिन प्रोटीन को धोया मोती तक बाध्य कर रहा है
- ट्यूबों को अलग करने के लिए 35 μL MBD प्रोटीन (1 μg डीएनए नमूने के लिए 7 μL) जोड़ें और कुल मात्रा को 250 μL तक 1x बीड वॉश बफर का उपयोग कर दें।
- धोने के 250 μL में 250 μL पतला एमबीडी प्रोटीन जोड़ें और उन्हें 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंत-टू-एंड रोटेशन पर छोड़ दें।
- मोती और प्रोटीन को 1 घंटे के मिश्रण के बाद, एमबीडी प्रोटीन बायोटिन को चुंबकीय स्ट्रेक्टिविडिन मोतियों से बंधे धो लें।
- 1 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब रखें और टी को हटा देंवह एक पिपेट का उपयोग कर मोतियों को छूने के बिना तरल। 250 μL का 1x बीड वॉश बफर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए रोटेशन मिक्सर पर ट्यूबों को रखें।
- दो बार दोहराएँ 4.3.1 दो बार दोहराएं और अंत में 200 एमएल के 1 एक्स बीड वॉश बफर में धोया एमबीडी-बायोटिन मोती resuspend, मिथाइलेटेड डीएनए कैद के लिए तैयार मोती बना।
नोट: इस तरीके से 2-3 बार धोना सभी पृष्ठभूमि अनबाउंड एमबीडी प्रोटीन मोती को निकालता है और विखंडित जीनोमिक डीएनए के साथ एमबीडी प्रोटीन-युग्मित मोती के प्रभावी बाध्यता में सुधार करता है।
5. खंडित जीनोमिक डीएनए के साथ बाध्यकारी एमबीडी-बायोटिन मोती
- स्वच्छ 1.5 एमएल डीएनस मुक्त ट्यूब में, 5x बीड वॉश बफर के 100 μL और विखंडित जीनोमिक डीएनए (चरण 2.3) के 180 μL जोड़ें। अंतिम मात्रा को 500 μL का उपयोग करके डीएनसी मुक्त पानी ले आओ।
- विघटित जीनोमिक डीएनए के शेष 20 μL को 380 μL डीएनस मुक्त पानी में जोड़ें और उन्हें फ्रीज करें। इनपुट डीएन के रूप में इन नमूनों का उपयोग करेंएक नियंत्रण और बाद में अंतिम eluted methylated डीएनए नमूनों के साथ उन्हें आगे बढ़ना (कदम 7.1 देखें)।
- 1 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर धोए गए एमबीडी-बायोटिन मोती (चरण 4.4) युक्त ट्यूब रखें और मोतियों को परेशान किए बिना तरल निकालें। मोती धो बफर में पतला जेनोमिक डीएनए के 500 μL जोड़ें।
- सभी ट्यूबों को पैराफिन फिल्म के साथ कसकर सील करें और उन्हें रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर 8-10 आरपीएम पर एंड-एंड-एंड रोटेशन स्टैंड पर छोड़ दें।
नोट: डीएनए और बायोटिन-बीड बाध्यकारी प्रतिक्रिया 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर किया जा सकता है, लेकिन इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़कर अंतिम मेथिलेटेड डीएनए की वसूली में सुधार हो सकता है।
6. अनबाउंड डीएनए हटाने और मोती से मेथिलेटेड डीएनए को हटा देना
- डीएनए और एमबीडी-बीड बाध्यकारी प्रतिक्रिया के बाद, ट्यूब के भीतर की दीवार पर सभी मोतियों को ध्यान में रखने के लिए 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर ट्यूबें रखें।
- छूने के बिना एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला तरल निकालेंमोती और बर्फ पर इस अनबाउंड डीएनए नमूना अंश को बचाओ।
- मोती के लिए 200 μL 1x बीड वॉश बफर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए घूर्णन स्टैंड पर ट्यूबें रखें। ट्यूबों को चुंबकीय स्टैंड पर रखें और तरल निकालें। अवशिष्ट अनबाउंड डीएनए को हटाने के लिए दो बार दोहराएं दोहराएं।
- अंतिम धोने के बाद, डीएनए को नम करने के लिए किट में प्रदान किए गए 200 μL उच्च नमक अलगाव बफर (2,000 मिमी NaCl) जोड़ें।
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए घूर्णन स्टैंड पर ट्यूब रखें। उन्हें 1 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर रखें और एक नई, स्वच्छ 1.5 एमएल ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला को ध्यानपूर्वक स्थानांतरण करने के लिए एक विंदुक का उपयोग करें।
- उच्च नमक अलौकिक बफर के 200 μL जोड़ें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों घूर्णन करके दोहराएँ। पहले elute के 200 μL युक्त एक ही ट्यूब में दूसरा एलाट जोड़ें।
नोट: कुल eluted डीएनए के अंतिम 400 μL अब शुद्ध निकालने के लिए इथेनॉल वर्षा के लिए तैयार हैअगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए उपयुक्त डीएनए।
7. इथेनॉल वर्षा और मेथिलेटेड डीएनए के संवर्धन
- ग्लाइकोज़ के 1 μL जोड़ें (20 माइक्रोग्राम / μL; किट में शामिल;); 40 एमएल 3 एम सोडियम एसीटेट, पीएच 5.2; और 800 μL बर्फ-ठंडा पूर्ण इथेनॉल 400 डीएल के एलियंट डीएनए के लिए और चरण 5.2 में तैयार किए गए डीएनए नमूने के 400 μL के लिए।
- भंवरों द्वारा अच्छी तरह से ट्यूबों को मिलाएं और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर रात में भरें।
- ट्यूबों को 12,000 xg (अधिकतम गति) और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरने वाले को ध्यान से त्यागें, 70% इथेनॉल के 500 μL जोड़ें और ट्यूबों को भंवर करें।
- अधिकतम गति पर फिर से 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और पिपेट का उपयोग करके सावधानीपूर्वक सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर ट्यूबों की सफाई करें और विंदुक टिप का उपयोग करके पूरी तरह से अवशिष्ट इथेनॉल को हटा दें।
- रूम टेम्पप पर 5 मिनट के लिए गोली मारोrature। डीएनए गोली के लिए 10 μL डीएनस मुक्त पानी जोड़ें। मेथिलेटेड डीएनए मात्रा का ठहराव (चरण 7.6), एमबीडी अनुक्रमण (चरण 7.7), और विश्लेषण (खंड 8 और 9) के लिए आगे बढ़ें।
- निर्माता के निर्देशों के मुताबिक, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध फ़्लोरोमेट्रिक मात्रात्मक किट ( सामग्री तालिका देखें ) का उपयोग करके अंतिम बरामद किए गए मेथिलैटेड डीएनए नमूनों को बढ़ाएं।
- नोट: इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, प्रत्येक नमूने से 30-50 एनजी अंतिम डीएनए प्राप्त किया गया था। डीएनए नमूने डाउनस्ट्रीम पुस्तकालय निर्माण और उच्च-थ्रुपुट एमबीडी अनुक्रमण के लिए सूखी बर्फ पर भेजने के लिए तैयार हैं
- संदर्भ 9 में वर्णित के अनुसार, एक वाणिज्यिक मंच ( सामग्री तालिका ) का उपयोग करके डीएनए पुस्तकालय निर्माण और उच्च-थ्रुपुट एमबीडी अनुक्रमण करना।
नोट: अंतिम मिथाइलेटेड डीएनए की प्रारंभिक गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, सभी नमूनों के लिए 50-बीपी युग्म-एंड अनुक्रमण के उपयोग से लाइब्रेरी की तैयारी करें। पोस्ट-अनुक्रमिक गुणवत्ता नियंत्रण के लिए कच्चे डेटा की प्रक्रिया करें, एचरण 8.1 में विस्तारित किया गया है, और नीचे दिए गए चरणों (8.2- 9.6 चरण) के अनुसार जैव सूचना विज्ञान दृष्टिकोण और सांख्यिकीय तरीकों का उपयोग करके इसे आगे की प्रक्रिया।
8. बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण विधि 1: सीएलएल से जुड़े अलग-अलग मेथिलेटेड क्षेत्र (सीएलडीएमआर) की पहचान करना
- उपलब्ध गुणवत्ता नियंत्रण उपकरणों का उपयोग करते हुए एडाप्टर के लिए प्राप्त 49-बीपी रीड (फास्टक्यू प्रारूप) को साफ करें, जैसे कि ट्राईमैमैटिक 10 या कटडैप्ट फास्टक्यूसी टूलकिट का उपयोग करके छंटनी की गुणवत्ता को जांचें:
जावा- जार्ज ट्रिममैटिक.जेर एसई एसएमपीले_नक्लेनैड.फास्टक सैमप्ले.फास्टक आईल्यूमिनैकः एडेप्टरःफाडा: 2: 30: 10 - एक संदर्भ जीनोम 11 के खिलाफ शॉर्ट-पठन जेनोम एल्ग्नर बोट्टी के साथ साफ FASTQ फ़ाइलों को संरेखित करें। नीचे पैरामीटर निर्दिष्ट करें:
- दो बेमेल की अनुमति दें (Bowtie पैरामीटर: -वी 2)।
- प्रति पढ़ने के लिए छः बेस्ट संरेखणों (रिपोर्टिंग पैरामीटर: -66) पर रिपोर्टिंग को सीमित करेंबहु मैपिंग के लिए पढ़ता है
Bowtie -v 2- ए-एम 6 एचजी19_आईएनडीएक्स-एस सैंपल.फ़ेस्टक> सैंपल।
नोट: SAMtools का उपयोग करके BAM में संरेखण के बाद व्यक्तिगत नमूनों के लिए बनाई गई SAM फ़ाइलों को परिवर्तित करें।
Samtools देखें- bS -o sample.bam sample.Sam
- सीएलएल उपसमूह 12 से समृद्ध / मेथिलेटेड क्षेत्रों की भविष्यवाणी के लिए गठबंधन वाले नमूनों (बीएएम) पर चिप-सीक (एमएसीएस) पीक कॉलर के मॉडल-आधारित विश्लेषण का उपयोग करें।
नोट: तुलना I: नियंत्रण समूह के रूप में इनपुट नमूना का प्रयोग करें और इलाज समूहों के रूप में सामान्य और सीएलएल दोनों रोगी के नमूने। यह कदम सभी नकारात्मक चोटियों (इनपुट / पृष्ठभूमि में समृद्ध चोटियों) को एकत्र करना है। तुलना II: नियंत्रण समूह के रूप में सामान्य नमूना समूह का उपयोग करें और सीएलएल रोगी के नमूने समूह को उपचार समूह के रूप में उपयोग करें। प्राप्त सकारात्मक चोटियों सीएलएल हाइपर-मेथिलेटेड क्षेत्र हैं, और नकारात्मक चोटियों सीएलएल हाइपोमैथिलेटेड क्षेत्र सामान्य या भिन्न मेथिलेटेड क्षेत्रों (डीएमआर) पर हैं।
macs14-टी SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam - प्रारूप BAM -g एचएस - बेडाटोल्स 13 का इस्तेमाल करते हुए तुलनात्मक मीथेलालेटेड क्षेत्रों (डीएमआर) से तुलना आई पृष्ठभूमि की चोटियों को निकालें
बेडटोल घटाएं- ए <CLL_enriched_regions> -b <Input_enriched_regions> - डीएमआर में समृद्ध दोहराए तत्वों (एसिन-एलू, लाइन, आदि ) के प्रतिशत की भविष्यवाणी करें।
- संदर्भ जीनोम एचजी 1 9 से क्रोमोसोमल निर्देशांक द्वारा डीएमआर के फ़ास्टा अनुक्रम को निकालने के लिए फास्टैक एमडी का उपयोग करें।
फास्टैसीएमडी-डी एचजी19_जिनीम। एफए -एस क्रोमोजोम -एल स्टार्ट, एंड-एल 50000> डीएमआर। फास्टा - डीएमआरएस के तह फास्टए क्रम में मौजूद दोहराए गए तत्वों के प्रतिशत की भविष्यवाणी करने के लिए दोहराव मास्कर कमांडलाइन उपकरण का उपयोग करें।
दोहराए गए मास्टर - जीसी - जीसीसीएल - एस - एसपीएसिस - मानव - एचटीएमएल डीएमआरएसफाडा
- संदर्भ जीनोम एचजी 1 9 से क्रोमोसोमल निर्देशांक द्वारा डीएमआर के फ़ास्टा अनुक्रम को निकालने के लिए फास्टैक एमडी का उपयोग करें।
- उपलब्ध एन्स्म्बल [पीएमसी 491 9 35] के साथ होमर "एनोटेटपेक्स.प्ल" का प्रयोग करके अनुमानित डीएमआर का व्याख्याजेनकोड [पीएमआईडी 22 9 5 9 87] ट्रांसक्रिप्ट एनोटेशन (प्रोटीन-कोडिंग और नॉनकोडिंग टेप)।
एनोटेटपेक्स.पीएल DMRs.bed <GENOME> -gtf <एनएसम्बल या जेनोकोड जीटीएफ>
नोट: यह विभिन्न जैनिक क्षेत्रों ( यानी, प्रमोटर, एक्सॉन, इंट्रॉन, 3 'यूटीआर, और 5' यूटीआरएस) और इंटरजेनिक क्षेत्रों पर चोटियों के वितरण के बारे में जानकारी प्रदान करता है। डीएमआर के साथ जुड़े ट्रांसक्रिप्ट या जीन को मिथाइलेटेड जीन (डीएमजी) कहा जाता है। - सीएलएल डीएमजी (केवल प्रोटीन-कोडिंग जीन) द्वारा समृद्ध कार्यों को खोजने के लिए अद्यतित या वर्तमान कार्यात्मक डेटाबेस के साथ संवर्धन उपकरण का उपयोग करें 14 ।
नोट: कार्यात्मक एनोटेशन (जीनएससीएफ़) 14 पर आधारित जीन सेट क्लस्टरिंग, कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण के लिए एक वास्तविक समय आधारित उपकरण है जो एक संदर्भ डेटाबेस के रूप में अद्यतन केएजीजी और जीन ओटोलोजी का उपयोग करता है।
9. बायोइनफॉरमैटिक्स विश्लेषण विधि 2: सीएलएल से जुड़े महत्वपूर्ण रूप से पहचानने वाला अंतरपहले से ही मेथिलाटेड क्षेत्र (सीएलएल सिग्डम एमआर का)
- विधि I (अनुभाग 8) से 8.1-8.5 के चरणों का पालन करें और विश्लेषण उपकरण का उपयोग करके पढ़ने-गिनती-आधारित अंतर संवर्धन विश्लेषण का उपयोग करें, जैसा कि विश्लेषण पाइपलाइन के लिए एक और स्तर के आंकड़े जोड़ने के लिए, 9.2 - 9।
- "सबरेड" पैकेज 15 से "फीचरकैल्स" का उपयोग करते हुए सामान्य और सीएलएल मरीज के नमूनों में अलग-अलग चोटियों या डीएमआर को मैप किए जाने की संख्या को बढ़ाएं।
सब्रेड / बिन / फीचर कैट्स -क्यू 30-एफ एसएफ़ -ए डीएमआरएस। एएफ़ -ओ डीएमआरएसकाउंटसैटेबल सैमप्ले_टीएटमेंट.बैम एसएएमपीएल_सी.एस.
नोट: खराब-गुणवत्ता वाली पढ़ाई ( उदाहरण, -क्यू 30) की मात्रा को रोकने के लिए मैपिंग गुणवत्ता फ़िल्टर पेश किया जा सकता है। इस कदम के लिए, प्राप्त डीएमआर के लिए एसएएफ फाइलें तैयार करें। एसएएफ फ़ाइल प्रारूप के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया इस लिंक http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/ का उपयोग करें। - सामान्य ए में अलग-अलग चोटियों के लिए पढ़ने की संख्या वाले आरएडड पढ़ने-गिनती तालिका का उपयोग करेंडीएलएल रोगी के नमूने समूहों को बढ़त आर में इनपुट 16
नोट: सामान्य बनाम सीएलएल रोगी के नमूनों के समूहों की तुलना सिग्डम एमआरएस खोजने के लिए करें। अंतर संवर्धन विश्लेषण के लिए, विस्तृत चरण-दर-चरण निर्देशों के लिए किनारे से मार्गदर्शिका का पालन करें (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf)। - गलत खोज दर (एफडीआर) का इस्तेमाल करते हुए सीगडीएमआर को फ़िल्टर करें और किनारे से 16 अनुमानित लॉग-गुना परिवर्तन को फ़िल्टर करें।
- उपलब्ध एन्स्म्बल या जेनोकॉड ट्रांस्क्रिप्ट एनोटेशन (प्रोटीन-कोडिंग और नॉनकोडिंग प्रतिलिपियां) के साथ होमर "एनोटेटपेक्स.प्ल" की भविष्यवाणी की गई सिग्डम एमआर का एनोटेट।
एनोटेटपेक्स.पीएल sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <एनएसम्बल या जेनोकोड जीटीएफ> -सीपीजी
नोट: यह विभिन्न जैनिक क्षेत्रों ( यानी, प्रमोटर, एक्सॉन, इंट्रॉन, 3 'यूटीआर, और 5' यूटीआरएस) और इंटरजेनिक क्षेत्रों पर चोटियों के वितरण के बारे में जानकारी प्रदान करता है। सी के साथ जुड़े ट्रांसक्रिप्ट या जीनजीडीएमआर को सिगडीएमजी कहा जाता है - सीएलएल सिगडीएमजी (केवल प्रोटीन-कोडिंग जीन) द्वारा समृद्ध कार्यों को खोजने के लिए अद्यतित या वर्तमान कार्यात्मक डेटाबेस के साथ संवर्धन टूल का उपयोग करें 14
नोट: जीएनएससीएफ, कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण के लिए वास्तविक समय के उपकरणों में से एक है, संदर्भ डेटाबेस के रूप में केजीजी और जीन ओनेटोलोजी का उपयोग करता है।
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Representative Results
MBD-seq हाल ही में सीएलएल मरीजों और सीएलएल-विशिष्ट विभेदित हाइपर- और हाइपोमिथाइलेटेड जीन 7 की पहचान करने के लिए मिलान किए गए सामान्य, स्वस्थ नियंत्रणों पर प्रदर्शन किया है। सीएलएल और सामान्य स्वस्थ नमूनों से उत्पन्न डेटा का विश्लेषण करने के लिए प्रयोगात्मक और बायोइन्फोर्मेटिक पाइपलाइन चित्रा 1 ए और 1 बी में दिखाए गए हैं। इन विश्लेषकों ने कई सीएलएल-विशिष्ट भिन्न मिथाइलेटेड क्षेत्रों (सीएलएलडीएमआर) की पहचान की, जो कि पी-वैल्यू <0.00001 के नियंत्रण वाले नमूनों की तुलना में IGHV- उत्परिवर्तित और IGHV-unmutated नमूनों से काफी अधिक हाइपरथिलेटेड थे चित्रा 2 ए दोनों सामान्य बी-सेल और सामान्य पीएमबीसी तुलना से प्राप्त सभी क्लब्लडीएमआर दिखाती है। सभी क्लब्लडीएमआर को प्रोटीन कोडिंग और नॉनकोडिंग जीनों के विभिन्न वर्गों के लिए मैप किया गया था, जैसा कि चित्रा 2 बी में दिखाया गया है। महत्वपूर्ण रूप से, इस विश्लेषण में, तुलना को प्रतिरूप किया गया थासीएलएल रोगी के नमूनों के बीच स्वतंत्र रूप से मध्य, दो अलग-अलग सामान्य नियंत्रण, बी-सेल और पीएमबीसी सॉर्ट किए गए। दिलचस्प बात यह है कि सामान्य बी-सेल नियंत्रण और सामान्य पीबीएमसी नियंत्रण नमूनों ( चित्रा 2C ) की तुलना में, सीएलएल-विशिष्ट विभेदित मेथिलेटेड जीन (सीएलडीएमजी, 851 हाइपरथिलेटेड और 2,061 हाइपोमैथिलेटेड) के एक बड़े ओवरलैप के परिणामस्वरूप, ये सीएलडीएमजी हो सकते हैं बीमारी रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिकाओं के साथ संभव सीएलएल हस्ताक्षर जीन। विश्लेषण किए गए आंकड़ों को सुदृढ़ करने के लिए, एक हाइपरमथिलेटेड प्रोटीन कोडिंग जीन, स्कोर 1 , और एक हाइपोमैथिलेटेड लंबे नॉनकॉटिंग एलएनसीआरएनए, एसी 012065.7 में स्थित कई सीपीजी साइटें , पाइरोसेनिंगिंग पद्धति का उपयोग करके पुष्टि की गईं, जैसा कि पहले के प्रकाशन 7 , 17 , 18 में वर्णित हैं ( चित्रा 3 ए और बी )। चित्रा 4 चित्रा 4 डीएनए sheared showeredSonication प्रोटोकॉल के बाद खंडित डीएनए 150 और 300 बीपी के बीच है, जिससे यह क्रमिक उद्देश्यों के लिए आदर्श है।
चित्रा 1: इस अध्ययन में प्रयुक्त कार्य प्रवाह का अवलोकन। यह आंकड़ा, जो हमारे हालिया 7 प्रकाशन से प्राप्त किया गया है, संपूर्ण यूनिलीलेटेड क्षेत्रों (डीएमआर) को पुराने लिम्फोसाइटैटिक ल्यूकेमिया (सीएलएल) रोगी के नमूनों में पहचानने के लिए इस्तेमाल किए गए समग्र विश्लेषण के डिजाइन को दर्शाता है। ( ए ) मेथिलेटेड डीएनए के एमबीडी आधारित संवर्धन के प्रायोगिक डिजाइन। ( बी ) बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण पाइप लाइन सीएलएल-विशिष्ट भिन्न-भिन्न मेथिलेटेड क्षेत्रों (सीएलडीएमआर) की पहचान करने के लिए इस्तेमाल होती है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: सामान्य, स्वस्थ, सॉर्टेड बी सेल 7 के मुकाबले सीएलएल पेशी नमूनों के हायपरमैथिलेटेड और हाइपोमेथिलेटेड क्लब्लडीएमआर और क्लॉडीडीएमजी। ( ए ) सभी पुरानी लिम्फोसाइटैटिक ल्यूकेमिया (सीएलएल) - महत्वपूर्ण पी-वैल्यू (<0.00001) के साथ अलग-अलग मेथिलेटेड क्षेत्रों को मिलाकर सामान्य बी बी कोशिकाओं (ऊपरी पैनल) और सामान्य पीबीएमसी नमूनों के लिए IGHV- उत्परिवर्तित और अनम्यूट सीएलएल नमूनों की तुलना से प्राप्त किया गया (निचले पैनल)। हीटमैप में दिखाए गए संश्लेषण भिन्न-भिन्न मेथिलेटेड क्षेत्र (डीएमआर) से ± 3-केबी विंडो के भीतर थे। ( बी ) सीएनएल-विशिष्ट विभेदित मेथिलेटेड जीन (सीएलएलएमएमजी; हाइपरथिलेटेड और हाइपोमैथिलेटेड) IGHV- उत्परिवर्तित और IGHV- अनमुटेटेड समूह के बीच ओवरलैप दिखाने वाले वेन आरेख। पाई चार्ट विभिन्न वर्गीकरण से संबंधित जीनों का प्रतिशत दर्शाता है, जैसे कि प्रोटीन-कोडिंग, लंबे समय तक नॉन कोडिंग आरएनए (एलएनसीआरएनए), छद्मोजिनी, एंटीसेन्स और अन्य नॉनकोडिंग आरएनए। ( सी ) बी-सेल और पीबीएमसी तुलना के बीच सामान्य विभेदक मेथिलेटेड जीन (आईजीएचवी-उत्परिवर्तित और IGHV- अनमुटेटेड प्रॉग्निऑस्टिक ग्रुप) के ओवरलैप को दिखाने वाला वेन आरेख। वेन आरेख के बाएं पैनल में hypermethylated जीनों के लिए ओवरलैप और हाइपोमैथाइलेटेड जीन के लिए सही पैनल दिखाया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3: चयनित महत्वपूर्ण विभेदित मेथिलेटेड लक्ष्य जीनों पर व्यक्तिगत सीपीजी साइट्स के लिए डीएनए मेथिलैलेशन स्टेटस की मान्यता। स्वतंत्र जीर्ण लिम्फोसाइट का उपयोग करके दो चयनित जीन के लिए डीएनए मेथिलिकेशन के प्रतिशत की मात्रा का ठहराव करने के लिए डेटा को पिरोसेनिंग करनाआईसी ल्यूकेमिया (सीएलएल) नमूना पलटन जिसमें 54 नमूनों और 6 सामान्य, स्वस्थ, आयु-मिलान किए गए बी-सेल के नमूने हैं। ( ए ) बॉक्सप्लॉट हाइपरथिलेलेटेड स्कोर 1 जीन की 3 अलग-अलग सीपीजी साइट्स के लिए मेरोहेलेशन स्तर के प्रतिशत को दर्शाता है जो कि पीरोसेक्सेनिंग का उपयोग कर रहा है। ( बी ) बॉक्सप्लॉट पाइरो सक्सेन्सिंग का उपयोग करते हुए हाइपोमाइथिलेटेड एसी 012065.7 जीन की 5 व्यक्तिगत सीपीजी साइटों के लिए मेथिलैलेशन की डिग्री दर्शाती है। बक्से इंटरक्वैटाइल रेंज (25-75%) दर्शाते हैं, जबकि आंतरिक क्षैतिज रेखा मध्य मूल्य का संकेत देती है। मूंछ न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं सामान्य बी कोशिकाओं पर सीएलएल नमूनों के विभेदक मेथिलिकेशन की डिग्री के अनुरूप पी-वैल्यू प्रत्येक व्यक्तिगत सीपीजी साइट के लिए बॉक्सप्लेट में दिखाया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
MBD-seq एक लागत प्रभावी, immunoprecipitation- आधारित तकनीक है जिसका उपयोग पूरी जीनोम-व्यापी कवरेज के साथ मेथिलैशन पैटर्न का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। सीपीजी-समृद्ध मिथाइलेटेड डीएनए के संवर्धन में मेडीआईप सेक (मैथिलेटेड डीएनए इनिमोनोपेरिजिज के बाद क्रमिक रूप से पीछा किया गया) और एमबीडी-सीक परिणाम दोनों। हालांकि, एमडीडी-सीक मेडीआईपी सीक 1 9 की तुलना में अत्यधिक सीपीजी-समृद्ध क्षेत्रों के लिए बाइंडिंग के प्रति अधिक आकर्षण दिखाता है। मिथाइल-बाध्यकारी संवर्धन किट का उपयोग करके, डीएनए को उच्च-सीपीजी- और निम्न-सीपीजी-समृद्ध क्षेत्रों में क्रमशः उच्च नमक और निम्न नमक बफ़र्स के साथ डीएनए को अलग कर सकते हैं। इस जांच में, सीपीजी द्वीपों के अधिकांश भाग को कवर करने वाले अत्यधिक समृद्ध सीपीजी-समृद्ध क्षेत्रों पर कब्जा करने के लिए केवल एक अंश अंश क्षीणन किया गया था।
MBD-seq WGBS के लिए एक शक्तिशाली विकल्प हो सकता है, जो आमतौर पर सीएलएल और अन्य लेकिमिया जांच में उपयोग किया जाता है। भले ही MBD-seq को bisulfite की तुलना में इनपुट डीएनए की अपेक्षाकृत अधिक मात्रा की आवश्यकता होती हैरूपांतरण-आधारित विधियों, यह वैश्विक मेथिलिलेशन परिवर्तन की जांच के लिए अनुमति देता है जो रूपांतरण के बाद बनाए गए किसी भी पीसीआर प्रवर्धन पूर्वाग्रह के बिना केवल 5 एमसी संशोधनों के लिए विशिष्ट हैं। इस प्रकार, एमबीडी-सीईक क्लालडीएमजी को संबोधित करने के लिए एक आदर्श तरीका है, जो भविष्यवाणी मूल्य के साथ संभावित एपिनेटिक-आधारित सीएलएल हस्ताक्षर जीन हो सकता है।
इस विधि को निष्पादित करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं बाध्यकारी प्रतिक्रिया से पहले उपयोग किए गए विखंडित डीएनए की गुणवत्ता और ध्वनि का रेंज। सभी नमूने 150 और 300 बीपी ( चित्रा 4 ) के बीच छोटे टुकड़े पर्वतमाला दिखाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अच्छी गुणवत्ता वाले अनुक्रमण परिणाम होते हैं, डेटा फ़िल्टर और सफाई के बाद जीनोम के प्रत्येक नमूना मानचित्रण के लिए लगभग 25-33 मिलियन अद्वितीय पढ़ता है।
अंत में, एक स्वतंत्र नमूना काउहर्ट में पाइरो सिक्वेंसिंग विधि का उपयोग करते हुए कुछ जीन के लिए हाइपर- और हाइपोमाइथिलेटेड क्लब्लडीएमजी की मेथिलिकेशन स्थिति को मान्य किया गया है। इस पद्धति का अर्थ देता हैडीएनए मेथिलिकेशन का न्टेज, सी-टी-टी के अनुपात पर सी-जी-टी के अनुपात के आधार पर, अनुक्रम एक्सटेंशन के दौरान सी और टी की मात्रा के आधार पर आधारित होता है। सामान्य नमूनों की तुलना में हाइपरमैथिलेटेड क्लब्लडीएमजी ने सीएलएल नमूनों में मेथिलिकेशन के उच्च प्रतिशत दिखाए। इसी तरह, हाइपोमथिलेटेड क्लब्लडीएमजी ने विपरीत दिखाया। दो क्लब्लडीएमजी के लिए पाइरोसेनिंग डेटा को चित्रा 3 में दिखाया गया है।
सरणी-आधारित तरीकों की तुलना में, यह विधि जीनोम में अनुक्रमों की व्यापक परीक्षा के लिए अनुमति देता है, जिसमें प्रोटीन-कोडिंग क्षेत्र फैले जाने वाले पहले एनोटेटेड क्षेत्रों और दोहरावदार तत्वों और एलएनसीआरएनए फैले हुए गैर-एनोटेट अनुक्रम शामिल हैं। इस प्रकार, सीएलएल मरीजों पर इस दृष्टिकोण ने एलएनसीआरएनए और पुनरावृत्त तत्वों के फैले कई उपन्यास सीएलडीएमजी जी की पहचान की। चूंकि ये जांच सीएलएल के रोगी के नमूनों में पहले नहीं की गई है, इसलिए यह अध्ययन सीएलएल-संबंधित विभेदित मिथाइलेटेड क्षेत्रों की पहचान करने के लिए एक बहुमूल्य संसाधन के रूप में कार्य करता है।विभिन्न पूर्वकथात्मक उपसमूह ये क्लब्लडीएमजी उपनगरीय बायोमार्कर के रूप में काम करेंगे और एपिगेनेटिक ड्रग थेरेपी के लिए लक्ष्य बनाएंगे।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को स्वीडिश अनुसंधान परिषद, स्वीडिश कैंसर सोसाइटी, नूट और एलिस वॉलनबर्ग फाउंडेशन (के.ए.डब्ल्यू।), और एफओयू वैस्ट्रा गॉटलैंड्सियनियन द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
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