Summary
Dette arbeidet beskriver en optimalisert metyl-CpG-bindingsdomene (MBD) sekvenseringsprotokoll og en beregningsrørledning for å identifisere differensielt metylerte CpG-rike regioner hos pasienter med kronisk lymfocytisk leukemi (CLL).
Abstract
Rollen av lange, ikke-kodende RNAer (lncRNAs) i kreft, kommer frem i forkant på grunn av økende interesse for å forstå deres mekaniske funksjoner under kreftutvikling og progresjon. Til tross for dette har den globale epigenetiske reguleringen av lncRNA og repetitive sekvenser i kreft ikke blitt godt undersøkt, særlig i kronisk lymfocytisk leukemi (CLL). Denne studien fokuserer på en unik tilnærming: immunpresipitasjonsbasert fangst av dobbeltstrengede, metylerte DNA-fragmenter ved bruk av metyl-bindende domene (MBD) proteiner, etterfulgt av neste generasjons sekvensering (MBD-seq). CLL pasientprøver som tilhørte to prognostiske undergrupper (5 IGVH-muterte prøver + 5 IGVH ikke-mutaterte prøver) ble brukt i denne studien. Analyse avslørte 5.800 hypermetylerte og 12.570 hypometylerte CLL-spesifikke differensielt metylerte gener (cllDMGs) sammenlignet med normale friske kontroller. Viktigst, disse resultatene identifiserte flere CLL-spesifikke, differensielt metylerte lncRNAer, rePetitive elementer og proteinkoding gener med potensiell prognostisk verdi. Dette arbeidet skisserer en detaljert protokoll for en MBD-seq og bioinformatikk pipeline utviklet for omfattende analyse av globale metyleringsprofiler i svært CpG-rik regioner ved bruk av CLL pasientprøver. Endelig ble et proteinkoding-gen og et lncRNA validert ved bruk av pyrosequensering, som er en svært kvantitativ metode for å analysere CpG-metyleringsnivåer for ytterligere å bekrefte funnene fra MBD-seq-protokollen.
Introduction
Bruken av neste generasjons sekvenseringsteknikker for å analysere globale DNA-metyleringsprofiler har blitt stadig mer populært de siste årene. Genome-brede metyleringsanalyser, inkludert mikroarray- og ikke-mikroarray-baserte metoder, ble utviklet basert på følgende: bisulfittomdannelsen av genomisk DNA, metyleringsfølsomme restriksjonsenzymfordøyninger og immunutfelling av metylert DNA ved bruk av metyl-CpG-spesifikke antistoffer .
Aberrant DNA-metylering er et kjennetegn ved leukemi og lymfomer, inkludert kronisk lymfocytisk leukemi (CLL). Tidligere har flere grupper inkludert vår karakterisert DNA-metyleringsprofilene av forskjellige CLL-prognostiske undergrupper og normale, sunne B-cellekontroller ved bruk av bisulfitt-omdannelsen av genomisk DNA, etterfulgt av mikromarbaserte metoder eller helgenomsekvenser 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. Bisulfittomdannelsen av genomisk DNA fører til deaminering av umodifiserte cytosiner til uracil, hvilket etterlater de modifiserte metylerte cytosiner i genomet. Når de er omdannet, kan metyleringsstatusen til DNA'et bestemmes ved PCR-amplifisering og sekvensering under anvendelse av forskjellige kvantitative eller kvalitative metoder, som for eksempel mikromarraybasert eller helgenoms-bisulfitt-sekvensering (WGBS). Selv om bisulfitt-konverteringsbaserte metoder har mange fordeler og er mye brukt i forskjellige krefttyper for å analysere DNA-metyleringsnivåer, er det noen ulemper forbundet med denne teknikken. WGBS-sekvensering tillater enkelbasbasert oppløsning med lavere mengder DNA og er det beste egnet alternativet for å analysere et stort antall prøver. Imidlertid unnlater denne metoden å skille mellom modifikasjonene mellom 5mC og 5hmC nivåene i genomene 5 , 6 . I tillegg tilbyr ikke mikroarray-baserte metoder komplett cOverage av genomet.
I en nylig studie fra laboratoriet 7 ble immunoprecipitasjonsbaserte metoder, i stedet for bisulfittkonvertering, brukt til å identifisere svært CpG-rike, differensielt metylerte regioner i global skala hos CLL-pasienter og normale sunne kontroller. Inmethyl-CpG-bindende domene (MBD) neste generasjons sekvensering (MBD-seq) avhenger anrikningen av dobbeltstrenget fragmentert DNA av graden av CpG-metylering. Denne metoden kan overvinne ulempene ved bisulfitt-omdannelsesmetoden og kan også gi genomfattende dekning av CpG-metylering på en upartisk og PCR-uavhengig måte. I motsetning til bisulfitt-konverteringsbaserte mikroarray-metoder kan MBD-seq også brukes til å analysere metyleringsstatusen for repeterende elementer, for eksempel lange interspersed-kjernefysiske elementer (LINE), korte intersperserte kjernefysiske elementer (SINEs), lange terminale repetisjoner (LTRS), Etc. Imidlertid, sammenlignet med bisulfittomdannelsesmetoder,En MBD-seq-protokoll krever en relativt stor mengde inngangsd DNA. Også kvaliteten på sekvenseringen leser og dataene avhenger av spesifisitet, affinitet og kvalitet av antistoffene som anvendes.
Den nåværende studien forklarer en detaljert MBD-seq-protokoll for å berikke metylert DNA for neste generasjons sekvensering. Den bruker et kommersielt metylert DNA-bindingsberikningssett (oppført i Materialetabellen ), samt en beregningsrørledning for å visualisere og tolke metylerings-sekvenseringsdata for å identifisere CLL-spesifikke hyper- og hypomethylerte regioner sammenlignet med normale sunne kontroller. I utgangspunktet benytter denne metoden muligheten til MBD av humant MBD2-proteininteraksjon med metylerte CpGer for å ekstrahere DNA beriget med metylerte CpGer, og dette følges av høy gjennomstrømningssekvensering av metylert DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den etiske godkjenningen for å samle CLL-prøvene er fra 2007-05-21, med følgende registreringsnummer: EPN Gbg dnr 239/07. Alle CLL-pasienter ble diagnostisert i henhold til nylig revidert kriterium 8 , og prøvene ble samlet på diagnosetidspunktet. Pasientene i studien ble inkludert fra forskjellige hematologiavdelinger i den vestlige delen av Sverige etter skriftlig samtykke. Bare prøver av CLL perifert blodmononukleær celle (PBMC) med en tumorprosent av leukemic celler ≥70% ble valgt i denne studien.
1. Forberedelser
- Isolere PBMC for DNA-ekstraksjoner fra CLL og normale, sunne perifere blodprøver ved hjelp av et kommersielt isolasjonssett (se Materialebordet ), i henhold til produsentens anvisninger.
- Autoklav 1,5 ml rør. Tine alle reagenser i det metylerte DNA-bindingssettet (se Materialetabellen ). </ Li>
- Bruk DNase-fritt vann for å fremstille 10 ml 1x perlevaskebuffer fra 5x lagervaskebufferen forsynt av settet for å vaske perler og fortynne MBD-proteinet som leveres av settet.
- Hent eller forberede følgende varer på forhånd: 3 M natriumacetat, absolutt etanol og 70% etanol for DNA-utfelling ( Materialebord ).
2. Genomisk DNA-ekstraksjon og sonikering
- Bruk et kommersielt tilgjengelig DNA-ekstraksjonssett ( Materialebord ) for å isolere genomisk DNA fra pasient- og normale PBMC-prøver i henhold til produsentens protokoll. Kvantifiser det genomiske DNA ved bruk av et spektrofotometer ved 260 nm.
MERK: DNA-ekstraksjonskolonnekapasiteten er 5-6 millioner celler, maksimum; Derfor er det viktig å bruke mer enn en kolonne for prøver med mer enn 5 millioner celler. Eliminer DNA-en to ganger i like mengder totalt 100 μl 10 mM Tris EDTA (TE) buffer. MBD-biotinproteinet som anvendes i metylenMiner-kit for MBD-sekvensering vil ikke binde til enkeltstrenget DNA. Således er det svært viktig å holde det eluerte DNA enten fryst eller ved 4 ° C for å bevare sin dobbeltstrengede natur. - Fortynn 5 μg genomisk DNA fra hver prøve til totalt 200 μl ved å bruke TE-buffer (pH 8), hvilket gir en sluttkonsentrasjon på 25 ng / μl.
- Utfør sonikering i spesialdesignede rør ved hjelp av en sonikator ( Materialebord ) i totalt 30 sykluser (30 s på og 30 s av hver syklus, etter hver 5 sykluser, roter rørene kort for å samle prøvene til bunnen).
MERK: Dette vil produsere fragmentert DNA som varierer mellom 150 bp og 300 bp, noe som er optimalt for denne protokollen. - Kontroller sonikasjonsområdet for alle prøvene før du går videre til neste trinn for MBD-sekvensering ved å kjøre 1 μl av fragmenterte DNA-prøver og en DNA-størrelse-stige på en kommersielt tilgjengelig, forhåndstøpt 2% agarosegel ved bruk av DNA-elektroforese-bildeutstyr. Visualiser tHan DNA ved hjelp av en standard UV transilluminator.
3. Beadpreparasjon før bindingen med MBD-biotinprotein
- Resuspender de magnetiske streptavidinperlene fra lagerrøret forsynt av settet, forsiktig pipettering opp og ned for å oppnå en homogen suspensjon. Ikke vortex perlene eller la dem tørke.
- Plasser 50 μl perler (for hver 5 μg fragmentert DNA-prøve) i separate, rene og merkede 1,5 ml rør. Tilsett 50 μl 1x perlevaskbuffer for å nå det endelige volumet på 100 μl.
MERK: Ved bruk av små 0,5 ml polymerase kjedereaksjons-striper for vasking av perler, brukes rundt 150-200 μl vaskebuffer per rør, som nevnt i kit-protokollen. Imidlertid, når det gjelder 1,5 ml rør, tilsett minst 250 μl til 300 μl vaskebuffer per rør for perlvaskingen. - Plasser rørene på et magnetisk stativ i ett minutt for å la alle magnetiske perler konsentrere seg på rørets indre veggVender mot magneten. Fjern væsken, uten å berøre perlene, ved hjelp av en pipette på 200 μL.
- Fjern rørene fra magnetstativet, tilsett 250 μl 1x perlevaskbuffer, og bland forsiktig med en pipette.
- Gjenta trinn 3.3 og 3.4 minst 4-5 ganger for alle prøvene og til slutt resuspendere i 250 μl 1x perlevaskbuffer. Hold dem på is.
4. Binding av MBD-biotinproteinet til de vaskede perlene
- Tilsett 35 μL MBD protein (7 μL for 1 μg DNA-prøve) for å skille rør og bring totalvolumet opp til 250 μl ved å bruke 1x perlevaskbuffer.
- Tilsett 250 μl fortynnet MBD-protein til 250 μl vasket perler og la dem gå på ende-til-ende-rotasjon ved romtemperatur i 1 time.
- Etter blanding av perler og protein i 1 time, vask MBD proteinbiotinet bundet med magnetiske streptavidinperler.
- Plasser rørene på magnetisk stativ i 1 min og fjern tHan væsker uten å berøre perlene ved hjelp av en pipette. Tilsett 250 μl 1x perlevaskbuffer og plasser rørene på en rotasjonsblander i 5 minutter ved romtemperatur.
- Gjenta trinn 4.3.1 to ganger, og til slutt resuspenge de vasket MBD-biotinperlene i 200 μl 1x perlevaskbuffer, slik at perlene er klare for metylert DNA-fangst.
MERK: Vask 2-3 ganger på denne måten fjerner all bakgrunnen ubundet MBD proteinperler og forbedrer effektiv binding av MBD-proteinkoblede perler med fragmentert genomisk DNA.
5. Bindende MBD-biotinperler med fragmentert genomisk DNA
- I et rent 1,5 ml DNase-fritt rør tilsettes 100 μl 5x perlevaskbuffer og 180 μl av fragmentert genomisk DNA (trinn 2.3). Ta sluttvolumet til 500 μl ved bruk av DNase-fritt vann.
- Tilsett 380 μL DNase-fri vann til de resterende 20 μl av det fragmenterte genomiske DNA og frys dem. Bruk disse prøvene som input DNEn kontroller og utfelling dem senere sammen med de endelige eluerte metylerte DNA-prøver (se trinn 7.1).
- Plasser rørene som inneholder vasket MBD-biotinperler (trinn 4.4) på et magnetisk stativ i 1 min og fjern væsken uten å forstyrre perlene. Tilsett 500 μl fragmentert genomisk DNA fortynnet i perlevaskbuffer.
- Tett alle rørene tett med parafinfilmen og la dem overnatte ved 4 ° C på en ende-til-ende rotasjonsstand ved 8-10 omdreininger per minutt.
MERK: DNA- og biotin-beadbindingsreaksjonen kan gjøres i 1 time ved romtemperatur, men etterlater den ved 4 ° C over natten kan forbedringen av det endelige metylerte DNA forbedres.
6. Fjerning av det ubundne DNA og fjerning av metylert DNA fra perlene
- Etter DNA- og MBD-vulstbindingsreaksjonen, plasser rørene på magnetstativet i 1 min for å konsentrere alle perlene på rørets indre vegg.
- Fjern supernatantvæsken med en pipette uten å berørePerlene og lagre denne ubundne DNA-prøvefraksjonen på is.
- Legg til 200 μl 1x perlevaskbuffer til perlene og plasser rørene på roterende stativ i 3 minutter ved romtemperatur. Plasser rørene på magnetisk stativ og fjern væsken. Gjenta vasken ytterligere to ganger for å fjerne gjenværende ubundet DNA.
- Etter den endelige vasken, tilsett 200 μl høysalt-elueringsbuffer (2000 mM NaCl), gitt i settet for å eluere DNA.
- Plasser rørene på roterende stativ i 15 minutter ved romtemperatur. Plasser dem på magnetisk stativ i 1 min og bruk en pipette for å forsiktig overføre supernatanten til et nytt, rent 1,5 ml rør.
- Tilsett 200 μl høysalt-elueringsbuffer og gjenta elueringen ved å rotere rørene ved romtemperatur i 15 minutter. Tilsett den andre elueringen til samme rør som inneholder 200 μl av den første elueringen.
MERK: Den endelige 400 ul total eluert DNA er nå klar for etanolutfelling for å ekstrahere den rensedeDNA egnet for neste generasjons sekvensering.
7. Etanolutfelling og anrikning av metylert DNA
- Tilsett 1 μl glykogen (20 μg / μL; inkludert i settet); 40 ul 3 M natriumacetat, pH 5,2; Og 800 ul iskold absolutt etanol til 400 ul eluert DNA og også til 400 μl inngangs-DNA-prøver fremstilt i trinn 5.2.
- Bland rørene godt ved vortexing og inkuber dem ved -80 ° C over natten.
- Sentrifuger rørene ved 12.000 xg (maksimal hastighet) og 4 ° C. Kast supernatanten forsiktig ut, uten å forstyrre pelleten, tilsett 500 μl 70% etanol og vortexrørene.
- Sentrifuger igjen med maksimal hastighet i 15 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten ved å forsiktig bruke en pipette. Sentrifuger rørene med maksimal hastighet i 1 min ved romtemperatur og fjern resterende etanol helt ved hjelp av en pipettespiss.
- Luft-tørk pelleten i 5 minutter på rommet temperature. Tilsett 10 μl DNase-fri vann til DNA-pellet. Fortsett til den metylerte DNA-kvantifiseringen (trinn 7.6), MBD-sekvensering (trinn 7.7) og analyse (avsnitt 8 og 9).
- Kvantifiser de endelige gjenvunnet metylerte DNA-prøvene ved å bruke et kommersielt tilgjengelig fluorometrisk kvantifiseringssett (se Materialebordet ), i henhold til produsentens anvisninger.
- Merk: Ved bruk av denne protokollen ble 30-50 ng slutt DNA gjenvunnet fra hver prøve. DNA-prøver er klare til å sende på tøris for nedstrøms bibliotekskonstruksjon og MBD-sekvensering med høy gjennomstrømning
- Utfør DNA-bibliotekskonstruksjon og MBD-sekvensering med høy gjennomstrømning ved bruk av en kommersiell plattform ( Materialebord ), som beskrevet i referanse 9 .
MERK: For opprinnelig kvalitetskontroll av det endelige metylerte DNA, utfør bibliotekspreparater ved å bruke 50-bp par-end-sekvensering for alle prøver. Behandle de rå dataene for kvalitetskontroll etter sekvensering, aS utarbeidet i trinn 8.1, og videre behandle det ved hjelp av bioinformatikk tilnærminger og statistiske metoder, som beskrevet nedenfor (trinn 8.2-9.6).
8. Bioinformatikkanalyse Metode 1: Identifisering av CLL-assosierte differensielt metylerte regioner (cllDMRs)
- Rengjør den oppnådde 49-bp-lesingen (FASTQ-format) for adaptere som bruker tilgjengelige kvalitetsstyringsverktøy, for eksempel Trimmomatic 10 eller Cutadapt. Kryss av kvaliteten på den trimmede lesingen ved hjelp av FastQC-verktøyet:
Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adapters.fasta: 2: 30: 10 - Juster de rensede FASTQ-filene med kortlest genom-juster Bowtie mot et referansegenom 11 . Angi parametrene som nedenfor:
- Tillat opptil to feilmatchinger (Bowtie parameter: -v 2).
- Begrens rapporteringen til de seks beste justeringene per les (Bowtie parameter: -m 6) for å kontrollereFor multi-mapping leser.
Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq> SAMPLE.sam
MERK: Konverter SAM-filene som er generert for individuelle prøver etter justering til BAM ved hjelp av SAMtools.
Samtools view -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam
- Bruk den modellbaserte analysen av ChIP-Seq (MACS) toppoppringeren på justerte prøver (BAM) for å forutsi berikte / metylerte regioner fra CLL-undergruppene 12 .
MERK: Sammenligning I: Bruk Input-prøven som kontrollgruppe og både Normal- og CLL-pasientprøver som behandlingsgrupper. Dette trinnet er å samle alle negative toppene (topper beriket i Input / Background). Sammenligning II: Bruk den normale prøvegruppen som kontrollgruppe og CLL-pasientprøvegruppen som behandlingsgruppe. Oppnådde positive topper er CLL hypermetylerte områder, og negative topper er CLL-hypometylerte regioner over normale eller differensielt metylerte regioner (DMRer).
macs14-t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs - Fjern sammenligning I bakgrunnstopper fra differensielt metylerte områder (DMRer) ved hjelp av BEDtools 13 .
Bedtools trekker -a <CLL_enriched_regions> -b <Input_enriched_regions> - Forutsi prosentandelen av repeteringselementer (SINE-Alu, LINE, etc. ) beriket i DMR.
- Bruk fastacmd til å trekke ut FASTA-sekvensen av DMR med de kromosomale koordinatene fra referansegenomet HG19.
Fastakmd -d HG19_genome.fa-s kromosom -L Start, slutt -l 50000> DMRs.fasta - Bruk RepeatMasker-kommandolinjeverktøyet til å forutsi prosentandelen av gjentatte elementer som er tilstede i FASTA-sekvensen av DMR.
RepeatMasker -gc -gccalc -s -species human -html DMRs.fasta
- Bruk fastacmd til å trekke ut FASTA-sekvensen av DMR med de kromosomale koordinatene fra referansegenomet HG19.
- Noter de forutsagte DMRene ved å bruke Homer "annotatePeaks.pl" med tilgjengelig Ensembl [PMC4919035] oR Genkode [PMID 22955987] transkripsjonsannotasjon (proteinkoding og ikke-kodende transkripsjoner).
AnnotatePeaks.pl DMRs.bed <GENOME> -gtf <Ensembl eller Gencode GTF>
MERK: Dette gir informasjon om fordelingen av topper over forskjellige geniske regioner ( dvs. promotor, exon, intron, 3 'UTR og 5' UTR) og intergeniske regioner. Transkripsjoner eller gener forbundet med DMRs kalles differensielt metylerte gener (DMGer). - Bruk anrikingsverktøyet med den oppdaterte eller nåværende funksjonelle databasen for å finne funksjoner beriket av CLL DMGs (bare proteinkoding gener) 14 .
MERK: Gene Set Clustering basert på Functional Annotation (GeneSCF) 14 er et sanntidsbasert verktøy for funksjonell anrikningsanalyse som bruker oppdatert KEGG og Gene Ontology som en referansedatabase.
9. Bioinformatikkanalyse Metode 2: Identifisering av CLL-assosiert signifikant diffErmentert metylerte regioner (cll sigDMRs)
- Følg trinnene 8.1-8.5 fra metode I (kapittel 8) og bruk avlesningsbasert differensialberigelsesanalyse ved å bruke de tilgjengelige verktøyene, som utarbeidet i trinnene 9.2 - 9.6, for å legge til et nytt nivå av statistikk til analysepipeline.
- Kvantifiser antall leser kartlagt til individuelle topper eller DMR i Normal og CLL pasientprøver ved hjelp av "featureCounts" fra "Subread" pakken 15 .
Subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
MERK: Et kartleggingskvalitetfilter kan innføres for å unngå kvantifisering av dårlig kvalitet leser ( f.eks. -Q 30). For dette trinnet, utarbeide SAF-filer for de innhentede DMRene. For mer informasjon om SAF filformat, vennligst bruk denne linken http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/. - Bruk en RAW read-count tabell som inneholder antall leser for de enkelte toppene i Normal anD CLL pasientprøvegrupper i kantR som inngang 16 .
MERK: Sammenlign normale versus CLL-pasientprøvegrupper for å finne sigDMRs. For differensiell berikningsanalyse, følg veiledningen fra edgeR for detaljerte trinnvise instruksjoner (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). - Filtrer sigDMRs ved hjelp av den falske oppdagelsesfrekvensen (FDR) og log-fold-forandringen spådd av edgeR 16 .
- Noter de forutsagte sigDMR'ene ved å bruke Homer "annotatePeaks.pl" med den tilgjengelige Ensembl- eller Gencode-transkripsjonsannotasjonen (proteinkoding og ikke-kodende transkripsjoner).
AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <Ensembl eller Genkode GTF> -CpG
MERK: Dette gir informasjon om fordelingen av topper over forskjellige geniske regioner ( dvs. promotor, exon, intron, 3 'UTR og 5' UTR) og intergeniske regioner. Transkripsjoner eller gener forbundet med siGDMRs kalles sigDMGs. - Bruk et berikningsverktøy med den oppdaterte eller nåværende funksjonelle databasen for å finne funksjoner beriket av CLL sigDMGs (bare proteinkoding gener) 14 .
MERK: GeneSCF, en av sanntidsverktøyene for funksjonell anrikningsanalyse, bruker KEGG og Gene Ontology som referansedatabaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MBD-seq ble nylig utført på CLL-pasienter og matchede, normale, sunne kontroller for å identifisere CLL-spesifikke differensielt hyper- og hypometylerte gener 7 . Den eksperimentelle og bioinformatiske rørledningen som brukes for å analysere dataene som er generert fra CLL og normale sunne prøver, er vist i figur 1A og 1B . Disse analysene identifiserte flere CLL-spesifikke differensielt metylerte regioner (cllDMRs), som var signifikant hyper / hypometylert fra IGHV-muterte og IGHV-ikke-mutaterte prøver sammenlignet med kontrollprøver med p-verdi <0.00001. Figur 2A viser alle cllDMRer oppnådd fra både normale B-celle og normale PMBC-sammenligninger. Alle cllDMRene ble kartlagt til forskjellige klasser av proteinkoding og ikke-kodende gener, som vist i figur 2B . Viktig, i denne analysen var sammenligningene perforMed uavhengig mellom CLL pasientprøver, med to forskjellige normale kontroller, sorterte B-celler og PMBCer. Interessant resulterte analysen i en stor overlapping av vanlige CLL-spesifikke differensielt metylerte gener (cllDMGs, 851 hypermetylert og 2,061 hypometylert) sammenlignet med normal B-cellekontroll og normale PBMC-kontrollprøver ( Figur 2C ), noe som tyder på at disse cllDMGene kan være Mulige CLL signaturgener med signifikante roller i sykdomspatogenese. For å styrke de analyserte dataene ble flere CpG-steder lokalisert i et hypermetylert proteinkoding-gen, SKOR1 og en hypometylert lang ikke-kodende lncRNA, AC012065.7 , validert ved bruk av en pyrosequensemetode, som beskrevet i tidligere publikasjoner 7 , 17 , 18 ( figur 3A Og B ). Figur 4 viser skjæret DNAEtter sonikeringsprotokollen. Det fragmenterte DNA varierer mellom 150 og 300 bp, noe som gjør det ideelt for sekvenseringsformål.
Figur 1: Oversikt over arbeidsflyten brukt i denne studien. Denne figuren, hentet fra vår siste publikasjon 7 , viser utformingen av den overordnede analysen som ble brukt for å identifisere differensielt metylerte regioner (DMR) i pasientprøver med kronisk lymfocytisk leukemi (CLL). ( A ) Eksperimentell utforming av den MBD-baserte anrikningen av metylert DNA. ( B ) Analysepipeline for bioinformatikk brukes til å identifisere CLL-spesifikke differensielt metylerte regioner (cllDMRs). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Hypermetylerte og hypometylerte cllDMRer og cllDMGer av CLL-pasientprøver sammenlignet med normale, sunne, sorterte B-celler 7 . ( A ) Alle kroniske lymfocytiske leukemi (CLL) -associerte differensielt metylerte regioner med signifikante p-verdier (<0.00001) oppnådd ved sammenligning av de IGHV-muterte og -mututiserte CLL-prøver til normalt sorterte B-celler (øvre panel) og normale PBMC-prøver (Nedre panel). Berikelsene vist i varmekartet var innenfor et ± 3-kb vindu fra differensielt metylert område (DMR). ( B ) Venn-diagram som viser overlappingen av CLL-spesifikke differensielt metylerte gener (cllDMGs, hypermetylert og hypometylert) mellom IGHV-muterte og IGHV-ikke-mutaterte grupper. Kakediagrammet representerer prosentandelen av gener som tilhører forskjellige klassifiseringer, for eksempel proteinkoding, Lang ikke-kodende RNA (lncRNA), pseudogener, antisense og andre ikke-kodende RNAer. ( C ) Venn-diagram som viser overlappingen av vanlige differensielt metylerte gener (IGHV-muterte og IGHV-ikke-mutaterte prognostiske grupper) mellom B-celle og PBMC sammenligninger. Det venstre panelet på Venn-diagrammet viser overlappingen for hypermetylerte gener og det høyre panelet for hypometylerte gener. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Validering av DNA-metyleringsstatus for individuelle CpG-steder på de valgte signifikant differensielt metylerte målgener. Pyroserende data for kvantifisering av prosentandelen av DNA-metylering for to utvalgte gener ved bruk av et uavhengig kronisk lymfocyttIc leukemie (CLL) prøve kohort som inneholder 54 prøver og 6 normale, sunne, aldersbestemte B-celleprøver. ( A ) Boxplottene representerer prosentandelen metyleringsnivåer for 3 individuelle CpG-steder i det hypermetylerte SKOR1- genet ved bruk av pyrosequensering. ( B ) Boxplot viser graden av metylering for 5 individuelle CpG-steder av hypometylert AC012065.7- gen ved bruk av pyrosequencing. Boksene angir interkvartileområdet (25-75%), mens den indre horisontale linjen indikerer medianverdien. Whiskers representerer minimums- og maksimumsverdiene. P-verdien som tilsvarer graden av differensiell metylering av CLL-prøver over normale B-celler, vises i boksplottene for hvert enkelt CpG-sted. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MBD-seq er en kostnadseffektiv, immunprecipitasjonsbasert teknikk som kan brukes til å studere metyleringsmønstre med fullstendig gjennomsiktig dekning. Både MeDIP-seq (metylert DNA-immunutfelling etterfulgt av sekvensering) og MBD-seq resulterer i anrikning av CpG-rik metylert DNA. Imidlertid viser MBD-seq mer affinitet mot binding til høyt CpG-rik-regioner når sammenlignet med MeDIP-seq 19 . Ved å bruke et metylbindende anrikningssett kan man fraksjonere DNAet til høy CpG- og lav-CpG-rike regioner ved å eluere DNA med henholdsvis høyt salt og lavt saltbuffer. I denne undersøkelsen ble det kun utført en enkeltfraksjoneluering for å fange høyt berikede CpG-rike regioner som dekker de fleste CpG-øyene.
MBD-seq kan være et kraftig alternativ til WGBS, som vanligvis brukes i CLL og andre leukemi undersøkelser. Selv om MBD-seq krever relativt høyere mengder inngangsd DNA i forhold til bisulfittKonvertering-baserte metoder, tillater det utredning av globale metyleringsendringer som er spesifikke bare for 5 mC modifikasjoner uten PCR-amplifikasjons-bias opprettet etter konvertering. MBD-seq er således en ideell metode for å adressere cllDMG, som kan være potensielle epigenetisk-baserte CLL signaturgener med prognostisk verdi.
De avgjørende faktorene for utførelse av denne metoden er kvaliteten og sonikasjonsområdet for fragmentert DNA som brukes før bindingsreaksjonen. Alle prøver viste kortere fragmenter, mellom 150 og 300 bp ( figur 4 ), noe som resulterte i resultater av god kvalitet, med rundt 25-33 millioner unike leser for hver prøvekartlegging til genomet etter datafiltrering og rengjøring.
Endelig er metyleringsstatusen for hyper- og hypometylerte cllDMGer validert for få gener ved bruk av en pyrosequensemetode i en uavhengig prøvekonsort. Denne metoden gir perceAvhengig av forholdet mellom C-to-T på individuelle CpG-steder basert på mengden C og T innlemmet under sekvensutvidelsen. De hypermetylerte cllDMGene viste høye prosenter av metylering i CLL-prøver sammenlignet med de normale prøver. På samme måte viste de hypometylerte cllDMGene det motsatte. Pyrosequencing data for to cllDMGs er vist i figur 3 .
Sammenlignet med array-baserte metoder, tillater denne metoden bredere undersøkelse av sekvenser over genomet, inklusiv tidligere annoterte regioner som spenner over proteinkodende regioner og ikke-annoterte sekvenser som spenner over repeterende elementer og lncRNAer. Dermed identifiserte denne tilnærmingen på CLL-pasienter flere nye cllDMGer som spenner over lncRNA og repeterende elementer. Siden disse undersøkelsene ikke har blitt utført tidligere i CLL-pasientprøver, tjener denne studien som en verdifull ressurs for å identifisere CLL-assosierte differensielle metylerte regioner iForskjellige prognostiske undergrupper. Disse cllDMGene vil tjene som nye biomarkører og mål for epigenetisk medisinering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Svenske Forskningsrådet, Svenske Kreftforeningen, Knut og Alice Wallenberg Foundation (KAW), og FoU VästraGötalandsregionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
- Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
- Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
- Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
- Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
- De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
- Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
- Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).
