このプロトコルは、 求愛条件付けと呼ばれるショウジョウバエ学習および記憶アッセイを記載する。この古典的なアッセイは、非受容性の前処理された女性による性的拒絶反応後の男性の求愛行動の減少に基づく。この自然な形の行動可塑性は、学習、短期記憶、および長期記憶を試験するために使用することができる。
ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)などのモデル生物における単純な行動アッセイの使用によって、学習および記憶の基礎となる分子メカニズムに対する多くの洞察が解明されている。 ショウジョウバエは、知的障害(ID)および自閉症のようなヒトの認知障害に関連する遺伝子の変異に起因する認知障害の根底にある基礎的な神経生物学を理解するのに有用である。この研究は、 求愛条件付けとして知られるショウジョウバエの古典的なパラダイムを用いて、学習と記憶を試験するための方法論を記述している。男性は容易に認識できる行動の明確なパターンを使用して裁判所の女性を飛ばす。前期雌は交配を受け入れず、交尾の試みを拒否する。この拒絶反応に対応して、オスのハエは彼らの求愛行動を減らす。この求愛行動の減少分は時間とともに測定され、学習と記憶の指標となる。基本的な数字このアッセイの現実的な出力は、求愛指数(CI)であり、男性が10分の間隔で求心する時間のパーセンテージとして定義される。学習指数(LI)は、以前の社会的出会いのないナイーブなハエと比較して、前もって女性に曝露されたハエにおけるCIの相対的減少である。遺伝子型間のLIの統計的比較のために、ブートストラッピングによるランダム化試験が用いられる。このアッセイを用いて、学習および記憶に関連する遺伝子の役割をどのように扱うことができるかを説明するために、 ジヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼ ( Dhap-at )の汎ニューロンノックダウンをここで特徴付けた。 グリセロホスフェートO-アシルトランスフェラーゼ ( GNPT )のDhap-atのヒトオルソログは、厳しいIDを特徴とする常染色体劣性症候群であるrhizomelic軟骨異形成症穿刺2型に関与している。求心性条件アッセイを用いて、Dhap-atは長期記憶に必要であるが、短期記憶。この結果は、基礎となる分子メカニズムのさらなる研究の基礎となる。
学習と記憶の基礎となる分子メカニズムは多くの種にわたって保存されている。嗅覚学習と記憶の欠陥のためのショウジョウバエmelanogaster変異株の先駆的なスクリーニング作業により、学習と記憶の基礎となるプロセスに重要な分子洞察がもたらされました1 。これらの研究では、 rutabaga 2 、amnesiac 3 、 dunce 4などの学習と記憶に関与する最初の遺伝子のいくつかが同定され、環状アデノシン一リン酸(cAMP)シグナル伝達5にとって重要な役割を明らかにしました5 。
記憶突然変異体の初期の遺伝子スクリーニングは、主に嗅覚調節を用いて行われた。しかしながら、他の形態の学習および記憶を測定するためのいくつかの方法が、時間とともに出てきている。最も広く使用されている学習および記憶のパラダイムの1つ、およびここに記載されているアッセイは、cSiegel and Hall 6によって最初に記述され、後に他のいくつかの研究グループ7,8,9によって洗練されたourtship conditioningが含まれる。求心性条件付けは、交尾中に雄によって寄託された雌の腹部に特定のフェロモン、 cis-バクテニルアセテート(cVA)が存在するかどうかに依存する。女性の腹部のcVAを感知することは、当然、求愛行動を減少させ、女性の拒絶反応と相まって、男性の求愛に対するCVAの効果が劇的に増強される。このアッセイにおける雄性ハエの反応は、雌雄方、雌雄、叩き、羽を伸ばし、振動させ、舐め、交配10 ( 図1A )を試みることによって特徴づけられるそれらの別個の求愛行動を観察することによって容易に定量化することができる。オスのハエは識別するために学ぶ hであり、性的拒絶反応の後、9日までの非受容性雌への減少した求愛行動を示す 。この自然な挙動は、学習、短期記憶(STM)、および長期記憶(LTM)の基礎となるメカニズムを解明するために使用することができる8,9,12。学習は、訓練期間中に起こる求愛行動の即時減少と定義され、仲間の女性に曝露してから0〜30分後に即時再発記憶と呼ばれることが多い6,8。 STMは訓練後30分から1時間の間に測定されるが、LTMは訓練8時間後24時間で最も頻繁に測定される( 図1B )。 STMは1時間の訓練期間を使用して誘導することができるが、それは2〜3時間しか持続しないs = "xref"> 6,8。ほとんどの学習パラダイムでは、LTMは、反復訓練の間隔をあけた発作によってのみ誘導され得る。 Mcbride et al 。 (1999) 8は、単一の1時間の訓練セッションによって誘発される2-3時間とは対照的に、間隔をあけた3時間の訓練セッションが最大9日間持続する求愛記憶を誘発するのに十分であることを示した。 McBride et al 。 8はまた、1回の5時間のトレーニングセッションが9日間まで同様のLTM応答を生じたことを示した。ハエは、この5時間の間は常に裁判所に出席せず、1回の訓練期間中にLTMを誘発するための独自の間隔を空けた訓練を実際に行っている。これは実用的な観点から非常に重要であり、LTMを調べるためにこのアッセイを使用することが容易になります。現在のプロトコルでは、主にLTM 11,12に対して7時間の単一トレーニングセッションを使用しています。いくつかの研究では、求愛学習のさまざまな側面において特異的な欠陥を有する突然変異状態。例えば、キノコの体のアブレーションはSTMとLTMに影響を及ぼしますが、学習はしません8 。嗅覚調節3を用いた記憶の特異的レギュレーターとして最初に定義された記憶喪失遺伝子の突然変異はSTMに影響を及ぼすが、学習はしない6 。翻訳レギュレーターorb2(oo18 RNA結合(orb)CPEB2サブファミリー)およびエクジソンシグナル伝達の破壊は、もっぱらLTM9,13に影響を及ぼす。このように、求愛条件付けは学習と記憶のさまざまな段階の根底にあるメカニズムを解明するための有用なパラダイムである。
この研究は、求心性条件付けの比較的高スループットの試験を可能にする最適化された実験装置を実証している。さらに、統計分析スクリプトを記述し、アッセイの重要な要素について議論する。それはshですショウジョウバエ遺伝子ジヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼ ( Dhap-at )が、 LTMではニューロンでは必要であるが、STMでは必要ではない。この遺伝子のヒトオルソログであるグリセロホスフェートO-アシルトランスフェラーゼ ( GNPAT )は、深刻な知的障害、発作、および他のいくつかの臨床的特徴を特徴とする常染色体軟骨異形成症のタイプII 14 、常染色体劣性疾患において突然変異する15 。この文脈では、求愛条件付けを使用して、学習および記憶におけるヒト疾患遺伝子の役割を機能的に検証し、機構研究の基礎を提供することができる。
求愛条件付けアッセイは、ショウジョウバエの学習と記憶の分析のための古典的なパラダイムである。ここに提示されたプロトコルは、前に説明した一般的な方法論6,7,8,9に従うが、実際のガイドライン、特殊化された装置、ランダム化テストのためのデータ解析スクリプト9,12などの独自の側面を含む。このプロトコルを使用して、96ウェル平底ブロック( 図2A )を用いて多数のハエを並行して分析し、オスを集めて訓練することが可能である。ブロックはPCR接着フィルムでシールされているため、必要に応じてハエに簡単にアクセスできます。さらに、ここに記載されたユニークな求愛室は、ほぼ2次元の空間で18対の男性 – 女性対を同時に対にすることを可能にするビデオ分析に最適です。カスタム設計された求愛室は使いやすく、建築計画が用意されています( ファイルS1 、 図2D )。このプロトコルは、被験者を収集するために使用される培養物の確立からビデオデータの取得まで、約20日を要する( 表1 )。ビデオデータの分析には、追加の時間が必要です。私たちの経験では、STMアッセイは非常に堅牢です。 LTMアッセイも非常に堅牢ですが、混乱する環境変数に対してより敏感であり、したがって、習得がより困難になります。
動物の行動はかなり変化する可能性があります。したがって、この分散を小さくするために、プロトコルの重要なステップを注意して実行する必要があります。第1に、アスピレーター( 図2B )の穏やかな使用は、荒い取り扱いまたはあまりにも強く吹き飛ばすことによって課される可能性のあるストレスを軽減する。個人を移転するための提案された方法負のジオタキシスを使用することによってアスピレーターから飛行機を飛ばす。飛行機が上がる傾向があるので、アスピレーターの先端を上向きにすることができます。フライがチップに到達する直前に、フライを放すには穏やかな打撃で十分です。さらに、テストの前に男性を求愛室に入れるために、しばしば打撃が必要ではない。
もう1つの重要なステップは、男性のテスト対象の収集と生成です。すべての男性は非常に若く、社会的に未熟な時に収集されなければならない。これは、盛土のピーク期間中に頻繁に収集することによって達成することができる(ステップ5.2)。この厳しい時期に男性が徴収されないと、早期の社会的相互作用が起こり、結果として学習が貧弱になるか、CIの変動性が高くなる可能性があります。評価すべき男性試験被験者のもう一つの要因は、遺伝的背景である。異なる遺伝的背景は、異なるレベルのナイーブな求愛を示し、また一般的な活動または歩行能力においても異なる可能性がある。コンパートメントLIのスコアに影響を与えるかもしれないこれらの交絡因子を避けるために、遺伝的背景に関して注意を払うべきである。さらに、CIデータの配布を慎重に評価する必要があります。 CIデータは、遺伝子型または他の環境要因に依存して、パラメトリックおよびノンパラメトリックの両方であり得る。場合によっては、CIの分布が正規分布から劇的に歪んだ場合、LIの計算に平均値ではなく平均値CIを使用するほうがよい場合もあります。しかし、私たちの経験では、中央値または平均CIを使用してもデータの統計的解釈に違いはなく、平均CIの使用は文献の一般的なプラクティスです。
求職者のコンディショニングを成功させるためには、訓練期間中に前提の女性による男性の求愛の試みを積極的に拒絶することが重要である。このアッセイで使用される前もって飼育されたメスが効率的に交配されていることを確認することが重要である。交絡を許さない。この準備は、工程4で調製された交配用バイアルに確立され、ここで、オスとメスのハエを4日間一緒に収容する( 表1 )。その後、交配は、定期的に検査ビデオを検査し、訓練中に男性 – 女性のペアを観察することによってモニターすることができる。交配が起こる場合、前もって準備された女性の準備中に取ることができるいくつかの措置がある。まず、前もって飼育した雌を最適飼育条件下で飼育しなければならない。バイアルに酵母ペーストと折り畳まれた濾紙を補充して、潜在的な接合面を増加させることができる。ここに記載された条件下でハエをインキュベートすると、過去の頑強な前雌が産生されましたが、これは異なるラボや異なる遺伝的系統の使用によって異なる可能性があります。したがって、インキュベーション時間および条件を変化させることにより、前雌の発生を最適化することが必要な場合がある。
求愛行動の定量化はこのプロトコルのもう一つの重要なステップ。これは、特別なソフトウェアプログラム9を使用して手動または自動で行うことができます。自動化された定量化は高速で、原理的には不偏である。いくつかのプログラムが21,22,23に公開されている。しかし、それらは使用するのが簡単ではなく、しばしば特殊なビデオフォーマットと高度な計算技術が必要です。手作業による定量は簡単で正確ですが、労働集約的であり、個々のばらつきや偏見の影響を受けます。このプロトコルは、CIの自動化された定量化に潜在的に必要とされるビデオフォーマットの要件に対応していないことを強調することが重要です。手作業による定量化のために、求愛行動を正確に観察するのに十分な品質のビデオを生成する可能性のある単純なビデオ記録装置を使用する。自動化された定量化のためには、自動化された定量化が望まれる場合、ユーザはこれを完全に調査しなければならない。
アフィシティコンディショニングアッセイは、ハエの遺伝子操作に利用可能な広範なツールと組み合わせて、学習や記憶に関与する分子メカニズムやニューロンネットワークを解明するために使用できる堅牢な読み出しを提供します。
The authors have nothing to disclose.
我々はショウジョウバエ株を提供するウィーンショウジョウバエ資源センターを認めます。さらに、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(NIH P40OD018537)から入手したストックをこの研究で使用した。この調査は、欧州連合(EU)のFP7大規模統合ネットワークGencodys(KK、HvB、AS)、NSERC Discovery(NSERCディスカバリー)、CIHRプロジェクトグラント(JMK)
P{KK101437}VIE-260B | VDRC | 101437 | Dhat-at-RNAi in 60100 background |
P{KK108109}VIE-260B | – | – | Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman) |
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III) | – | – | panneuronal driver line |
Containers for plant tissue culture | VWR | 960177 | 175 mL plastic vials |
Folded filters | Whatman | 10311643 | Filter paper to enlarge area flies can pupate on |
Flat-bottom blocks (96-wells) | Qiagen | 19579 | Used for housing blocks |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks |
Razor blade | – | – | Any sharp will do |
Needle | – | – | 0.8 mm diameter |
Aspirator | – | – | Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose. |
Courtship chambers | – | – | file S1 can be opened with indicated CAD software |
Camcorder | Sony | – | camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
power food | |||
Agar | Sigma | A7002 | |
Yeast | Bruggeman | – | |
Yeast extract | MP biomedicals | 0210330391 | |
Peptone | Sigma | P6838 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
MgSO4 | Sigma | M2643 | |
CaCl2 | Merck | 1023780500 | |
Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
Demineralized water | – | ||
Yeast paste | – | yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
normal food | |||
Agar | MP biomedicals | 215017890 | |
Yeast | bruggeman | – | |
Corn flour | de Molen | – | |
Sugar | de Molen | – | |
Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
Demineralized water | – |