Denne protokollen beskriver en Drosophila læring og minne analyse kalt courtship conditioning. Denne klassiske analysen er basert på en reduksjon av mannlig oppførsel etter seksuell avvisning av en ikke-mottakelig premiert kvinne. Denne naturlige form for atferdsmessig plastisitet kan brukes til å teste læring, kortsiktig hukommelse og langtidshukommelse.
Mange innsikt i molekylære mekanismer som ligger til grunn for læring og minne, er blitt uttalt ved bruk av enkle atferdsanalyser i modellorganismer som fruktfluen , Drosophila melanogaster . Drosophila er nyttig for å forstå de grunnleggende nevrobiologiske underliggende kognitive underskuddene som skyldes mutasjoner i gener forbundet med menneskelige kognitive forstyrrelser, slik som intellektuell funksjonshemning (ID) og autisme. Dette arbeidet beskriver en metode for å teste læring og minne ved hjelp av et klassisk paradigme i Drosophila, kjent som kriminalitetskonflikt. Mann flyr rettferdige kvinner med et tydelig mønster av lett gjenkjennelig atferd. Forlovede hunner er ikke mottakelige for parring og vil avvise mannens koplingsforsøk. Som svar på denne avvisningen, reduserer mannlige fluer sin oppførsel. Denne lærte reduksjonen i rettssaker er målt over tid, og tjener som en indikator på læring og minne. Den grunnleggende talletRical utgang av denne analysen er frieriindeksen (CI), som er definert som prosentandelen av tid som en mann bruker tilbringer i løpet av 10 minutter. Læringsindeksen (LI) er den relative reduksjonen av CI i fluer som har blitt utsatt for en premiert kvinne sammenlignet med naive fluer uten tidligere sosiale møter. For statistisk sammenligning av LIs mellom genotyper, brukes en randomiseringstest med bootstrapping. For å illustrere hvordan analysen kan brukes til å adressere rollen som et gen relatert til læring og minne, ble den pan-neuronale knockdown av dihydrohydroksacetonfosfat-acyltransferase ( Dhap-at ) karakterisert her. Den menneskelige ortologen til Dhap-at , glyceronfosfat O-acyltransferase ( GNPT ), er involvert i rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, et autosomalt resessivt syndrom karakterisert ved alvorlig ID. Ved hjelp av kriminalitetskondisjoneringsanalysen ble det bestemt at Dhap-at er nødvendig for langsiktig minne, men ikke forkorttidshukommelse. Dette resultatet tjener som grunnlag for videre undersøkelse av de underliggende molekylære mekanismer.
De molekylære mekanismene som ligger til grunn for læring og minne, er bevart gjennom mange arter. Den banebrytende arbeidsscreening Drosophila melanogaster-mutantlinjer for defekter i olfaktorisk læring og minne har gitt nøkkelmolekylær innsikt i prosessene som ligger til grunn for læring og minne 1 . Disse studiene identifiserte noen av de første generene som er involvert i læring og minne, som rutabaga 2 , amnesiac 3 og dunce 4 , som avslører en kritisk rolle for signifikant syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) 5 .
Tidlige genetiske skjermbilder for minnemutanter ble primært utført ved bruk av olfaktorisk kondisjonering. Imidlertid har flere metoder for å måle andre former for læring og minne oppstått over tid. Et av de mest brukte lærings- og minneparadigmene, og analysen beskrevet her, er kjent som cVårtship condition, som ble først beskrevet av Siegel og Hall 6 og ble senere raffinert av flere andre forskningsgrupper 7 , 8 , 9 . Courtship-kondisjonering er avhengig av tilstedeværelsen av en spesifikk feromon, cis- va-acetylacetat (cVA), på den kvinnelige buken, som avsettes av hannen under kopiering. Sensing cVA på kvinnenes underliv reduserer naturligvis opphavsrettens adferd, og når den kombineres med kvinners avslag, blir effekten av cVA på mannlig skikkelse reduksjon dramatisk forbedret. Reaksjonen av mannlige fluer i denne analysen kan enkelt kvantifiseres ved å observere deres distinkte adferdsadferd, som er karakterisert ved å orientere seg mot og følge kvinnene, tappe, forlenge og vibrerende vingen, slikker og forsøker kopiering 10 ( figur 1A ). Mannlige fluer lærer å distinguis H mellom mottakelige jomfru og ikke-mottakelige parede kvinner 11 , og etter seksuell avvisning viser de redusert frieri til ikke-mottakelige kvinner i opptil 9 dager 8 . Denne naturlige oppførselen kan brukes til å belyse mekanismene som ligger til grunn for læring, korttidsminne (STM) og langtidsminne (LTM) 8 , 9 , 12 . Læring er definert som den umiddelbare reduksjonen i frierisadferd som oppstår i treningsperioden, og kalles ofte omgående tilbakekallingshukommelse, målt 0 – 30 minutter etter eksponering til en parret kvinne 6 , 8 . STM måles mellom 30 minutter og 1 time etter trening, mens LTM oftest måles 24 timer etter trening 8 ( Figur 1B ). STM kan induseres ved hjelp av en 1-timers treningsperiode, men den varer bare i 2-3 timerS = "xref"> 6 , 8 . I de fleste læringsparadigmene kan LTM bare induseres ved avvikende opplæringsoppgaver. Mcbride et al . (1999) 8 viste at tre avvikende, 1-timers treningsøkter var tilstrekkelige til å indusere hoftehukommelse som varer i opptil 9 dager, i motsetning til 2-3 h fremkalt av en enkelt 1-timers treningsøkt. McBride et al . 8 viste også at en enkelt 5-timers treningsøkt produserte et lignende LTM respons i opptil 9 dager. Fluer rømmer ikke kontinuerlig i løpet av denne 5-timers perioden, og produserer faktisk sin egen spredte opplæring for å indusere LTM i en enkelt treningsøkt. Dette er svært viktig fra et praktisk perspektiv, og øker den enkle måten som denne analysen kan brukes til å undersøke LTM. Nåværende protokoller bruker overvei en enkelt treningsøkt på 7-h for LTM 11 , 12 . Flere studier har undersøkt forskjelligeMutante forhold som har spesifikke feil i ulike aspekter av courtship læring. For eksempel påvirker svampekroppens ablasjon STM og LTM, men ikke lærer 8 . Mutasjoner i amnesiacgenet, som først ble definert som en spesifikk regulator av minne ved bruk av olfaktorisk kondisjonering 3 , påvirker STM, men ikke lærer 6 . Forstyrrelse av oversettelsesregulatoren orb2 (oo18 RNA-bindende (orb) CPEB2-underfamilie) og ecdyson-signalering utelukkende påvirker LTM 9 , 13 . Dermed er disiplinskonditionering et nyttig paradigme for å dissekere mekanismene som ligger bak de ulike stadier av læring og minne.
Dette arbeidet demonstrerer et optimalisert eksperimentelt oppsett som muliggjør den relativt høye gjennomstrømmingsprøven av courtship-kondisjonering. Videre beskriver det et statistisk analyseskript og diskuterer kritiske faktorer for analysen. Det er shEier her at Drosophila- genet Dihydroxyacetonfosfat-acyltransferase ( Dhap-at ) Er nødvendig i nevroner for LTM, men ikke for STM. Den menneskelige orthologen til dette genet, glyceronfosfat O-acyltransferase ( GNPAT ), er mutert i rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2 14 , en autosomal-recessiv lidelse karakterisert ved alvorlig intellektuell funksjonshemning, anfall og flere andre kliniske egenskaper 15 . I denne sammenhengen kan kriminalitetskondisjonering brukes til å validere funksjonen av menneskelige sykdomsgener i læring og minne, og danner grunnlag for mekanistiske studier.
Rettferdiggjøringsanalysen er et klassisk paradigme for analyse av læring og minne i Drosophila . Protokollen som presenteres her følger den generelle metoden beskrevet tidligere 6 , 7 , 8 , 9, men inkluderer unike aspekter som praktiske retningslinjer, spesialutstyr og et dataanalyseskript 9 , 12 for randomiseringstester. Ved hjelp av denne protokollen er det mulig å analysere store antall fluer parallelt ved bruk av 96-brønn flate bunnblokker ( figur 2A ) for å samle og trene hanner. Blokkene er forseglet med PCR-limfilm, noe som gjør flyene lett tilgjengelige når det er nødvendig. I tillegg tillater de unike domstolskamrene som beskrives her, samtidig parring av 18 mannlige par i et nesten todimensjonalt rom som jegS optimal for videoanalyse. De tilpassede designkamrene er enkle å bruke, og en byggeplan er gitt ( File S1 , Figur 2D ). Denne protokollen, fra etableringen av kulturer som brukes til å samle testpersoner til oppkjøpet av videodata, tar omtrent 20 dager ( tabell 1 ). Ytterligere tid kreves for analyse av videodata. I vår erfaring er STM-analysen ekstremt robust. LTM-analysen er også ganske robust, men det er mer følsom for å forstyrre miljøvariabler og kan derfor være vanskeligere å mestre.
Dyreadferd kan være ganske variabel. Derfor må kritiske trinn i protokollen utføres med forsiktighet for å redusere denne variansen. For det første vil mild bruk av aspiratoren ( Figur 2B ) redusere stresset som kan pålegges ved grov håndtering eller ved å blåse ut for sterkt. En foreslått metode for overføring av individFluer ut av aspiratoren er ved hjelp av negative geotaksier. Som fluer har en tendens til å gå opp, kan man bare peke toppen av aspiratoren opp; Like før flyet når tippet, er det et forsiktig slag for å la flyet ut. I tillegg, for å la mennene komme inn i domstolskamrene før testing, er det ofte ikke nødvendig med et slag.
Et annet viktig skritt er innsamling og generering av mannlige testpersoner. Alle menn må samles når de er veldig unge og sosialt naive. Dette kan oppnås ved hyppig samling i toppene i eclosion (trinn 5.2). Hvis menn ikke blir samlet inn i denne stramme tidsrammen, kan de få tidlige sosiale interaksjoner, noe som kan føre til dårlig læring eller høy variasjon i CI. En annen faktor av mannlige testpersoner som bør vurderes er den genetiske bakgrunnen. Ulike genetiske bakgrunner vil utvise forskjellige nivåer av naivt frieri og kan også variere i generell aktivitet eller lokomotorisk evne. Når kompaRing flere genotyper, bør det tas hensyn til genetisk bakgrunn for å unngå disse confounding faktorer som kan påvirke LI score. I tillegg skal distribusjonen av CI-data nøye vurderes. CI-data kan være både parametrisk og ikke-parametrisk, avhengig av genotypen eller andre miljøfaktorer. I noen tilfeller, hvis fordelingen av CI er dramatisk skævt bort fra en normal fordeling, kan det være bedre å bruke median CI enn gjennomsnittet for beregning av LIs. Men i vår erfaring, gjør bruk av median eller gjennomsnittlig CI ikke en forskjell i statistisk fortolkning av dataene, og bruken av gjennomsnittlig CI er vanlig praksis i litteraturen.
For vellykket kriminalitetskonditionering er den aktive avvisningen av mannlige opprørsspørsmål av premierte kvinner avgjørende i treningsperioden. Det er viktig å sikre at premierte kvinnene som brukes i denne analysen, har blitt effektivt parret og erDermed ikke tillater kopiering. Denne forutsetningen er etablert i de parringsflasker som er fremstilt i trinn 4, hvor hanner og hunner flyter sammen i 4 dager ( tabell 1 ). Etterfølgende kan parring overvåkes ved regelmessig undersøkelse av testvideoer og ved å observere mannlige par under treningen. Hvis parring skjer, er det flere tiltak som kan tas under forberedelse av premierte kvinner. Først bør premierte kvinner bli oppdrettet under optimale avlssituasjoner. Beholdere kan suppleres med gjærpasta og et brettet filterpapir for å øke potensielle parringsflater. Inkubasjonen av fluer under de forhold som er beskrevet her har produsert robuste premierte hunner tidligere, men dette kan variere i forskjellige laboratorier og ved bruk av forskjellige genetiske stammer. Derfor kan det være nødvendig å optimalisere genereringen av premierte kvinner ved å variere inkubasjonstiden og betingelsene.
Kvantifisering av opphavsrett erEt annet kritisk trinn i denne protokollen. Dette kan gjøres manuelt eller automatisk ved hjelp av spesialiserte programvare 9 . Automatisert kvantifisering er rask og i prinsippet upartisk. Flere programmer har blitt publisert 21 , 22 , 23 ; De er imidlertid ikke enkle å bruke, og krever ofte spesialiserte videoformater og avanserte beregningsevner. Manuell kvantifisering er enkel og nøyaktig, men den er svært arbeidsintensiv og er underlagt individuell variabilitet og forspenning. Det er viktig å understreke at denne protokollen ikke tilfredsstiller kravene til videoformatering som potensielt er nødvendig for den automatiske kvantifiseringen av CIer. For manuell kvantifisering, bruk en hvilken som helst enkel videoopptaksenhet som har potensial til å produsere en video av tilstrekkelig kvalitet for nøyaktig å observere opphavsrett. For automatisert kvantifisering vil det trolig være annerledesKrav, avhengig av hvilken programvare som brukes, og brukerne bør undersøke dette grundig dersom automatisert kvantifisering er ønsket.
I kombinasjon med de omfattende verktøyene som er tilgjengelige for den genetiske manipuleringen av fluer, gir kriminalprøvningsanalysen en robust avlesning som kan brukes til å dissekere molekylære mekanismer og nevrale nettverk involvert i læring og minne.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner Wien Drosophila Ressursenter for å gi Drosophila- stammene. I tillegg ble aksjer oppnådd fra Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) brukt i denne studien. Denne undersøkelsen ble støttet delvis av EUs FP7 omfattende integrerte nettverk Gencodys til KK, HvB og AS og NSERC Discovery og CIHR Project Grants til JMK
P{KK101437}VIE-260B | VDRC | 101437 | Dhat-at-RNAi in 60100 background |
P{KK108109}VIE-260B | – | – | Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman) |
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III) | – | – | panneuronal driver line |
Containers for plant tissue culture | VWR | 960177 | 175 mL plastic vials |
Folded filters | Whatman | 10311643 | Filter paper to enlarge area flies can pupate on |
Flat-bottom blocks (96-wells) | Qiagen | 19579 | Used for housing blocks |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks |
Razor blade | – | – | Any sharp will do |
Needle | – | – | 0.8 mm diameter |
Aspirator | – | – | Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose. |
Courtship chambers | – | – | file S1 can be opened with indicated CAD software |
Camcorder | Sony | – | camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
power food | |||
Agar | Sigma | A7002 | |
Yeast | Bruggeman | – | |
Yeast extract | MP biomedicals | 0210330391 | |
Peptone | Sigma | P6838 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
MgSO4 | Sigma | M2643 | |
CaCl2 | Merck | 1023780500 | |
Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
Demineralized water | – | ||
Yeast paste | – | yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
normal food | |||
Agar | MP biomedicals | 215017890 | |
Yeast | bruggeman | – | |
Corn flour | de Molen | – | |
Sugar | de Molen | – | |
Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
Demineralized water | – |