Detta protokoll beskriver en Drosophila- lärande- och minnesanalys som kallas förbandskonditionering. Den här klassiska analysen är baserad på en minskning av manliga förhörsbeteenden efter sexuell avvisning av en icke-mottaglig premierad kvinna. Denna naturliga form av beteendets plasticitet kan användas för att testa inlärning, korttidsminnet och långsiktigt minne.
Många insikter i molekylära mekanismer som ligger till grund för lärande och minne har blivit upplysta genom användning av enkla beteendeanalyser i modellorganismer som fruktflugan , Drosophila melanogaster . Drosophila är användbar för att förstå de grundläggande neurobiologiska underliggande kognitiva underskotten som härrör från mutationer i gener som är förknippade med humana kognitiva störningar, såsom intellektuell funktionsnedsättning (ID) och autism. I det här arbetet beskrivs en metod för testning av inlärning och minne med hjälp av ett klassiskt paradigm i Drosophila som kallas förkämpning. Mannen flyger domstolshonor med ett distinkt mönster av lätt igenkännliga beteenden. Förkönade kvinnor är inte mottagliga för parning och kommer att avvisa manens samlingsförsök. Som svar på detta avslag reducerar manliga flugor sitt fängelsemönster. Denna inlärda minskning i fängelsepåverkan mäts över tid, som tjänar som en indikator på lärande och minne. Den grundläggande nummenRical utmatning av denna analys är courtship index (CI), som definieras som den procentandel av tid som en man tillbringar hovar under ett 10 min intervall. Inlärningsindexet (LI) är den relativa minskningen av CI i flugor som har blivit utsatta för en premierad kvinna jämfört med naiva flugor utan tidigare sociala möten. För statistisk jämförelse av LIs mellan genotyper används ett randomiseringstest med bootstrapping. För att illustrera hur analysen kan användas för att ta itu med rollen av en gen relaterad till inlärning och minne, karakteriserades den pan- neuronala knockdownen av dihydrohydroacetonfosfatacyltransferas ( Dhap-at ) här. Den mänskliga ortologen för Dhap-at , glycerolfosfat-O-acyltransferas ( GNPT ), är involverad i rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, ett autosomalt recessivt syndrom som kännetecknas av svårt ID. Med hjälp av förhörskonditioneringsanalysen bestämdes att Dhap-at krävs för långsiktigt minne, men inte förkorttidsminne. Detta resultat utgör grunden för ytterligare undersökning av de underliggande molekylära mekanismerna.
De molekylära mekanismerna som ligger till grund för lärande och minne är bevarade genom många arter. Det banbrytande arbetet som screenar Drosophila melanogaster-mutantlinjer för defekter i olfaktoriskt lärande och minne har gett nyckelmolekylär insikter i processerna som ligger till grund för lärande och minne 1 . Dessa studier identifierade några av de första gener som är involverade i lärande och minne, såsom rutabaga 2 , amnesiac 3 och dunce 4 , vilket avslöjar en kritisk roll för signalering av cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP) 5 .
Tidiga genetiska skärmar för minnesmutanter genomfördes primärt med användning av olfaktorisk konditionering. Men flera metoder för att mäta andra former av inlärning och minne har uppstått över tiden. Ett av de mest använda lärande- och minnesparadigma, och analysen som beskrivs här, är känd som cVårtship-konditionering, som först beskrivits av Siegel och Hall 6 och senare raffinerades av flera andra forskargrupper 7 , 8 , 9 . Courtship-konditionering är beroende av närvaron av en specifik feromon, cis- va-acetylacetat (cVA), på kvinnliga buken, som avsätts av hanen under sampolymerisering. Sensing cVA på kvinnliga buken reducerar naturligt fängelsepåverkan, och när det kombineras med kvinnans avvisningshandling, är effekten av cVA på manlig farkostminskning dramatiskt förbättrad. Svaret hos manliga flugor i denna analys kan enkelt kvantifieras genom att man observerar sitt distinkta uppträdande beteende, vilket kännetecknas av att man riktar sig mot och följer honan, knackar, sträcker sig och vibrerar vingen, slickar och försöker samla 10 ( Figur 1A ). Manliga flugor lär sig att distinguis H mellan mottagliga jungfruliga och icke-mottagliga parade kvinnor 11 och efter sexuell avvisning visar de minskat fientligt beteende mot icke-mottagliga honor i upp till 9 dagar 8 . Detta naturliga beteende kan användas för att belysa de mekanismer som ligger bakom lärandet, korttidsminnet (STM) och det långsiktiga minnet (LTM) 8 , 9 , 12 . Inlärning definieras som den omedelbara minskningen av fientligt beteende som uppträder under träningsperioden och kallas ofta omedelbart återkallande minne, uppmätt 0 – 30 min efter exponering för en parat kvinna 6 , 8 . STM mäts mellan 30 min och 1 h efter träning, medan LTM oftast mäts 24 h efter träning 8 ( Figur 1B ). STM kan induceras med en 1-h träningsperiod, men den varar bara i 2-3 timmarS = "xref"> 6 , 8 . I de flesta inlärningsparadigmer kan LTM endast induceras genom avvikande upprepningar av upprepad träning. Mcbride et al . (1999) 8 visade att tre distanserade 1-timmars träningssessioner var tillräckliga för att inducera förbandsminnet varar i upp till 9 dagar, i motsats till 2-3 h framkallade av en enda 1 h träningspass. McBride et al . 8 visade också att en enda 5-timmars träningspass resulterade i ett liknande LTM-svar i upp till 9 dagar. Fluor löper inte ständigt under denna 5-timmarsperiod, och producerar i själva verket sin egen åtskilda träning för att inducera LTM i en enda träningspass. Detta är mycket viktigt ur praktiskt perspektiv, vilket väsentligt ökar den lätthet som denna analys kan användas för att undersöka LTM. Nuvarande protokoll använder övervägande en enda träningspass på 7-h för LTM 11 , 12 . Flera studier har undersökt olikaMutanta förhållanden som har specifika defekter i olika aspekter av förhörsinlärning. Till exempel påverkar svampkroppablationen STM och LTM, men inte lärande 8 . Mutationer i amnesiacgenen, som först definierades som en specifik minnesregulator med hjälp av olfaktorisk konditionering 3 , påverkar STM men inte lär sig 6 . Störning av översättningsregulatorn orb2 (oo18 RNA-bindande (orb) CPEB2-subfamilj) och ecdyson-signalering uteslutande påverkar LTM 9 , 13 . Kriminalvårdskonditionering är således ett användbart paradigm för att dissekera mekanismerna bakom de olika stadierna av lärande och minne.
Det här arbetet visar en optimerad experimentell inställning som möjliggör en relativt hög genomströmningstestning av kriminalvårdskonditionering. Dessutom beskriver det ett statistiskt analysskript och diskuterar kritiska faktorer i analysen. Det är shÄger här att Drosophila – gendihydroxiacetonfosfatacyltransferaset ( Dhap-at ) Krävs i neuroner för LTM, men inte för STM. Den mänskliga orthologen av denna gen, glyceronfosfat-O-acyltransferas ( GNPAT ), muteras i rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2 14 , en autosomal-recessiv sjukdom som kännetecknas av svår intellektuell funktionsnedsättning, anfall och flera andra kliniska egenskaper 15 . I detta sammanhang kan kriminalvårdsbehandling användas för att funktionellt validera rollen som mänskliga sjukdomsgener i lärande och minne, vilket utgör grunden för mekanistiska studier.
Kriminalvårdsanalysen är ett klassiskt paradigm för analys av lärande och minne i Drosophila . Protokollet som presenteras här följer den allmänna metoden som beskrivits tidigare 6 , 7 , 8 , 9 men innehåller unika aspekter såsom praktiska riktlinjer, specialutrustning och ett dataanalysskript 9 , 12 för randomiseringstester. Med hjälp av detta protokoll är det möjligt att analysera ett stort antal flugor parallellt med 96-brunns platta block ( Figur 2A ) för att samla och träna män. Blocken är förseglade med PCR-limfilm, vilket gör att flugorna är lättillgängliga vid behov. Dessutom möjliggör de unika fackkammare som beskrivs här det samtidiga paret av 18 man-kvinnliga par i ett nästan tvådimensionellt utrymme som jagS optimalt för videoanalys. De skräddarsydda förmyndarkammarna är enkla att använda, och en byggplan tillhandahålls ( File S1 , Figur 2D ). Detta protokoll, från upprättandet av de kulturer som används för att samla testämnen till förvärv av videodata, tar ungefär 20 dagar ( tabell 1 ). Ytterligare tid krävs för analys av videodata. Enligt vår erfarenhet är STM-analysen extremt robust. LTM-analysen är också ganska robust, men det är mer känslig för förvirrande miljövariabler och kan därför vara svårare att behärska.
Djurbeteende kan vara ganska varierande. Därför måste kritiska steg i protokollet utföras med försiktighet för att minska denna varians. Först kommer mild användning av aspiratorn ( Figur 2B ) att minska den stress som kan åläggas genom grov hantering eller genom att blåsa ut för starkt. En föreslagen metod att överföra individFlugor ut ur aspiratorn är med hjälp av negativ geotaxis. Som flugor tenderar att gå upp kan man helt enkelt peka upp aspiratorns spets Strax före flygningen når spetsen, är ett försiktigt slag tillräckligt för att flyga ut. För att låta männen gå in i domstolskammaren innan de testas är det ofta inte nödvändigt med ett slag.
Ett annat viktigt steg är insamling och generering av manliga testpersoner. Alla män måste samlas när de är mycket unga och socialt naiva. Detta kan uppnås genom frekvent insamling under toppperioderna av eclosion (steg 5.2). Om manar inte samlas in i denna snäva tidsram, kan de få tidiga sociala interaktioner, vilket kan leda till dåligt lärande eller hög variation i CI. En annan faktor av manliga testpersoner som ska bedömas är den genetiska bakgrunden. Olika genetiska bakgrunder uppvisar olika nivåer av naivt frieri och kan också skilja sig åt i allmän aktivitet eller lokomotorisk förmåga. När kompaRing flera genotyper, bör man ta hänsyn till genetisk bakgrund för att undvika dessa confounding faktorer som kan påverka LI poäng. Dessutom bör fördelningen av CI-data noggrant bedömas. CI-data kan vara både parametriska och icke parametriska, beroende på genotypen eller andra miljöfaktorer. I vissa fall, om fördelningen av CI är dramatiskt skevad bort från en normal fördelning, kan det vara bättre att använda median CI istället för medelvärdet för beräkningen av LI. Men enligt vår erfarenhet gör användningen av median eller medelvärdet inte någon skillnad i den statistiska tolkningen av data, och användningen av det genomsnittliga CI är vanligt förekommande i litteraturen.
För framgångsrik förhörskonditionering är det aktiva avslaget på manliga fängelseprojekt av premierade kvinnor avgörande under träningsperioden. Det är viktigt att se till att de premierade kvinnorna som används i denna analys har varit effektivt parade och ärVilket således inte tillåter sammansättning. Denna förblandning är etablerad i de parningsflaskor framställda i steg 4, där manliga och kvinnliga flugor hyses tillsammans i 4 dagar ( tabell 1 ). Därefter kan parning övervakas genom regelbunden undersökning av testvideor och genom att observera man-kvinnliga par under träning. Om parning uppstår, finns det flera åtgärder som kan vidtas under förberedelsen av premierade honor. Först bör premierade kvinnor uppfödas under optimala avelsbetingelser. Injektionsflaskor kan kompletteras med jästpasta och ett veckat filterpapper för att öka potentiella parningsytor. Inkubationen av flugor under de här beskrivna förhållandena har producerat robusta premerade kvinnor tidigare, men detta kan variera i olika laboratorier och med användning av olika genetiska stammar. Därför kan det vara nödvändigt att optimera genereringen av premierade honor genom att variera inkubationstiden och förhållandena.
Kvantifiering av domstolsbeteende ärEtt annat kritiskt steg i detta protokoll. Detta kan göras manuellt eller automatiskt med hjälp av specialiserade program 9 . Automatiserad kvantifiering är snabb och, i princip, objektiv. Flera program har publicerats 21 , 22 , 23 ; De är dock inte enkla att använda, ofta kräver specialiserade videoformat och avancerade beräkningskunskaper. Manuell kvantifiering är lätt och korrekt, men det är mycket arbetskrävande och föremål för individuell variation och förspänning. Det är viktigt att betona att detta protokoll inte uppfyller kraven för videoformatering som potentiellt krävs för automatisk kvantifiering av CI. För manuell kvantifiering, använd en enkel videoinspelningsenhet som har potential att producera en video av tillräcklig kvalitet för att exakt observera domstolsbeteende. För automatiserad kvantifiering kommer det sannolikt att vara annorlundaKrav beroende på vilken programvara som används, och användarna bör undersöka detta noggrant om automatiserad kvantifiering är önskvärd.
I kombination med de omfattande verktyg som är tillgängliga för den genetiska manipuleringen av flugor, tillhandahåller konditioneringsanalysen en robust avläsning som kan användas för att dissekera molekylära mekanismer och neuronala nätverk involverade i lärande och minne.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner Wien Drosophila Resurscenter för att tillhandahålla Drosophila-stammarna . Dessutom användes lager från Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) i denna studie. Denna forskning stöddes delvis av EU: s FP7 omfattande integrerade nätverksgenkodys till KK, HvB och AS samt NSERC Discovery och CIHR Project Grants till JMK
P{KK101437}VIE-260B | VDRC | 101437 | Dhat-at-RNAi in 60100 background |
P{KK108109}VIE-260B | – | – | Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman) |
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III) | – | – | panneuronal driver line |
Containers for plant tissue culture | VWR | 960177 | 175 mL plastic vials |
Folded filters | Whatman | 10311643 | Filter paper to enlarge area flies can pupate on |
Flat-bottom blocks (96-wells) | Qiagen | 19579 | Used for housing blocks |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks |
Razor blade | – | – | Any sharp will do |
Needle | – | – | 0.8 mm diameter |
Aspirator | – | – | Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose. |
Courtship chambers | – | – | file S1 can be opened with indicated CAD software |
Camcorder | Sony | – | camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
power food | |||
Agar | Sigma | A7002 | |
Yeast | Bruggeman | – | |
Yeast extract | MP biomedicals | 0210330391 | |
Peptone | Sigma | P6838 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
MgSO4 | Sigma | M2643 | |
CaCl2 | Merck | 1023780500 | |
Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
Demineralized water | – | ||
Yeast paste | – | yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
normal food | |||
Agar | MP biomedicals | 215017890 | |
Yeast | bruggeman | – | |
Corn flour | de Molen | – | |
Sugar | de Molen | – | |
Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
Demineralized water | – |