Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att isolera endosymbioner från whitefly Bemisia tabaci genom dissektion och filtrering. Efter amplifiering är DNA-proverna lämpliga för efterföljande sekvensering och undersökning av ömsesidigheten mellan endosymbioner och whitefly.
Abstract
Bakterie symbionter bildar ett intimt förhållande med sina värdar och ger i högsta grad fördelar till värdarna. Genomisk information är kritisk för att studera funktioner och utveckling av bakteriella symbioner i deras värd. Eftersom de flesta symbionter inte kan odlas in vitro är metoder för att isolera en adekvat mängd bakterier för genom-sekvensering väldigt viktiga. I Whitefly Bemisia tabaci har ett antal endosymbioner identifierats och förutspås vara av betydelse vid utveckling och reproduktion av skadedjur genom flera tillvägagångssätt. Mekanismen som ligger bakom föreningarna förblir dock i stort sett okänd. Hindern beror delvis på det faktum att endosymbionterna i whitefly, mestadels begränsad i bakteriocyter, är svåra att separera från värdcellerna. Här rapporterar vi ett steg för steg protokoll för identifiering, extraktion och rening av endosymbioner från whitefly B. tabaci huvudsakligen genom dissektiPå och filtrering. Endosymbiont-prov framställda med denna metod, även om det fortfarande är en blandning av olika endosymbiont-arter, är lämpliga för efterföljande genom-sekvensering och analys av de möjliga rollerna hos endosymbioner i B. tabaci . Denna metod kan också användas för att isolera endosymbioner från andra insekter.
Introduction
Bakterier som bildar ett intimt symbiotiskt förhållande med relativa värdar är utbredd i arthropods 1 . Endosymbionterna har visat sig påverka värden hos värdar, såsom näringsmetabolism, reproduktion, respons på miljöbelastningar 2 , 3 , 4 etc. , i nästan alla utvecklingsstadier 5 . Mekanismen som ligger bakom föreningarna är dock fortfarande i stort sett okänd. Genomik har prioritet och betydelse när man studerar potentiella funktioner och roller hos bakterier. Vissa grundläggande uppgifter, det vill säga den taxonomiska statusen, funktionella gener, metabolismvägarna, sekretionssystemen, kan härledas från genom-sekvenser, vilket lyser på symbionternas möjliga roller i symbios. Med utvecklingen av hög genomströmningssekvensering har ett stort antal bakteriegener sekvenserats wMed olika funktioner avslöjade 6 .
Endosymbionter är av vital betydelse för hemipteraner, såsom bladlöss 7 , bedbugs 8 , psyllids 9 , bruna planthoppers 10 och cicadas 11 . Till exempel har Buchnera i bladlus , som obligatorisk symbiont, visat sig vara involverad i essentiell aminosyrorbiosyntes, tillsammans med generna från bladlusgenomet 12 . Vidare avslöjas transkriptionsreglering av Buchnera 13 . I psyllider sekvenseras Carsonella och rankas det minsta bakteriegenomet som någonsin hittats 14 . Alla dessa kännetecken för endosymbioner är baserade och härledda från genometsekvenserna. Eftersom dessa endosymbioner inte kan odlas in vitro har flera sätt applicerats för att isolera adekvata bakterier för sequencing. I bladlus extraheras endosymbioner genom centrifugering och filtrering och utsätts för ytterligare genomisk och transkriptomisk analys 5 . I bruna planthoppare sekvenseras endosymbioner tillsammans med hela insektsgenomet 10 .
Whitefly B. tabaci är ett artskomplex som innehåller mer än 35 morfologiskt oskiljbara arter (kryptiska arter), bland vilka två invasiva arter har invaderat över hela världen och orsakat enorma skador på jordbruksproduktionen 15 . Av anmärkning har endosymbioner inom B. tabaci- arter visat betydelse vid utvecklingen av skadegörarna 16 . Hittills har åtta endosymbioner identifierats i whiteflyen, inklusive den obligatoriska symbionten, Candidatus Portiera aleyrodidarum och sju sekundära symbionter Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , <Em> Wolbachia, Fritschea och Hemipteriphilus definierade 17 , 18 .
Till skillnad från de tidigare beskrivna hemiptererna är vitflödet B. tabaci en extremt liten insekt med en längd på endast 1 mm. De flesta endosymbioner är begränsade till bakteriocyter 19 (specialiserade celler innehållande symbionter, vilka vidare bildar bakteriom i B. tabaci ). Dessutom kan dessa endosymbioner inte odlas in vitro . Det enda sättet att erhålla endosymbionter från B. tabaci är att dissekera bakterien ut. Det finns dock svårigheter i dissektionen. För det första kopplar den bräckliga bakterien alltid med andra vävnader av vitflugan, som är svår att separera. För det andra begränsar den lilla storleken av whitefly isoleringen av tillräckligt med bakterier. För det tredje klarar endosymbionter i bakterien, vilket gör det ytterst komplicerat att förvärva en enda bakterieart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Whitefly Rearing and Cryptic Species Identification
- Bibehålla whitefly- arten på bomull Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) i burar under standardförhållanden på 27 ± 1 ° C, 70 ± 10% fuktighet och 14 h ljus: 10 h mörk regim.
- Samla in en individuell vuxen vitflyg och homogenisera i 30 μl lysisbuffert (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [vol / vol] Tween-20, 0,2% [vikt / vol] gelatin, 0,45% [vol / Vol. Nonidet P 40, 60 g / ml Proteinas K).
- Inkubera homogenatet vid 65 ° C under 1 h och därefter 100 ° C i 10 min.
OBS: Inkubationstiden vid 65 ° C kan ökas vid behov. Inkubationstiden vid 100 ° C bör kontrolleras kritiskt för att tillräckligt inaktivera protease K och undvika DNA-skada. - Utför polymeraskedjereaktion (PCR) med hjälp av whitefly-DNA (förvärvat i avsnitt 1.3) baserat på mitokondriella cytokromoxidas-I-primrar.
COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 '- Utför PCR-reaktionerna i en slutlig volym av 25 | il innehållande 1 U Taq- DNA-polymeras, 2,5 xl 10x buffert, 0,2 mM dNTP, 0,2 mM av varje primer och 2 xl whitefly-DNA.
- Använd följande PCR-procedurer: initial denaturering 95 ° C i 3 minuter följt av 35 cykler 95 ° C i 45 s (denaturering), 50 ° C i 45 s (glödgning) och 72 ° C i 1 min (förlängning) och Ytterligare 10 minuter vid 72 ° C för ytterligare förlängning.
- Rengör den PCR-amplifierade produkten med hjälp av ett DNA-extraktionspaket med det rekommenderade protokollet.
- Sekvensera de renade DNA-proverna med ett DNA-provsekvenseringssystem enligt tillverkarens instruktioner.
- Analysera sekvenserna med hjälp av Basic Local Matching Search Tool (BLAST) för att identifiera kryptiska arter av whitefly och undvika förorening av andra species.
2. Endosymbiont Identifiering och lokalisering
- Utför PCR på whitefly-DNA (förvärvat i steg 1.3) för att amplifiera specifika gener av varje endosymbiont inom whiteflyen (PCR-receptet beskrivs i avsnitt 1.4 och PCR-procedurer och primrar anges i tabell 1 ).
- Ämne det amplifierade provet till agarosgelelektrofores enligt tidigare publicerat protokoll 20 (1% agarosgel, Tris-acetat-EDTA som löpande buffert, spänning 5 V / cm) för att identifiera den specifika genen för varje bakterie.
- Återställ och ordna varje band för att bestämma bakteriearterna inom whitefly (se avsnitt 1.5-1.7).
- Utför fluorescens in situ- hybridiseringar (FISH) på vitflugor för att identifiera placeringen av endosymbioner enligt det tidigare publicerade protokollet 19 .
OBS: Öka koncentrationen av fluorescerande sonder om det behövs. 3. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) - Dunk och fixa vitflugor i fosfatbuffert (0,1 M, pH 7,0) innehållande 2,5% [vol / vol] glutaraldehyd i 4 timmar.
- Tvätta proven i fosfatbuffert (0,1 M, pH 7,0) tre gånger, 15 min varje gång.
- Doppa och fixa proven igen i fosfatbuffert (0,1 M, pH 7,0) innehållande 1% [vikt / volym] OsO4 i 2 timmar.
- Dehydrera proverna med en gradvis serie etanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% och 100%), 15 min varje gång.
- Överför och fördjupa proverna i 100% aceton i 20 minuter.
- Placera proven i blandning av 100% aceton och 100% Spurrharts (1: 1) i 1 h vid rumstemperatur.
- Överför proverna till blandningen av 100% aceton och 100% Spurrharts (1: 3) i 3 timmar vid rumstemperatur.
- Överför och fördjupa proverna i 100% Spurrharts (inkuberat vid 70 ° C) i mer än 9 timmar.
- Sektion whiteflyproverna med hjälp av en mikrotill mig.
- Stänk de ultratunna filmerna (förvärvad i avsnitt 3.9) genom nedsänkning i absolut uranylacetat i 5-10 minuter, följt av nedsänkning i 50% alkaliskt blycitrat under ytterligare 5-10 min.
OBS: Volymerna av reagens som används i avsnitt 3.1-3.10 beror på proven. Se till att proven är nedsänkta i reagenserna. - Observera prov under transmissionselektronmikroskopi (15 000X) för att bestämma lokalisering, form och storlek av bakterier för vidare användning (se avsnitt 4.6).
- Tillsätt 100 μl 1x PBS-lösning på en mikroskopglas. Välj några 3 eller 4 instar nymfer från bomullslöv och fördjupa dem i PBS-lösningen.
- Använd fina entomologiska nålar under ett stereomikroskop och dra bakterierna ut ur vitfiberskroppen.
- Skär försiktigt ett hål på ena sidan av nymfen och tryck lätt på den andraSida för att låta bakterierna ut.
- Montera en 20 μL mikrolastare (med den främre änden skär för att möta bakteriomas storlek) på en 0,5-10 μL pipett. Extrahera den enskilda bakterien från PBS-lösningen till mikrobelastaren.
- Tvätta bakteriomen för att eliminera föroreningen av andra vitflödesvävnader genom att pipettera bakteriomen i PBS-lösningen och extrahera bakteriomen. Upprepa tre gånger.
- Pipettera omedelbart det tvättade bakteriomet i ett centrifugrör innehållande 60 | il av 1x PBS-lösning.
- Spruta-filtrera den sammansatta bakterien genom ett 5 μm filtermembran (bestämt av storlekar av bakterier och kärnor av bakteriocyt i whitefly). Upprepa flera gånger för att flytta blandad vätska genom filtermembranen noggrant.
OBS! För att uppnå ett bättre resultat av förstärkning och sekvensering, montera över 100 bakterier. Våt filtermembranet först genom att använda 1x PBS-lösning för att minska förlusten av bakterierBindande till membranet. - Förstärka filtratet (huvudsakligen innehållande endosymbioner av whiteflyen) med användning av ett DNA-amplifieringssats med det rekommenderade protokollet med viss modifiering.
- Välj det rekommenderade protokollet för amplifiering av genomiskt DNA från blod eller celler och förbered buffert D2 för efterföljande experiment.
- Lägg direkt 1,5 μL filtrat (se avsnitt 4.6) till centrifugröret, följt av 1,5 μl buffert D2 och blanda väl.
- Inkubera på is i 10 minuter och tillsätt 1,5 μL av stopplösningen.
- Tillsätt 15 μl av reaktionsbufferten och 1 μl av DNA-polymeraset och blanda försiktigt.
- Inkubera blandningen vid 30 ° C i 16 h, följt av 3 min vid 65 ° C.
- Utför PCR direkt på det amplifierade filtratet (späd upp de amplifierade proven vid behov) genom att använda specifika primers konstruerade för bacTeria för att bekräfta bakterierna (se avsnitt 2.1).
- Utför PCR för att bekräfta om det finns kontaminering av värdgenomet med användning av whitefly-gen- beta-Actin och EF1-primrar enligt tidigare publicerad metod 21 (PCR-receptet beskrivs i avsnitt 1.4).
- Täck det amplifierade filtratet till en spektrofotometer och en fluorometer (enligt tillverkarens instruktioner) före sekvensering för att testa provkvaliteten och huruvida proverna uppfyller kriterierna för sekvensering.
- Ämne de amplifierade till en genom-sequencer enligt tillverkarens instruktioner.
4. Whitefly Bacteriome Dissection and Purification
5. Förstärkning av Endosymbiont Genomes
6. Endosymbiont-metagenom-sekventering
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mellersta Asien Minor 1 (MEAM1) arter av B. tabaci- komplexet togs som ett exempel här för beskrivning. Bomull för uppfödning av vitflugor och flera utvecklingsstadier av vitflugor visas i Figur 1, inklusive en bomullsväxt, vuxen whitefly och 1: a, 2 : e och 4 : e instar nymfer av whitefly (den 3: e instarnymmen liknar den 4 : e instar nymfen ). Det var uppenbart att den 4 : e instar nymferna är större än 1: a och 2 : e instar nymferna ( Figur 1 ). FISH-analys av Portiera och Hamiltonella inom MEAM1 visas i Figur 2 . Dessa två endosymbioner är begränsade till whiteflyens bakteriocyter, och överlappning av de två bakterierna observeras också. Figur 3 visar transmissionselektronik Tronmikroskopi av Portiera endosymbiont av whiteflyen, vilket indikerar att Portiera kan förlora sin cellvägg.
För sekvensering byggdes två bibliotek, med insättningsstorlekar på 200 bp respektive 2000 bp. Efter sekvensering genererade de två biblioteken 1,626 Mb och 1,302 Mb av rå data. Efter rengöring av föroreningsdata för adaptrar och duplikeringar förvärvades 1,484 Mb och 1,219 Mb ren data. Sammansättningen resulterade framgångsrikt i en komplett genomsekvens för obligate symbiont, Portiera . Dessutom erhölls ett utkast till genom av Hamiltonella . Samlingen baserade på både 200 bp och 2000 bp bibliotek resulterade i 138 contigs. Enligt parningsförhållandena sammanfogades de 138 strängarna vidare till 89 byggnadsställningar ( tabell 2 ).
Figimg "src =" / files / ftp_upload / 55809 / 55809fig1.jpg "/>
Figur 1: Översikt över växtinsekteringssystemet utnyttjas i denna papper. ( A ) Whiteflies är uppfödda på bomullsplanter ( Gossypium hirsutum cv. Zhe-Mian 1793). ( B ) Vy över en vuxen vitfluga. ( C ) Flera utvecklingsstadier av instar nymf i whitefly livscykel. Röda pilen hänvisar till ägget av whitefly; Svart pil hänvisar till den 1 st instar nymfen av whitefly; Vit pil hänvisar till 2: a nymf av whitefly; Blå pil hänvisar till 4 : e instar nymf av whitefly. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Fiskanalys av Portiera , skinkaIltonella i den 4 : e Instar Nymph av MEAM1. Portiera- specifik sond (röd) konjugerad till Cy3, Hamiltonella- specifik sond (grön) märkt med Cy5 användes. Skalstänger = 100 μm. ( A ) De röda hybridiseringssignalerna representerar Portiera under mörkfältet . ( B ) De gröna hybridiseringssignalerna representerar Hamiltonella under mörk fält. ( C ) Portiera och Hamiltonella fusionerade signaler under mörkt fält. ( D ) Portiera och Hamiltonella fusionerade signaler under ljust fält. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Transmission Electron MicroScopy Bild av Portiera i Whitefly . Pil anger platsen för Portiera . Skala bar = 1 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Mål symbiont | Målgen | Primersekvenser (5'-3 ') | PCR-förfaranden | referenser | ||
| Portiera | 16S rRNA | Por-F: TGCAAGTCGAGCGGCATCAT | 95 ° C 1 min, 60 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 5 cykler; | 27 | ||
| Por-R: AAAGTTCCCGCCTTATGCGT | 9576; C 1 min, 58 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 30 cykler; | |||||
| 72 ° C 20 min | ||||||
| Hamiltonella | 16S rRNA | Ham-F: TGAGTAAAGTCTGGGAATCTGG | 95 ° C 1 min, 60 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 5 cykler; | 27 | ||
| Ham-R: CCCGGGAACGTATTCACCGTAG | 95 ° C 1 min, 58 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 30 cykler; | |||||
| 72 ° C 20 min | ||||||
| Rickettsia | 16S rRNA | Ric-F: GCTCAGAACGAACGCTATC | 95 ° C 2 min; | 24 | ||
| Ric-R: GAAGGAAAGCATCTCTGC | 92 ° C 1 min, 58 °C 1 min, 72 ° C 90 s, 30 cykler; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Arsenophonus | 23S rRNA | Ars-F: CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA | 95 ° C 5 min; | 28 | ||
| Ars-R: GGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCAAC | 95 ° C 30 s, 60,5 ° C 30 s, 72 ° C 45 s, 30 cykler; | |||||
| 72 ° C 10 min | ||||||
| Cardinium | 16S rRNA | Bil-F: TACTGTAAGAATAAGCACCGGC | 95 ° C 2 min | 29 | ||
| Car-R: GTGGATCACTTAACGCTTTCG | 92 ° C 1 min, 57 ° C 1 min, 72 ° C 90 s, 30 cykler; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Wolbachia | 16S rRNA | Wol-F: TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT | 94 ° C 5 min; | 30, 31 | ||
| Wol-R: GAATAGGTATGATTTTCATGT | 94 ° C 1 min, 55 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 35 cykler | |||||
| Fritschea | 23S rRNA | Fre-F: GATGCCTTGGCATTGATAGGCGATGAAGGA | 95 ° C 5 min; | 32 | ||
| Fri-R: TGGCTCATCATGCAAAAGGCA | 94 ° C 1 min, 64 ° C 1 min, 72 ° C 90 s, 35 cykler; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Hemipteriphilus | groEL | OR- groEL -F: CACCWAAAATTACTAAAGATGG | 94 ° C 3 minuter; | 18 | ||
| OR- groEL -R: TAGAARTCCATWCCKCCCATWC | 94 ° C 30 s, 52 ° C 30 s, 72 ° C 2 min, 34 cykler; | |||||
| 72 ° C 10 min | ||||||
Tabell 1: PCR-primer och förfaranden för endosymbioner i Whitefly.
| Portiera | Hamiltonella | |
| Contig nummer | 1 | 138 |
| Byggnadsnummer a | 1 | 89 |
| Total längd, bp | 358.232 | 1.711.449 |
| N50, bp | / | 118.802 |
| N90, bp | / | 16.753 |
| Max längd, bp | / | 390.511 |
| Min längd, bp | / | 503 |
| GC-innehåll,% | 26,18 | 39,89 |
| En information som presenteras nedan bygger alla på byggnadsställningar. | ||
Tabell 2: Allmänna egenskaper hos Portiera och Hamiltonella Draft Genome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Ekonomiskt stöd till denna studie tillhandahölls av National Key Research and Development Program (2016YFC1200601) och National Natural Science Foundation of China (31390421).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
References
- Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), Interscience. New York. (1967).
- Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
- Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).
- Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype. Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).
- Hansen, A. K., Degnan, P. H. Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes. ISME J. 8, 2490-2502 (2014).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts. Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).
- Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407, 81-86 (2000).
- Nikoh, N., et al.
- Sloan, D. B., et al. Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects. Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).
- Xue, J., et al. Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation. Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).
- Campbell, M. A., et al. Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).
- Wilson, A. C., et al. Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola. Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).
- Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera. PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).
- Nakabachi, A., et al. The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella. Science. 314 (5797), 267 (2006).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci. Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).
- Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).
- Kliot, A., et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Rao, Q., et al. Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci. BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).
- Thao, L. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zhu, D. T., et al. Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I. Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).
- Zhang, C. R., et al. Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments. Sci. Rep. 5, 15898 (2015).
- Shan, H. W., et al. Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex. Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).
- Zchori-Fein, E., Brown, J. K. Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).
- Thao, M. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods. Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).
- O'Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
- Nirgianaki, A. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).
- Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts 'Candidatus Fritschea bemisiae' strain Falk and 'Candidatus Fritschea eriococci' strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).
