Summary
이 원고는 상향 및 하향 벡터 - 숙주 접합 DNA를 동시에 분석 할 수있는 양방향 통합 사이트 분석을위한 실험 절차 및 소프트웨어 분석을 설명합니다. 양방향 PCR 제품은 모든 다운 스트림 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 결과 데이터는 통합 DNA 표적의 높은 처리량, 정량적 비교에 유용합니다.
Abstract
통합 사이트 (IS) 분석은 레트로 바이러스 통합 사이트 및 그 생물학적 중요성에 대한 연구에서 중요한 요소입니다. 최근의 레트로 바이러스 유전자 치료 연구에서, IS 분석은 차세대 시퀀싱과 함께 동일한 IS를 공유하는 줄기 세포 집단을 특성화하기위한 세포 추적 도구로 사용되었습니다. 서로 다른 샘플 내에서 그리고 다른 샘플 간에서 재 축적 된 줄기 세포 클론을 정확하게 비교하기 위해 분석의 검출 감도, 데이터 재현성 및 처리량이 가장 중요한 분석 품질 중 하나입니다. 이 작업은 양방향 IS 분석을위한 상세한 프로토콜 및 데이터 분석 워크 플로우를 제공합니다. 양방향 분석은 상류 및 하류 벡터 - 숙주 접합을 동시에 서열화할 수있다. 기존의 단방향 IS 시퀀싱 접근 방식과 비교할 때 양방향 접근 방식은 IS 탐지 속도와 t 양 끝에서 통합 이벤트의 특성을 크게 향상시킵니다.DNA를 목표로합니다. 여기에 설명 된 데이터 분석 파이프 라인은 IS 시퀀스를 참조 게놈에 매핑하고 시퀀싱 오류를 결정하는 여러 단계의 비교를 통해 동일한 IS 시퀀스를 정확하게 식별하고 열거합니다. 최적화 된 분석법을 사용하여 히말라포마 원숭이에 이식 한 후 수천 개의 조혈 줄기 세포 (HSC) 클론의 상세한 모집단 패턴을 최근에 발표하여 HSC 재조합의 정확한 시점과 HSC의 기능적 이질성을 처음으로 입증했습니다. 영장류 시스템. 다음 프로토콜은 동일한 IS 시퀀스를 정확하게 식별하고 정량화하는 단계별 실험 절차 및 데이터 분석 워크 플로를 설명합니다.
Introduction
레트로 바이러스는 게놈 DNA를 다양한 위치의 숙주 게놈에 삽입합니다. 암과 다른 형태의 바이러스 발병 기전의 발달에 기여할 수있는이 고유 한 특성은 유전자 치료 및 기초 생물학 연구를 위해이 바이러스를 세포 공학에 매우 적합하게 만드는 아이러니 한 이점이 있습니다. 외래 DNA (바이러스)가 통합 된 숙주 게놈의 위치 인 바이러스 통합 사이트 (IS)는 통합 바이러스와 숙주 세포의 운명에 중요한 영향을 미칩니다. IS 분석은 다양한 생물학적 및 임상 연구 환경에서 레트로 바이러스 통합 사이트 선택 및 병인, 암 발달, 줄기 세포 생물학 및 발달 생물학 1 , 2 , 3 , 4 를 연구하는 데 사용되었습니다. 낮은 검출 감도, 낮은 데이터 재현성 및 빈번한 교차 오염현재 및 계획된 연구에 IS 분석법의 적용을 제한하는 핵심 요인.
많은 IS 분석 기술이 개발되었습니다. 링커 매개 (LM) 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 5 , 역 PCR 6 및 선형 증폭 (Linear-Amplification-Mediated) PCR 7을 포함한 제한 효소 기반 통합 사이트 분석이 가장 널리 사용됩니다. 그러나 현장 특이적인 제한 효소의 사용은 IS 검색 중에 편향을 일으키고, 제한 효소 근처에서 통합 될 하위 집합 (숙주 게놈에 통합 된 외래 DNA) 만 회수 할 수 있습니다 4 . 최근에 벡터 IS를보다 종합적으로 평가하는 분석 기술이 도입되었습니다. 이러한 분석법은 Mu transposon-mediated PCR 8 , 비 제한적 (nr) -LAM PCR 9 , type-II 제한 효소 -mediated digestion 10 , mechanical shearing 11 , random hexamer-based PCR (Re-free PCR) 12 를 사용하여 게놈 DNA를 단편화하고 IS를 증폭합니다. 현재의 기술은 다양한 수준의 검출 감도, 게놈 범위, 표적 특이성, 높은 처리량, 분석 절차의 복잡성 및 표적 부위의 상대적 빈도를 검출하는 편향을 가지고 있습니다. 기존의 분석법의 다양한 특성과 이들이 사용될 수있는 다양한 목적을 고려할 때 최적의 분석법을 신중하게 선택해야합니다.
이 작업은 통합 표적 DNA의 IS 업스트림 및 다운 스트림을 동시에 분석함으로써 검출 속도 및 서열 정량 정확도를 크게 향상시키는 양방향 분석을위한 자세한 실험 절차 및 컴퓨터 데이터 분석 워크 플로우를 제공합니다 (그림 1의 분석 절차 개요도 참조). ). 이 방법은 또한레트로 바이러스 통합 과정을 특성화하는 수단 (예 : 표적 부위 복제의 정확도 및 상류 및 하류 삽입의 게놈 서열 변화). 다른 양방향 방법은 표적 DNA 11 , 13 , 14 의 양 끝을 복제하고 시퀀싱하기 위해 주로 사용되었습니다. 이 분석법은 잘 확립 된 LM-PCR 방법 및 전산 해석 매핑을 사용하고 상류 및 하류 접합을 정량화하기 위해 벡터 표시 클론의 고효율 및 재현성 정량을 위해 광범위하게 최적화되어 있습니다. TaqαI 효소의 양방향 분석은 줄기 세포 유전자 치료 전임상 연구에서 높은 처리량 클론 정량화에 유용함이 입증되었다. 이 논문은 t를 두 배로하는 더 빈번한 커터 (RsaI / CviQI - motif : GTAC)를 사용하는 수정 된 방법을 기술한다그는 TaqαI에 기반한 분석에 비해 integromes를 검출 할 가능성이 있다. 렌티 바이러스 (NL4.3 및 그 유도체) 및 감마 - 레트로 바이러스 (pMX 벡터) 벡터 IS 분석을위한 GTAC 모티프 효소를 사용하는 상세한 실험 및 데이터 분석 절차가 기술되어있다. 분석에 사용 된 올리고 뉴클레오타이드는 표 1 에 열거되어있다. 보충 문서에는 IS 서열 분석을위한 사내 프로그래밍 스크립트가 제공됩니다.
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Protocol
1. 업스트림 (왼쪽) 및 다운 스트림 (오른쪽) - 접합 시퀀스 라이브러리 생성
- DNA 링커 준비 :
- 100 μM LINKER_A oligos (최종 20 μM) 2 μL, 100 μM LINKER_B oligos (최종 20 μM) 2 μL, 5 M NaCl (최종 : 1M) 2 μL를 첨가하여 10 μL 링커 DNA 용액을 준비하고 PCR 튜브에 nuclease-free water 4 μL. 링커 시퀀스는 표 1 을 참조하십시오.
- PCR 장비에서 95 ° C에서 5 분 링커 DNA 솔루션을 품어, 실행 프로그램을 중지하고 PCR 장비 전원을 끕니다. 링커 DNA를 30 분 동안 천천히 식힌다. 링커 DNA 용액은 4 ° C에서 보관할 수 있습니다.
- LTR 특이 적 비오틴 - 프라이머 신장 :
- UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 생체 내 에서의 게놈 DNA의 260/280 nm 값 및 DNA 농도를 결정합니다또는 시험 관내 실험. 1 ~ 2 μg의 샘플 게놈 DNA를 nuclease-free water를 사용하여 170 μL의 게놈 DNA 용액으로 희석합니다.
- 10 μM HIV-1 특이적인 biotin primers ( 표 1의 L - BP와 R - BP 각각 2.5 μL : 4 개의 lentivirus 특정 primers에 대한 총 10 μL), 10X 열 안정성 20 μL를 혼합하여 200 μL PCR 반응을 준비 DNA 중합 효소 완충액, 10 mM dNTP 4 μL (최종 : 각 dNTP 200 μM), 3 μL의 2.5 U / μL 열 안정성 DNA 중합 효소 및 163 μL의 게놈 DNA.
참고 : gammaretroviral 벡터 (pMX 벡터)의 경우 위의 4 가지 HIV-1 특이 적 비오틴 프라이머 대신 2 개의 10 μM pMX 특이 적 비오틴 프라이머 (L-BP 및 R-BP : 총 10 μL)를 각각 5 μL 사용하십시오. - 용액을 4 개의 PCR 튜브 (각 50 μL)로 나누고 다음 조건 하에서 단일 확장 사이클을 수행하십시오 : 94 ° C 5 분, 56 ° C 3 분, 72 ° C 5 °분, 보관시 4 ℃.
- 2 ML microcentrifuge 튜브에 모든 4 PCR 반응을 풀과 PCR 정화 키트의 PCR 정화 절차를 따르십시오. 용출 완충액 (키트에 제공된 5 배수 희석 용리 완충액) 50 μL로 용출시킨다. 즉시 1.3.1 단계로 진행하거나 용출 된 DNA를 -20 ° C에 보관하십시오.
- RsaI 및 CviQI 분해
- 50 μL의 DNA (1.2.4 단계), 10 μL의 완충액 A 10 μL 및 RsaI 효소 2 μL (20 U)를 첨가하여 100 μL 소화 반응을 준비하십시오. 37 ℃에서 1 시간 동안 PCR 장비에서 배양하십시오.
- 반응에 CviQI 효소 1 μL (10 U)를 첨가하고 PCR 장비에서 30 분 동안 25 ° C에서 배양하십시오. 즉시 1.4.1 단계로 진행하십시오.
- 무딘 결말 :
- 2.5 μL의 DNA 중합 효소 I 대형 (클레 노우) 단편과 10 mM dNTP 2 μL가 들어있는 4.5 μL 혼합물을 준비하십시오. 전송 181; L 혼합물을 단계 1.3.2의 DNA 샘플에 첨가 하였다. 총 부피는 102 μL입니다. vortexing으로 잘 혼합하고 25 ℃에서 1 시간 동안 PCR 장비에서 배양한다. 즉시 1.6.1 단계로 진행하십시오.
- 스트렙 트 아비딘 비드의 제조 :
- 간단히 스트렙 타비 딘 비드 용액을 보텍스하고 새로운 2 mL 미세 원심 분리 튜브에 50 μL를 옮긴다. 자성 스탠드를 사용하여 뜨는을 제거하고 바인딩 솔루션 200 μL로 구슬을 씻으십시오.
- 100 μL의 구속 용액에 구슬을 Resuspend하고 자기 스탠드에서 멀리 튜브를 놓으십시오. 즉시 1.6.1 단계로 진행하십시오.
- 스트렙 타비 딘 비드 결합 :
- 100 μL의 샘플 DNA (단계 1.4.1)를 100 μL 재 현탁 비드 용액 (단계 1.5.2)으로 옮기고 용액의 거품이 발생하지 않도록 pipetting으로 조심스럽게 혼합하십시오. 튜브를 회전 바퀴 또는 롤러에서 3 시간 동안 상온에서 인큐하십시오.
- 자성 스탠드를 사용하여 구슬을 캡처하고 뜨는을 폐기하십시오. 400 μl의 세척 용액에서 두 번 구슬을 씻고 400 μl에서 1 x T4 DNA 리가 아제 완충액 (nuclease-free 물을 사용하여 10 배 용액에서 희석)을 두 번 세척합니다.
- 200 μl의 1x T4 DNA 리가 제 완충액 (nuclease-free 물을 사용하여 10 배 용액에서 희석)에 비즈를 재현 탁하고 자성 스탠드에서 멀리 떨어 뜨려 놓으십시오. 즉시 1.7.1 단계로 진행하십시오.
- 링커 라이 게이션 :
- DNA 링커 (단계 1.1.2) 0.5 μL, 10X T4 DNA ligase 버퍼 10 μL, 5X T4 DNA 리가 아제 버퍼 20 μL (25 % 폴리에틸렌을 포함)의 혼합하여 2 ML microcentrifuge 튜브에 400 μL의 연결 반응 솔루션을 준비 글리콜), 5 μL의 T4 DNA 리가 제, 164.5 μL의 핵산 분해 효소가없는 물, 200 μL의 재현 완충액 (단계 1.6.3). 반응 튜브를 회전 바퀴에 놓고 RT (22 ° C)에서 3 시간 (또는 16 ° CO / N) 동안 배양합니다. 비드를 세척 용액으로 두 번 씻고 자성 스탠드를 사용하여 1X 열 안정성 DNA 중합 효소 완충액 (nuclease-free 물을 사용하여 10 배 용액에서 희석)으로 두 번 씻으십시오.
- 1x 열 안정성 DNA 중합 효소 PCR 버퍼 50 μL에 구슬을 Resuspend하고 자기 스탠드에서 멀리 놓으십시오. 즉시 1.8.1 단계로 진행하거나 최대 4 일 동안 하루 동안 저장하십시오.
- 왼쪽과 오른쪽 접합 DNA 모두의 사전 증폭 :
- 10 μM 1L - 프라이머 10 μL, 10 μM 1R - 프라이머 10 μL, 10 μM 프라이머 Link1 (표 1) 20 μL, 10X 열 안정성 DNA 중합 효소 버퍼 10 μL, 4 μL의 10 μL를 추가하여 200 μL PCR 반응을 준비합니다 단계 1.7.3에서 재현 된 구슬 (50 μL)에 10 mM dNTPs (최종 : 각 dNTP 200 μM), 8 μL (20 U) 열 안정성 DNA 중합 효소 및 88 μl의 nuclease없는 물을 넣었다.
- 반응 혼합물을 4 개의 PCR 튜브 (각 50 개1, L)로하고 다음 조건으로 PCR을 수행한다 : 94 ℃에서 2 분간 배양; 94 ℃에서 20 초, 56 ℃에서 25 초, 72 ℃에서 2 분의 25 사이클; 마지막 연장은 72 ℃에서 5 분간이다.
- 2 ML microcentrifuge 튜브에 모든 4 PCR 반응을 풀링하고 PCR 정화 키트의 PCR 정화 절차를 따르십시오. 용리 완충액 50 μL로 용출시킨다.
- UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도와 260 / 280nm 값을 결정합니다. DNA는 다음 단계를 준비 할 때까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. 1.9.1 / 1.10.1 단계 (선택 사항)로 진행하거나 1.11.1 / 1.12.1 단계로 직접 진행하십시오.
- 왼쪽 내부 DNA amplicon 제거 (옵션) :
- 1.8.4 단계에서 100 ng의 PCR DNA 제품을 2 mL microcentrifuge tube에 옮기고 nuclease가없는 물을 사용하여 10 μL로 부피를 조정하십시오.
- 좌측의 내부 D를 특이 적으로 표적으로하는 제한 효소 반응을 준비한다NA 증폭 물.
참고 : 반응 조건은 효소의 선택에 따라 다를 수 있습니다. 예를 들어, NL4.3 기반 lentiviral 벡터에서 왼쪽 내부 DNA를 제거하면 1 μL의 pvuII , 2 μL 버퍼 B, 7 μL의 nuclease없는 물을 추가합니다. 37 ℃에서 1 시간 동안 PCR 장비에서 배양하십시오. 즉시 1.11.1 단계로 진행하거나 -20 ° C에서 보관하십시오.
- 오른쪽 내부 DNA amplicon 제거 (선택 사항) :
- 1.9.1 단계와 동일하게 진행하십시오.
- 오른쪽 내부 DNA amplicon을 대상으로 제한 효소 반응을 준비하십시오.
참고 : 예를 들어, NL4.3 기반 렌티 바이러스 벡터에서 오른쪽 내부 DNA를 제거 할 때 1 μL의 sfoI , 2 μL의 완충액 B 및 7 μL의 핵산 분해 효소가없는 물을 첨가하십시오. 37 ℃에서 1 시간 동안 PCR 장비에서 배양하십시오. 즉시 1.12.1 단계로 진행하거나 -20 ° C에서 보관하십시오.
- 왼쪽접합 관련 증폭 :
- 단계 1.8.4 (또는 선택 단계 1.9.2)에서 DNA 5 μL, 10 μM 2L - 프라이머 (최종 1 μM) 5 μL, 10 μM 프라이머 Link2의 5 μL를 혼합하여 50 μL PCR 반응을 준비 (최종 : 1 μM), 5 μL의 10X 열 안정성 DNA 중합 효소 완충액, 1 μL의 10 mM dNTP (최종 : 각 dNTP 200 μM), 2 μL (5 U)의 열 안정성 DNA 중합 효소 및 27 μL의 nuclease- 물.
- 다음 조건으로 PCR을 실시하십시오 : 3 분 동안 94 ° C 배양; 94 ℃에서 20 초, 56 ℃에서 25 초, 72 ℃에서 2 분간의 8-15 사이클; 마지막 연장은 72 ℃에서 5 분간이다.
참고 : 증폭 된 DNA는 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. * 사이클 번호 최적화가 제안됩니다. - PCR 정화 키트의 PCR 정화 절차를 따르십시오. 용리 완충액 50 μL로 용출시킨다. DNA 농도와 260/280 nm 값을 결정하십시오.
- 모든 절차는 다른 프라이머의 사용을 제외하고는 "왼쪽 접합 특이 적 증폭"(단계 1.11.1-1.11.3)과 동일합니다. 이 단계에서 오른쪽 접합 특이적인 프라이머 (2R 프라이머, 표 1 참조)를 사용하십시오.
- 2 % 아가 로스 겔 전기 영동 또는 모세관 전기 영동 ( 그림 2 )을 수행하여 PCR amplicon 길이 변화를 분석하십시오.
참고 : 이것은 분석 절차의 완료를 확인하고 PCR 밴드 패턴을 기반으로 한 IS 패턴을 대략적으로 평가하는 데 필수적인 단계입니다. 1.11.3 및 1.12.3 단계의 정제 PCR 증폭 물은 다양한 DNA 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 고전 체인 - 터미네이션 (Sanger) 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱을위한 적절한 샘플 준비 절차를 진행하십시오. DNA는 -20 °에서 보관할 수 있습니다.;기음.
2. 전산 IS 시퀀스 분석
- 데이터 파일 준비 :
- fasta 형식 시퀀스 데이터 파일 (보충 데이터의 Test_data.fa), 벡터 및 링커 시퀀스 검색 용 모티프 (보충 데이터의 Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv) 및 제한 효소 정보 용 tsv 파일의 세 가지 입력 데이터 파일 준비 (보충 데이터의 Enzyme.tsv).
참고 :이 파일은 디 멀티플렉싱, 벡터 및 링커 시퀀스 트리밍 및 내부 벡터 시퀀스 제거에 필요합니다 ( 그림 3A ). 계산 워크 플로를 구현하기위한 자세한 단계별 지침은 추가 데이터의 README.txt 파일에 나와 있습니다.
- fasta 형식 시퀀스 데이터 파일 (보충 데이터의 Test_data.fa), 벡터 및 링커 시퀀스 검색 용 모티프 (보충 데이터의 Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv) 및 제한 효소 정보 용 tsv 파일의 세 가지 입력 데이터 파일 준비 (보충 데이터의 Enzyme.tsv).
- 전산 분석 :
- demultiplexing 및 트리밍 스크립트를 실행하십시오.
참고 : 원시 시퀀스는 역 다중화 및 트리밍을 위해 처리됩니다g의 벡터, 링커 및 프라이머 시퀀스 (추가 README.txt 파일의 STEP-1 참조). - BLAST와 같은 정렬 도구 (BLAT; www.genome.ucsc.edu)를 사용하여 처리 명령을 참조 게놈에 매핑하려면 매핑 명령을 실행하십시오 (README.txt 파일의 STEP-2 참조).
- 정량적 IS 분석 스크립트를 실행하십시오 (README.txt 파일의 STEP-3 참조).
참고 : 두 개의 출력 파일 (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt 및 Final_count.txt)이 생성됩니다. 매핑 및 시퀀스 열거 전략에 대한 자세한 내용은 보충 자료의 README.txt 파일과 이전 발행물 2 , 15 에 나와 있습니다.
- demultiplexing 및 트리밍 스크립트를 실행하십시오.
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Representative Results
양방향 IS 분석은 상류 (왼쪽)와 하류 (오른쪽) 벡터 호스트 접합 ( 그림 2 ) 모두에 대해 서로 다른 크기의 PCR 증폭 물을 생성했습니다. PCR 증폭 물의 크기는 인테그람에서 상류와 하류에 가장 가까운 GTAC 모티프의 위치에 의존한다. 이 분석법은 또한 내부 DNA PCR 증폭 물을 생산 하였다 : 폴리펩티드 관 근처의 레트로 바이러스 서열 및 프라이머 결합 부위는 각각 좌 및 우 교차 PCR 동안 동시에 증폭되었다. PCR amplicon 밴드는 모세관 또는 아가로 오스 (2 %) 전기 영동으로 시각화 할 수 있습니다.
시퀀싱 후, 왼쪽 및 오른쪽 접합 서열 모두는 원시 서열 전처리 (벡터 및 링커 DNA의 역 다중화 및 트리밍 포함), 게놈 상에 IS 서열 매핑, 동일한 IS의 식별 및 카운팅시퀀스 및 오류 수정 절차 적용 ( 그림 3 ). 참조 게놈에서 질의 서열의 5'- 말단의 위치는 IS로 간주되어 각각의 IS의 초기 계수에 사용된다. 두 개의 일치하는 염기 서열을 결정하는 기준 - 동일한 인테그린에서 유래 된 상류 (좌측) 및 하류 (우측) 접합 서열 -은 레트로 바이러스 특이 적 통합 통합의 뉴클레오타이드 서열 패턴에 기초하고 다음과 같다 : (i) 두 개의 접합 서열 반대 방향으로 게놈 위에 정렬. (ii) 두 접합 서열의 IS는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 벡터에 대해 5-bp 오버랩 및 쥐 백혈병 바이러스 (MLV) 벡터에 대해 4-bp 오버랩으로 분리된다. HIV와 4 bp의 MLV 교차점 중 처음 5 bp는 역 보완 적이다.
IS 서열 수는 3 단계로 결정된다 : (1) IS 서열을 게놈 상에 매핑매핑 품질을 생성하고 개별 IS 시퀀스를 "단일 히트", "다중 히트", "무의미"및 "기타"그룹으로 구분하는 BLAT을 사용합니다. (2) BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 단일 히트 시퀀스를 멀티 히트, no-hit 및 기타를 포함하여 다른 준 최적 매핑 시퀀스와 비교합니다. (3) 호모 폴리머 오류를 포함한 시퀀싱 오류를 확인하고 수정하십시오. 멀티 히트 시퀀스는 2 개 이상의 게놈 위치를 높은 매핑 점수로 정렬 할 수있는 IS 시퀀스입니다. 클론 개체군을 확인하고 정량화하는 데 여전히 유용하지만, 멀티 히트 서열은 게놈 통합 사이트 분포 패턴 (예 : 유전자, 반복 또는 기타 게놈 문자와의 연관성)을 특성화하는 데 사용할 수 없습니다. 드문 경우지만 두 접합 시퀀스는 서로 다른 매핑 품질을 나타냅니다. 예를 들어, "싱글 히트"를 표시하는 반면 일치하는 시퀀스는 "멀티 히트"를 표시합니다. 그러한 경우, 둘 다시퀀스는 "단일 히트"시퀀스로 처리됩니다.
비정상적인 질의 크기 (QSIZE)와의 높은 게놈 일치 (ID)를 나타내는 차선의 매핑 점수가있는 IS 서열의 일부 (또는 그 반대로)는 "no-hits"와 분리되어 추가 및 종종 "기타"로 그룹화됩니다 수동 재평가. 예를 들어, 게놈 매핑에 BLAT를 사용할 때 일부 IS 서열은 첫 번째 또는 마지막 5-10 개 뉴클레오타이드에서 미스 매칭 뉴클레오타이드로 인해 비정상적인 QSIZE를 나타낼 수 있습니다. 상대적으로 높은 품질의 매핑 결과가 있음에도 불구하고 이러한 시퀀스는 종종 "단일 히트"또는 "다중 히트"상태에 대한 매핑 기준을 충족하지 못합니다.
샘플 원시 시퀀스 데이터 파일 (Test_DATA.fa : 33,374 시퀀스)과 샘플 출력 데이터 파일이 보충 데이터로 제공됩니다. 사람 repopulating 세포에서 게놈 DNA의 1 μg, 빌려준와 transduced 인간화 된 골수 / 간 / 흉선 (BLT) 마우스 17 에서의 이합체 벡터 (FG12)를 양방향 검정법을 사용하여 분석 하였다. 레트로 바이러스 IS는 게놈 전체에서 발견되었습니다. 전형적으로, 렌티 바이러스 벡터는 유전자에서 과다 표현되는 반면, 감마 - 레트로 바이러스 벡터는 전사 개시 부위에서 과다 표현된다 ( 도 4 ). 두 개의 인간 재생 세포 샘플에서 상류 (왼쪽) 및 하류 (오른쪽) 교차점에서 총 1,081 개의 염기 서열 -851이 IS 서열로 분류되었다. 이 시퀀스들로부터, 좌측에 93 개의 고유 IS가 있고, 우측 접합부에 50 개의 고유 IS가 확인되었다. 이 중 44 개가 양쪽 (왼쪽 및 오른쪽) 접합부에서 확인되었으며, 총 99 개의 고유 한 적분을 테스트 샘플에 나타 냈습니다. IS는 무작위 사건 ( 그림 4A )에 비해 유전자가 상당히 풍부하다 (66 %, p <0.0001).
Oct-4, cMyc, Klf4 및 Sox2를 발현하는 pMX로 형질 전환 된 혼합 된 Pmx 조작 세포 샘플에서 1,611 개의 IS 서열과 129 개의 고유 한 서열이 시험 데이터 파일에 포함됩니다. IS가 식별되었다. 왼쪽과 오른쪽 교차점에서 각각 65와 76 개의 고유 IS가 확인되었는데, 12 개가 양쪽 교차점에 있었다.이전에 500bp 이상의 PCR 증폭 산물은 파이로 시퀀싱 플랫폼에서 제대로 배열되지 않았으며 500bp 미만의 PCR 증폭 산물은 일반적으로 서열 길이 15 와 관련하여 주목할만한 편향없이 잘 배열되었다. 따라서 500bp 이상의 PCR 증폭 산물의 서열 데이터를 제외하고 길이 관련 시퀀싱 바이어스를 제거했다. <500 bp PCR amplicon (quantifiable vector integrome 또는 QVI라고 함)의 데이터 만 정량적 클론 분석에 사용되었습니다. 벡터 적분의 상대 검출 빈도<500 bp PCR 증폭 물을 생성하는 IS 접합의 서열 수 ( 도 4b -4D, 표 2 참조)만을 사용하여 계산 하였다. 약 77 %의 벡터가이 전략에 의해 정량적으로 분석 될 수 있습니다 ( 그림 4B ). 결과적으로, 각 QVI에 대한 계산 된 주파수는 샘플 ( 그림 4E )의 실제 주파수를 1.25x 과소 추정 할 것으로 예상됩니다.
그림 1 : 양방향 통합 사이트 분석의 개략도. 세포 DNA (파란색)가 옆에있는 이중 가닥의 레트로 바이러스 DNA (검은 색과 빨간색)가 표시됩니다. 화살표는 올리고 뉴클레오타이드 프라이머를 나타내고, 별표가있는 화살표는 바이오틴 프라이머를 나타낸다. 링커 DNA는 보라색 줄로 표시됩니다. 간단히 말하면, 왼쪽의 선형 확장바이러스 Long Terminal Repeat (LTR)의 biotin primers (L-BP)와 right biotin primers (R-BP)는 biotinylated 이중 가닥 IS DNA를 생성합니다. CviQI 및 RsaI로 소화시킨 후, 비오틴 화 된 이중 가닥 DNA를 스트렙 트 아비딘 - 비오틴 특이 적 결합을 사용하여 농축하고 링커 DNA로 라이 게이션시킨다. Streptavidin으로 포획 된 링커 연결 벡터 - 숙주 접합 DNA는 2 단계 PCR에 의해 증폭됩니다 : 전치 증폭 (왼쪽 및 오른쪽 접합 모두의 증폭), 두 개의 중첩 된 PCR, 각각 왼쪽 및 오른쪽 접합을 목표로합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 대표적인 PCR Amplicon Image. ( A ) 모세관 전기 영동 분석은 다양한 길이의 PCR amppvuII 또는 sfoI 소화 후 lentiviral vector (FG12) 통합 부위의 licons . 상류 (왼쪽) 및 하류 (오른쪽) 벡터 호스트 접합에 대한 다양한 PCR 밴드가 표시됩니다. 어두운 화살표 머리는 pvuII 또는 sfoI 소화 후 남아 있는 내부 벡터 DNA amplicons를 나타냅니다. DNA 크기 마커 (0.1 - 2.5kbp)는 M 레인에 있습니다. 열린 화살표 머리는 정렬 마커 (15 & 5,000 bp)를 나타냅니다. DNA 정렬 마커는 모든 채널에서 이동 시간 변화의 보정에 사용됩니다. ( B ) 여러 pMX 벡터로 형질 도입 된 쥐 세포 클론의 감마 - 레트로 바이러스 (pMX) 벡터 통합 사이트. 왼쪽 및 오른쪽 접합 DNA뿐만 아니라 내부 벡터 DNA amplicons (화살촉)가 표시됩니다. 어둡고 열린 화살표 머리는 각각 내부 벡터 DNA 및 정렬 마커를 나타냅니다. DNA 크기 마커 (50-1,500 bp)는 M 레인에 있습니다. 모세관 전기 영동에 대한 세부 사항은 회사에서 찾을 수 있습니다실험 계획안. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 통합 사이트 시퀀스 분석. ( A ) 전산 자료 분석을위한 순서도. fasta 형식 시퀀스 파일, 역 다중화 및 트리밍을위한 참조 시퀀스 모티프가있는 파일, 제한 효소 정보가있는 파일 등 세 가지 데이터 파일이 필요합니다. Test_DATA.fa (시퀀스 데이터), Demultiplexing_Trimming.tsv (검색 시퀀스 모티프) 및 Enzyme.tsv (제한 효소 인식 시퀀스)와 같은 샘플 파일이 보충 데이터 파일로 제공됩니다. 파트 1의 처리 된 서열 (숙주 - 게놈 서열)은 BLAT를 사용하여 참조에 대해 매핑됩니다. 쿼리 순차의 5 '끝 부분에있는 위치참조 게놈의 es는 통합 사이트로 간주됩니다 ( 표 2 ). 각 IS의 서열 수는 다음 세 단계로 결정됩니다. (1) BLAT를 사용하여 IS 서열을 게놈에 매핑합니다. (2) 단일 히트 (single-hit) IS 서열 (숙주 게놈의 독특한 부위에 정렬)을 게놈 상에 순식간에 맵핑 된 다른 서열과 비교하는 것; (3) 시퀀싱 오류를 식별하고 수정합니다. 맵핑 및 서열 열거 전략에 대한 자세한 내용은 이전 연구 2 , 15 에서 찾을 수 있습니다. ( BC ) 다운 스트림 (B) 및 업스트림 (C) 벡터 - 호스트 접합에 대한 두 개의 샘플 단일 가닥 DNA 서열이 표시됩니다. 파이로 시퀀싱 (Pyrosequencing) 프라이머 A 및 B (녹색)는 액적 PCR 및 시퀀싱에 사용됩니다. 색상 코드는 그림 1 의 색상 코드와 일치합니다. 샘플 다운 스트림 접합 서열 (B)은 프라이머 A (녹색), MID (녹색), 벡터 U5 말단 (적색), 숙주 게놈 (청색), 리nker (보라색), B (녹색). 혼합 된 (상류 및 하류) DNA 서열 분석에서, 프라이머 A는 하류 접합부 (B)를 시퀀싱하는데 사용되고, 프라이머 B는 상류 접합부를 시퀀싱하는데 사용된다. 샘플 업스트림 접합 서열 (C)은 프라이머 B, MID, 벡터 U3 말단, 숙주 게놈, 링커 및 프라이머 A 를 포함한다.이 도면의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 양방향 통합 사이트 분석의 대표적인 예. ( A ) 인간화 된 마우스 재생 세포 (LV - huMice)의 lentiviral 벡터의 Genes (refseq), Alu 및 LINE 1 (L1) 반복의 퍼센트 통합, silico 생성 된 10,000 임의의 통합 이벤트와 비교. 통합 사이트 매핑 됨인간 게놈 (hg19)에 결합시킨다. LV-huMice 통합 사이트는 유전자 ( p <0.0001, 카이 제곱 근사치) ( B ) 10,000 개의 무작위 통합 이벤트에 대한 인 실리 코 분석에서 나타났습니다. 단일 방향 접근법을 사용하면 무작위 적분의 약 52 %가 PCR 증폭 물을 500bp 미만으로 생성하는 반면 양방향 접근법을 사용하면 77 %가 왼쪽 또는 오른쪽 접합에서 500bp 미만의 PCR 증폭 물을 생성했습니다. 500 bp보다 긴 PCR amplicon은 pyrosequencing platfor 2 로 비효율적으로 서열화되므로 양적 데이터 분석에서 제외되어야합니다. ( C ) 클론 정량화 전략. 각 개별 클론은 동일한 벡터 통합 (또는 IS)을 공유합니다. 왼쪽 (x)과 오른쪽 (y) 교차점의 상대적 빈도는 결합되어 클론 개체군의 상대적인 양을 나타냅니다 (quantifiable vector integromes, QVI). Integ 450 bp 이내의 GTAC 모티브가없는 배급 사유는 부적격 (dQ)되고 정량 분석에서 제외됩니다. ( D ) 세포를 repopulating 인간화 마우스의 44 QVI 클론의 상대 주파수 (모든 QVI 시퀀스에 상대적)는 색 구성표 (흰색에서 빨간색으로 : 0-0.16)로 표시됩니다. ( E ) 양방향 분석으로 클론 주파수의 예상 과대 추정. in silico 10,000 무작위 통합 분석을 기반으로, 약 20 % dQ 클론으로 인해 GTAC 모티프 효소 ( RsaI 및 CviQI )를 사용할 때 1.25 배의 과도 추정이 예상됩니다. TCGA 모티프 효소 ( TaqαI )를 사용할 때 약 60 % dQ 클론으로 인해 2.56 배 초과 추정이 예상됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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도표 1 : Lentiviral와 감마 retroviral 벡터 통합 위치 분석을위한 Oligonucleotides. * 5BioTEG : 5 '말단에서의 바이오틴 변형. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 2 : 대표 삽입 사이트 시퀀스 카운트 데이터. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1 맵 : 통합 사이트 시퀀스는 참조 게놈의 고유 한 위치 (단일 히트) 또는 다중 유전자좌 (다중 히트)로 매핑 할 수 있습니다. NA (not available) : 시퀀스가 발견되지 않았습니다.
2 STRD : 게놈에서 쿼리 시퀀스의 방향
3 QLEN : 질의 시퀀스의 길이
4 GLEN : 게놈에서 가장 가까운 이용 가능한 GTAC 모티프로부터 삽입 부위까지의 거리에 기초하여 계산 된 통합 사이트 서열의 예상 길이. GLEN <450 bp는 정량 분석을 위해 허용됩니다.
5 Total_Count : 총 시퀀스 수
6 통합 사이트는 염색 번호 (CHR)와 오른쪽 접합점의 사이트 번호 (CHR_SITE1) 및 왼쪽 접합점의 번호 (CHR_SITE2)로 표시됩니다. CHR_SITE1과 CHR_SITE2는 렌티 바이러스 벡터의 경우 5 bp 간격을두고 MLV (pMX) 벡터의 경우 4 bp 떨어져 있습니다
7 오른쪽 접합점 (R_A)과 샘플 A (L_A)의 왼쪽 접합점에 대한 순서 개수; 오른쪽 접합 (R_B) 및 샘플 B의 왼쪽 접합 (L_B)에 대한 시퀀스 카운트
* 실격 (dQ) : GLEN ≥ 450 in silico bp
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Discussion
양방향 분석은 상류 (좌측) 및 하류 (우측) 벡터 - 숙주 DNA 결합 서열 모두의 동시 분석을 가능하게하며 다수의 유전자 치료, 줄기 세포 및 암 연구 응용에 유용하다. GTAC- 모티프 효소 (RsaI 및 CviQI) 및 양방향 PCR 접근법을 사용하면 이전의 TCGA- 모티프 ( TaqαI ) 효소 ( 2 , 15 및 기타)와 비교할 때 인테그랄 (또는 클론 개체군)을 검출 할 가능성이 상당히 향상된다 단방향 LM-PCR 접근 5 . 양방향 분석은 특히 임상 또는 소 동물 모델 연구에서 종종 발생하는 제한된 DNA 샘플에서 IS의 분석을 향상시킵니다.
1.1-1.7 단계는 중요한 단계이므로 불필요한 지연없이 수행해야합니다. 이 단계는 대개 하루 안에 수행됩니다. 이 단계 이전에 효소를 검사하는 것이 좋습니다. 단계1.9 및 1.10은 선택 사항입니다. 이러한 단계는 IS 서열로 동시에 증폭되는 내부 벡터 DNA 서열을 감소시킬 것이다. 표 1은 FG12 21 및 pMX- 기질의 감마 레트로 바이러스 벡터를 포함하는 야생형 NL4.3 HIV-1, NL4.3 유래 벡터의 IS를 분석하는데 적합한 프라이머 세트를 제공한다. 긴 말단 반복 (LTR) 서열의 뉴클레오티드 변이에 따라, 프라이머 디자인 및 실험적 접근법은 적절한 변형을 필요로 할 수있다.
매핑에 사용되는 blat 소프트웨어는 fasta 형식과 만 호환되며 fastq 파일에서는 작동하지 않습니다. FASTX-Toolkit 또는 BBTools와 같은 다양한 소프트웨어 도구를 사용하여 fastq 파일을 fasta로 변환 할 수 있습니다. Python에 대한 기본적인 지식을 가진 사용자는 Biopython을 사용하여 fastq 파일을 fasta 파일로 변환하여 blat으로 매핑 할 수 있습니다.
IS의 일부는 양방향성 I로 검출되지 않을 것으로 예상된다.S 분석법을 사용하고, 검출 되더라도 하류 클론의 정량화에 적합하지 않을 것입니다. GTAC- 모티프 효소가 사용되었을 때, 파이로 시퀀싱 플랫폼에 의해 생성 된 서열 데이터의 인테그롬 중 약 23 %는 정량적 IS 서열 분석을위한 분석 기준을 통과하지 못했다 ( 그림 4 ). 포괄적 인 IS 적용 범위가 중요 할 때, 예를 들어 유전자 요법 환경에서 유전자 조작 세포의 안전 모니터링과 같이 , IS 8 , 9 , 10 , 11 , 12에 대한 제한없는 게놈 접근을 가진 분석법을 선택하는 것이 좋습니다. 제한 효소 4 또는 18 의 다른 또는 최적화 된 조합과 동일한 샘플.
제한없는 LAM PCR 및 임의 절단 장치와 같은 제한없는 게놈 접근에 대한 IS 검사oaches 19 , 20 은 포괄적 인 IS 분석을위한 특별한 약속을 유지합니다. 이러한 접근법은 상대적으로 제어하기 어려운 기술을 사용하므로 게놈 DNA 단편화 및 IS 증폭의 결과를 예측하기가 어렵습니다. 반면에, 잘 특성화 된 제한 효소를 사용하는 IS assay는 두 가지 큰 이점을 가지고있다 : (1) 분석 결과가 효소 반응의 특이성과 이용 가능성으로 인해 더 예측 가능하기 때문에 분석을 보정하고 최적화하는 것이 상대적으로 쉽다. 참조 게놈 서열. (2) 분석 조건이 최적화되면 서열 데이터를 매우 재현 할 수 있습니다. 최적화 된 조건을 갖춘 양방향 PCR은 대규모의 정확한 클론 정량에 유용합니다. 제한 효소 바이어스로 인해 기존의 클론 개체군의 일부만이 분석되었지만 개체 수 l 클론을 정확하게 측정함으로써 샘플 내외의 클론 크기 변화를 정확하게 측정 할 수있었습니다. 충분한 수의 클론이 줄기 세포 행동 패턴과 기능적 이질성을 결정하기 위해 생성되었다.
이 양방향 PCR 절차로 생산 된 PCR 증폭 산물은 모든 하류 시퀀싱 플랫폼에 적합합니다. 분석의 민감도가 높기 때문에 오염이없는 방에서 실험을 수행하여 교차 오염을 방지하기 위해 최대한의주의를 기울여야합니다. 모든 PCR 단계에 대해 음성 (템플릿 없음) 대조군 실험을 포함하는 것이 좋습니다. 가장 조심스럽게 연습해도 샘플 간 교차 오염을 방지하는 것은 극히 어렵습니다. 따라서 서로 다른 표본의 클론 개체군을 비교할 때 잠재적 인 오염 된 데이터 23 을 제거하는 충돌 제어와 저주파의 신뢰할 수없는 클론에 대한 차단을 사용하는 것이 좋습니다> 2가 교차 오염 된 DNA의 노이즈를 최소화합니다. 양방향 접근법은 적분의 양 끝에 대해 IS 데이터를 생성하므로 오류 가능성 탐지 오류를 줄일 수있는 추가 기회를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
기금은 국립 보건원 R00-HL116234, U19 AI117941 및 R56 HL126544에 의해 제공되었다. 국립 과학 재단 보조금 DMS-1516675; 한국 연구 재단 (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); KRIBB 이니셔티브 프로그램.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10 mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2 mL microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100 - 2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50 - 1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
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