Summary
Detta manuskript beskriver experimentell procedur och mjukvaruanalys för en dubbelriktad integreringsställeanalys som samtidigt kan analysera uppströms och nedströms vektor-värd-kryssnings-DNA. Tvåriktiga PCR-produkter kan användas för någon nedströms sekvenseringsplattform. Den resulterande data är användbar för en hög genomströmning, kvantitativ jämförelse av integrerade DNA-mål.
Abstract
Integration Site (IS) analyser är en kritisk komponent i studien av retrovirala integrationsställen och deras biologiska betydelse. I de senaste retrovirala genterapistudierna har IS-analyser, i kombination med nästa generationens sekvensering, använts som ett cellspårningsverktyg för att karakterisera klonala stamcellspopulationer som delar samma IS. För den korrekta jämförelsen av repopulerande stamcellkloner inom och över olika prover är detektionens känslighet, dataframtagbarhet och hög genomströmningskapacitet hos analysen bland de viktigaste analysegenskaperna. Det här arbetet ger ett detaljerat protokoll- och dataanalys-arbetsflöde för dubbelriktad IS-analys. Tvåriktningsanalysen kan samtidigt sekvensera både uppströms och nedströms vektor-värdkryssningar. Jämfört med konventionella enriktade IS-sekvenseringsmetoder, förbättrar dubbelriktat tillvägagångssätt signifikant IS-detekteringshastigheter och karakteriseringen av integrationshändelser i båda ändarna av tHan riktar sig mot DNA. Dataanalyspipelinjen som beskrivs här identifierar och summerar identiska IS-sekvenser genom flera steg för jämförelse som kartlägger IS-sekvenser på referensgenomet och bestämmer sekvenseringsfel. Med hjälp av ett optimerat analysförfarande har vi nyligen publicerat detaljerade återuppbyggnadsmönster av tusentals hematopoetiska stamceller (HSC) efter transplantation i rhesusmakar, vilket för första gången demonstrerar den exakta tidpunkten för HSC-repopulationen och den funktionella heterogeniteten hos HSCs i Primatsystem. Följande protokoll beskriver steg för steg experimentell procedur och dataanalys arbetsflöde som exakt identifierar och kvantifierar identiska IS-sekvenser.
Introduction
Retrovirus sätter in deras genomiska DNA i värdgenomet på olika ställen. Denna unika egenskap, som kan bidra till utvecklingen av cancer och andra former av viral patogenes, har en ironisk fördel att göra dessa virus mycket mottagliga för cellteknik för genterapi och grundbiologiforskning. Viral Integration Site (IS) - placeringen på värdgenomet där ett främmande DNA (virus) integreras - har viktiga konsekvenser för ödet för både de integrerade virusen och värdcellerna. IS-analyser har använts i olika biologiska och kliniska forskningsinställningar för att studera retroviralt integrationsställsval och patogenes, cancerutveckling, stamcellsbiologi och utvecklingsbiologi 1 , 2 , 3 , 4 . Låg detekteringskänslighet, dålig datareproducerbarhet och frekvent korsförorening är blandNyckelfaktorerna begränsar användningen av IS-analyser till aktuella och planerade studier.
Många IS-analystekniker har utvecklats. Restriktionsenzymbaserade integrationsstadsanalyser, inklusive Linker-medierad (LM) polymerasekedjereaktion (PCR) 5 , invers PCR 6 och linjärförstärkningsmedierad (LAM) PCR 7 är de mest använda. Användningen av platsspecifika restriktionsenzymer genererar emellertid en bias vid återhämtningen av IS, vilket möjliggör endast en delmängd integrerade (ett främmande DNA integrerat i värdgenomet) i närheten av restriktionsstället som skall återvinnas 4 . Analysteknik som mer omfattande utvärderar vektor IS har också introducerats de senaste åren. Dessa analyser använder olika strategier, innefattande Mu transposon-medierad PCR 8 , icke-restriktiv (nr) -LAM PCR 9 , typ II-restriktionsenzym-mEdierad digestion 10 , mekanisk skjuvning 11 och slumpmässig hexamerbaserad PCR (Re-free PCR) 12 , för fragmentering av genomiska DNA och amplifiering av IS. Nuvarande tekniker har varierande nivåer av detekteringskänslighet, genomdäckning, målspecificitet, hög genomströmningskapacitet, analysprocedurernas komplexitet och förspänningar vid detektering av de relativa frekvenserna hos målplatserna. Med tanke på de olika egenskaperna hos de befintliga analyserna och de olika syften för vilka de kan användas, bör den optimala analysmetoden noggrant väljas.
Detta arbete tillhandahåller detaljerade experimentella förfaranden och ett arbetsdata för databasanalys för en dubbelriktad analys som avsevärt förbättrar detekteringshastigheten och sekvenskvantifieringsnoggrannheten genom att samtidigt analysera IS uppströms och nedströms om det integrerade mål-DNA (se Figur 1 för en schematisk bild av analysprocedurerna ). Detta tillvägagångssätt ger ocksåS medel för att karakterisera den retrovirala integrationsprocessen (till exempel trovärdigheten för målplats duplicering och variationer i de genomiska sekvenserna av uppströms och nedströms införingar). Andra bidirektionsmetoder har använts huvudsakligen för kloning och sekvensering av båda ändarna av mål-DNA 11 , 13 , 14 . Denna analys optimeras i stor utsträckning för hög genomströmning och reproducerbar kvantifiering av vektormärkta kloner, med användning av den väletablerade LM-PCR-metoden och kartläggning av analysanalys och för kvantifiering av både uppströms och nedströms förbindelser. Tvåriktningsanalys med TaqaI- enzymet har visat sig vara användbart för högklassig klonal kvantifiering i prekliniska studier av stamcellsgeneration 2 , 15 . I detta dokument beskrivs en modifierad metod med en frekventare skärare (RsaI / CviQI - motiv: GTAC) som dubblerar tHan chanser att detektera integrer jämfört med en Taqal- baserad analys . Detaljerade experimentella och data analysmetoder som använder GTAC-motiv enzymer för lentivirala (NL4.3 och dess derivat) och gamma-retrovirala (pMX vektorer) vektor IS-analys beskrivs. De oligonukleotider som användes vid analysen är listade i tabell 1 . Ett internt programmeringsskript för IS-sekvensanalys finns i kompletteringsdokumentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generera uppströms (vänster) - och nedströms (höger) -junktionssekvensbiblioteken
- DNA-linkerpreparat:
- Förbered en 10 μl linker-DNA-lösning genom att tillsätta 2 μl 100 μM LINKER_A-oligos (slutlig: 20 μM), 2 μl 100 μM LINKER_B-oligos (slutlig: 20 μM), 2 μl 5 M NaCl (slutlig: 1 M) och 4 pl nukleasfritt vatten i ett PCR-rör. Se tabell 1 för länksekvenserna.
- Inkubera linker-DNA-lösningen vid 95 ° C under 5 minuter i ett PCR-instrument, stoppa körprogrammet och stäng av PCR-instrumentet. Lämna länklösningen i instrumentet i 30 minuter för att sakta svalna ned linker-DNA. Linker-DNA-lösningen kan lagras vid 4 ° C.
- LTR-specifik biotin-primerförlängning:
- Använd en UV-Vis-spektrofotometer för att bestämma DNA-koncentrationen och 260/280 nm-värdena för det genomiska DNAet från in vivoEller in vitro- experiment. Späd 1-2 μg prov genomiskt DNA till en slutlig volym 170 μL genomisk DNA-lösning med användning av nukleasfritt vatten.
- Förbered en 200 μl PCR-reaktion genom att blanda 2,5 μl vardera av 10 μM HIV-1-specifika biotinprimrar (L-BP och R-BP i tabell 1 : totalt 10 μl för fyra lentivirusspecifika primrar), 20 μl 10X termostabil DNA-polymerasbuffert, 4 xl av 10 mM dNTPs (slutlig: 200 xM av varje dNTP), 3 xl 2,5 U / xl termostabilt DNA-polymeras och 163 xl genomiskt DNA.
OBS! För gammaretrovirala vektorer (pMX-vektorer) använd 5 μL vardera av två 10 μM pMX-specifika biotinprimrar (L-BP och R-BP: totalt 10 μL) istället för de fyra HIV-1-specifika biotinprimrarna ovan. - Lös upp lösningen i fyra PCR-rör (vardera 50 μl) och utför en enda förlängningscykel under följande villkor: 94 ° C i 5 minuter, 56 ° C i 3 minuter, 72 ° C i 5Min och 4 ° C för förvaring.
- Pool alla fyra PCR-reaktionerna i ett 2 ml mikrocentrifugrör och följ PCR-reningsproceduren i PCR-reningskitet. Eluera med 50 jil elueringsbuffert (5-faldig vattenutspädd elueringsbuffert tillhandahållen i satsen). Fortsätt omedelbart med steg 1.3.1 eller lagra det eluerade DNA vid -20 ° C.
- RsaI och CviQI digestion
- Förbered en 100 μl digereringsreaktion genom att tillsätta 50 | il DNA (från steg 1.2.4), 10 | il 10x buffert A och 2 | il (20 U) av RsaI-enzym. Inkubera vid 37 ° C i 1 h i ett PCR-instrument.
- Tillsätt 1 μL (10 U) CviQI-enzym till reaktionen och inkubera vid 25 ° C under 30 minuter i ett PCR-instrument. Fortsätt genast med steg 1.4.1
- Stumt slut:
- Bered en 4,5-μl-blandning innehållande 2,5 | il av DNA-polymeras I stort (klenow) fragment och 2 | j, l av 10 mM dNTPs. Överför 181; L av blandningen till DNA-provet från steg 1.3.2. Den totala volymen blir 102 μl. Blanda väl genom vortexing och inkubera vid 25 ° C i 1 h i ett PCR-instrument. Fortsätt genast med steg 1.6.1.
- Framställning av streptavidinpärlor:
- Vortexera streptavidinpärllösningen kort och överför 50 μL till ett nytt 2 ml mikrocentrifugrör. Ta bort supernatanten med magnetstativet och tvätta pärlorna med 200 pi bindningslösning.
- Resuspendera pärlorna i 100 pi bindningslösning och placera röret bort från magnetstativet. Fortsätt genast med steg 1.6.1.
- Streptavidinpärlbindning:
- Överför 100 μL prov DNA (steg 1.4.1) till 100 μL återuppslamd pärllösning (steg 1.5.2) och blanda försiktigt genom pipettering för att undvika skumning av lösningen. Inkubera röret vid rumstemperatur i 3 timmar på ett roterande hjul eller en rulle.
- Använd magnetstativet för att fånga pärlorna och kasta supernatanten. Tvätta pärlorna två gånger i 400 pi tvättlösning och två gånger i 400 pi 1x T4 DNA-ligasbuffert (utspätt från 10X lösning med användning av nukleasfritt vatten).
- Resuspendera pärlorna i 200 | il av 1x T4 DNA-ligasbuffert (utspätt från 10X-lösning med användning av nukleasfritt vatten) och placera den bort från magnetstativet. Fortsätt genast med steg 1.7.1.
- Linkerligation:
- Förbered en 400 μl ligeringsreaktionslösning i ett 2 ml mikrocentrifugrör genom att blanda 0,5 | il av DNA-länken (steg 1.1.2), 10 | il 10x T4 DNA-ligasbuffert, 20 | il 5X T4 DNA-ligasbuffert (innehållande 25% polyeten Glykol), 5 | il T4-DNA-ligas, 164,5 xl nukleasfritt vatten och 200 xl av de återuppslamna pärlorna (steg 1.6.3). Placera reaktionsröret på det roterande hjulet och inkubera vid RT (22 ° C) under 3 timmar (eller 16 ° C / N). Tvätta pärlorna två gånger med tvättlösningen och två gånger med 1X termostabil DNA-polymerasbuffert (utspädd från 10x lösning med användning av nukleasfritt vatten) med användning av magnetstativet.
- Resuspendera pärlorna i 50 | il av 1x termostabil DNA-polymeras PCR-buffert och placera den bort från magnetstativet. Fortsätt genast med steg 1.8.1 eller lagra vid 4 ° C i upp till en dag.
- Förförstärkning av både vänster och höger korsning DNA:
- Förbered en 200 μl PCR-reaktion genom att tillsätta 10 | j, l av 10 | iM 1L-primer, 10 | j, l av 10 | iM 1R-primer, 20 | j, l av 10 | iM primer Link1 (Tabell 1), 10 | il 10X termostabil DNA-polymerasbuffert, 4 | 10 mM dNTPs (slutlig: 200 | im av varje dNTP), 8 | il (20 U) termostabilt DNA-polymeras och 88 | j, l nukleasfritt vatten till de återuppslammade pärlorna (50 | il) från steg 1.7.3.
- Aliquot reaktionsblandningen i 4 PCR-rör (var 50: e1; L) och utföra PCR med följande tillstånd: 94 ° C inkubation under 2 min; 25 cykler av 94 ° C under 20 s, 56 ° C i 25 s och 72 ° C under 2 min; Och en slutlig förlängning vid 72 ° C under 5 min.
- Poola alla 4 PCR-reaktioner i ett 2 ml mikrocentrifugrör och följ PCR-reningsproceduren i PCR-reningskitet. Eluera med 50 jil elueringsbuffert.
- Bestäm DNA-koncentrationen och 260/280 nm-värdena med hjälp av en UV-Vis-spektrofotometer; DNA kan lagras vid -20 ° C tills det är klart för nästa steg. Fortsätt med steg 1.9.1 / 1.10.1 (valfritt) eller direkt med steg 1.11.1 / 1.12.1.
- Ta bort intern DNA-amplikon på vänster sida (valfritt):
- Överför upp till 100 ng PCR DNA-produkt från steg 1.8.4 till ett 2 ml mikrocentrifugrör och justera volymen till 10 μl med användning av nukleasfritt vatten.
- Förbered en restriktionsenzymreaktion som specifikt riktar in på den inre D-sidanNA amplicon.
OBS: Reaktionsförhållandet kan variera beroende på valet av enzym. När man till exempel tar bort intern DNA från vänster sida från NL4.3-baserade lentivirala vektorer, tillsätt 1 μL pvuII , 2 μl buffert B och 7 μl nukleasfritt vatten. Inkubera vid 37 ° C i 1 h i ett PCR-instrument. Fortsätt genast med steg 1.11.1 eller lagra vid -20 ° C.
- Avlägsna den inre DNA-amplikonen på höger sida (valfritt):
- Fortsätt samma som i steg 1.9.1.
- Förbered en restriktionsenzymreaktion som specifikt riktar in höger inre DNA-amplicon.
OBS! När du till exempel tar bort det inre DNA-höger från NL4.3-baserade lentivirala vektorer, tillsätt 1 μL sfoI , 2 μL buffert B och 7 μL nukleasfritt vatten. Inkubera vid 37 ° C i 1 h i ett PCR-instrument. Fortsätt genast med steg 1.12.1 eller lagra vid -20 ° C.
- Vänster-junction-specifik amplifiering:
- Förbered en 50 μl PCR-reaktion genom att blanda 5 | il DNA från steg 1.8.4 (eller från det valfria steget 1.9.2), 5 | il 10 ^ M 2L-primer (slutlig: 1 uM), 5 | il av 10 ^ M primer Link2 (Slutlig: 1 uM), 5 | il 10x termostabil DNA-polymerasbuffert, 1 | il 10 mM dNTPs (slutlig: 200 | iM av varje dNTP), 2 | il (5 U) av termostabil DNA-polymeras och 27 | il nukleasfri vatten.
- Utför PCR med följande villkor: 94 ° C inkubation under 3 minuter; 8-15 cykler av 94 ° C under 20 s, 56 ° C i 25 s och 72 ° C i 2 min; Och en slutlig förlängning vid 72 ° C under 5 min.
OBS: Förstärkt DNA kan lagras vid -20 ° C. * Cykelnummeroptimering rekommenderas. - Följ PCR-reningsproceduren i PCR-reningskitet. Eluera med 50 jil elueringsbuffert. Bestäm DNA-koncentrationen och 260/280 nm-värdena.
- Alla procedurer är identiska med "Vänster-junction-specific amplification" (steg 1.11.1-1.11.3), med undantag för användningen av olika primers; Använd den högra korsningsspecifika primern (2R-primer, se tabell 1 ) i detta steg.
- Analysera PCR-ampliconlängdsvariationerna genom att utföra 2% agarosgelelektrofores eller kapillärelektrofores ( Figur 2 ).
OBS! Detta är ett viktigt steg för att bekräfta att analysprocedurerna har slutförts och för att göra en grov bedömning av IS-mönster baserat på PCR-bandmönstren. Det renade PCR-amplikonet från steg 1.11.3 och 1.12.3 kan användas för olika DNA-sekvenseringsplattformar. Fortsätt med lämpliga provberedningsförfaranden för sekvensering med klassisk kedjans avslutning (Sanger) eller nästa generations sekvensering. Dna kan lagras vid -20 °; C.
2. Computational IS Sequence Analysis
- Förberedelse av datafiler:
- Förbered tre inmatningsfiler: en dataformat för fastformatföljd (Test_data.fa i kompletterande data), en tsv-fil för sökmotiven för vektor- och länksekvenser (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv i kompletterande data) och en tsv-fil för restriktionsenzyminformation (Enzyme.tsv i kompletterande data).
OBS: Dessa filer krävs för demultiplexering, trimning av vektor- och länksekvenser och avlägsnande av interna vektorsekvenser ( Figur 3A ). Detaljerad steg-för-steg-instruktioner för att genomföra beräkningsflödet finns i filen README.txt i tilläggsdata.
- Förbered tre inmatningsfiler: en dataformat för fastformatföljd (Test_data.fa i kompletterande data), en tsv-fil för sökmotiven för vektor- och länksekvenser (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv i kompletterande data) och en tsv-fil för restriktionsenzyminformation (Enzyme.tsv i kompletterande data).
- Beräkningsanalys:
- Kör demultiplexering och trimningskript.
OBS: Råsekvensen behandlas för demultiplexering och för trimminG av vektorns, linker- och primersekvenserna (se STEP-1 i den kompletterande README.txt-filen). - Kör mappningskommandot (se STEP-2 i filen README.txt) för att kartlägga de bearbetade sekvenserna på referensgenomet med ett BLAST-liknande anpassningsverktyg (BLAT; www.genome.ucsc.edu).
- Kör det kvantitativa IS-analysskriptet (se STEP-3 i filen README.txt).
OBS: Två utgångsfiler (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt och Final_count.txt) genereras. Mer detaljer om kartläggnings- och sekvensräkningsstrategier finns i filen "README.txt" i tilläggsdata och i tidigare publikationer 2 , 15 .
- Kör demultiplexering och trimningskript.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tvåriktiga IS-analysen genererade olika storlekar av PCR-ampliconer för både uppströms (vänster) och nedströms (höger) vektorvärdesövergångar ( Figur 2 ). Storleken på ett PCR-amplicon är beroende av placeringen av närmaste GTAC-motiv uppströms och nedströms från en integrometod. Analysen producerade också interna DNA-PCR-amplikoner: retrovirala sekvenser nära polypurinområdet och primerbindningsstället förstärktes samtidigt under vänster- och högerkopplings-PCR. PCR-ampliconband kan visualiseras genom kapillär eller agaros (2%) elektrofores.
Efter sekvensering analyserades både vänster- och högerkopplingssekvenserna med ett internt programmeringsskript för förbehandling av obehandlade sekvenser (inklusive demultiplexering och trimning av vektor och linker-DNA), kartläggning av IS-sekvenser på genomet, identifiering och räkning av identiska ISSekvenser och tillämpa felkorrigeringsprocedurer ( Figur 3 ). Platser av 5'-änden av frågesekvenserna i referensgenomet betraktas som IS och används för initialräkning av varje IS. Kriterierna som bestämmer de två matchande sekvenserna-uppströms (vänster) och nedströms (höger) förbindningssekvenser härrörande från samma integrom-baseras på nukleotidsekvensmönstren för retrovirusspecifik samordnad integration och är följande: (i) Två korsningssekvenser Anpassa sig till genomet i motsatta orienteringar. (Ii) IS av de två korsningssekvenserna separeras genom en 5-bp överlappning för humana immunbristvirus (HIV) -vektorer och en 4-bp överlappning för murina leukemivirus (MLV) -vektorer. De första 5 bp av de två korsningarna av HIV och 4 bp av MLV-korsningar är omvänd komplementära.
IS-sekvensräkningar bestäms i tre steg: (1) kartläggning av IS-sekvenser på genometMed hjälp av BLAT, som alstrar mappkvaliteten och separerar enskilda IS-sekvenser i "single-hit", "multi-hit", "no-hit" och "other" -grupper; (2) med hjälp av det grundläggande lokala anpassningsverktyget (BLAST) för att jämföra enkla träffsekvenser med andra suboptimalt mappade sekvenser, inklusive multi-hits, no-hits och andra; Och (3) identifiera och korrigera sekvenseringsfel, inkluderande homopolymerfel. Multi-hit-sekvenser är IS-sekvenser som kan anpassa två eller flera genomiska positioner med ett högt kartläggningsresultat. Medan det fortfarande är användbart för att identifiera och kvantifiera klonpopulationer, kan de flera träffsekvenserna inte användas för att karakterisera genomiska integrationsstedsfördelningsmönster (till exempel associering med gener, upprepningar eller andra genomiska tecken). I vissa sällsynta fall visar de två korsningssekvenserna olika kartläggningsegenskaper. Till exempel visar man "single-hit", medan matchande sekvensen visar "multi-hit". I sådana fall, bådaSekvenser behandlas som "single-hit" -sekvenser.
En del av IS-sekvenser med suboptimala mappningsresultat, som visar hög procentig genomsättning (identitet) med en onormal frågestorlek (QSIZE), eller vice versa, separerades från "no-hits" och grupperas i "andra" för ytterligare och ofta Manuell omvärdering. När du till exempel använder BLAT för genombildning kan vissa IS-sekvenser visa en onormal QSIZE på grund av miss matchande nukleotider i de första eller sista 5-10 nukleotiderna. Dessa sekvenser uppfyller ofta inte kartläggningskriterierna för "single-hit" eller "multi-hit" -status, trots att det har ett relativt högkvalitativt kartläggningsresultat.
En exempelförsekvensdatafil (Test_DATA.fa: 33,374 sekvenser) och samplingsutdatafiler finns som kompletterande data. 1 μg genomiskt DNA från humana repopulerande celler, transducerad med utlåning Virala vektorer (FG12) i en humaniserad benmärg / lever / tymus (BLT) -mus 17 analyserades med användning av dubbelriktningsanalysen. Retroviral IS hittades över hela genomet. Typiskt är lentivirala vektorer överrepresenterade i gener, medan gamma-retrovirala vektorer överrepresenteras i transkriptions-startställen 16 ( Figur 4 ). Från två humana repopulerande cellprover kvalificerades totalt 1,081 sekvenser-851 från uppströms (vänster) och 230 nedströms (höger) korsningar-som IS-sekvenser. Från dessa sekvenser identifierades 93 unika IS i vänster och 50 unika IS i de högra korsningarna. Av dessa identifierades 44 i både (vänster och höger) korsningar, vilket visar totalt 99 unika integreringar i testproverna. IS är väsentligt berikad i gener (66%, p <0,0001) jämfört med slumpmässiga händelser ( Figur 4A ).
"> Exempel på gamma-retrovirusvektor (pMX) -integrationssekvenser ingår också i testdatafilen. Från ett blandat Pmx-konstruerat cellprov transducerat med pMX som uttrycker okt4, cMyc, Klf4 och Sox2, 1 611 IS-sekvenser och 129 unika IS identifierades. Av 65 och 76 unika IS identifierades i respektive vänster respektive höger korsningar var 12 i båda korsningarna.Det har tidigare visat sig att PCR-amplikoner på ≥500 bp är dåligt sekvenserade i pyrosequenseringsplattformen, medan PCR-amplikoner <500 bp i allmänhet är väl sekvenserade, utan en anmärkningsvärd förspänning när det gäller sekvenslängder 15 . Sekvensdata från ≥ 500 bp PCR-amplikoner uteslutes sålunda för att avlägsna längdassocierad sekvenseringsförspänning. Endast data från <500 bp PCR amplicon (benämnd kvantifierbar vektorintegration, eller QVI) användes för kvantitativ klonanalys. De relativa detekteringsfrekvenserna för vektorintegromerBeräknades med användning av endast sekvensantalet av IS-korsningar som genererade <500 bp PCR-amplikoner ( Figur 4B -4D ; se även Tabell 2 ). Cirka 77% av vektorerna kunde kvantitativt analyseras genom denna strategi ( Figur 4B ). Som ett resultat förväntades de beräknade frekvenserna för varje QVI att överskatta de sanna frekvenserna i provet ( Figur 4E ) med 1,25x.
Figur 1: En schematisk vy av dubbelriktad integreringsplatsanalys. Dubbelsträngat retroviralt DNA (svart och rött) flankerat av cellulärt DNA (blå) visas. Pilarna representerar oligonukleotidprimrar, och pilar med en asterisk representerar biotinprimrar. Linker-DNA är betecknade med lila linjer. Kortfattat, en linjär förlängning av vänsterBiotinprimrar (L-BP) och högerbiotinprimrar (R-BP) från den virala långa terminalenrepetionen (LTR) genererar biotinylerat, dubbelsträngigt IS-DNA. Efter digestion med CviQI och RsaI berikas det biotinylerade dubbelsträngade DNAet med användning av streptavidin-biotinspecifik bindning och ligeras med linker-DNA. Streptavidininfångade, linker-ligerade vektor-värd-förenings-DNA amplifieras genom en tvåstegs PCR: förförstärkning (amplifiering av både vänster och höger korsningar) följt av två nestade PCR, var och en riktade mot vänster och höger-korsningar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativ PCR Amplicon Image. ( A ) Kapillärelektroforesanalys visar varierande längder av PCR-ampLiconer i lentivirala vektor (FG12) integrationsställen efter pvuII eller sfoI- digestion . Varierande PCR-band för uppströms (vänster) och nedströms (höger) vektorvärdesövergångar visas. De mörka pilhuvuden indikerar de inre vektor-DNA-amplikonerna kvar efter pvuII- eller sfoI- digestion. DNA-storleksmarkören (0,1 - 2,5 kbp) ligger på M-banan. De öppna pilhuvudena indikerar justeringsmarkörer (15 och 5 000 bp). DNA-alignmentmarkörer används för kalibrering av migrationstidsvariationen över alla kanaler. ( B ) Gamma-retrovirala (pMX) vektorintegrationsställen i murina cellkloner transducerade med multipla pMX-vektorer. Left- och right-junction DNAs, såväl som interna vektor DNA-amplikoner (pilhuvud), visas. De mörka och öppna pilhuvuden indikerar respektive vektor för inventering av DNA och alignment markörer. DNA-storleksmarkören (50-1 500 bp) ligger på M-banan. Detaljer om kapillärelektrofores finns i företagetprotokoll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Integrationsställningssekvensanalys. ( A ) En flödesschema för beräkningsdataanalys. Tre datafiler, inklusive en fasta-format-sekvensfil, en fil med referenssekvensmotiv för demultiplexering och trimning och en fil med restriktionsenzyminformation krävs. Provfiler, inklusive Test_DATA.fa (sekvensdata), Demultiplexing_Trimming.tsv (sökmotivmotiv) och Enzyme.tsv (restriktionsenzymigenkänningssekvens), tillhandahålls som kompletterande datafiler. De behandlade sekvenserna (värdgenom-sekvenserna) från del 1 kommer att kartläggas mot referensen med användning av BLAT. Platser vid 5'-änden av frågesekvensenEs i referensgenomet anses vara integrationsställen ( tabell 2 ). Sekvensantal för varje IS bestäms i tre steg: (1) kartläggning av IS-sekvenser på genomet med användning av BLAT; (2) jämförelse av enstaka IS-sekvenser (anpassning till en unik plats av värdgenomet) med andra sekvenser som suboptimalt mappades på genomet; Och (3) identifiera och korrigera sekvenseringsfel. Mer detaljer om kartläggning och sekvensräkningsstrategier finns i tidigare studier 2 , 15 . ( BC ) Två enkelsegmenterade DNA-sekvenser för nedströms (B) och uppströms (C) vektor-värd-förbindelserna visas. Pyrosequencing primers A och B (green) används för dropp-PCR och sekvensering. Färgkoderna överensstämmer med de i Figur 1 . Provet nedströms förbindningssekvensen (B) innefattar Primer A (grön), MID (grön), Vector U5-änden (röd), värdgenomet (blå), liNker (lila) och primer B (grön). I en blandad DNA-sekvensering (uppströms och nedströms) används Primer A för sekvensering av nedströms förbindelserna (B) och Primer B används för sekvensering av uppströms förbindelserna. Provet uppströms förbindningssekvensen (C) innefattar Primer B, MID, Vector U3-änden, värdgenomet, linker och Primer A. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativt exempel på dubbelriktad integreringsplatsanalys. ( A ) Procent integration i gener (refseq), Alu och LINE 1 (L1) upprepningar av lentivirala vektorer i humaniserade musrepopulerande celler (LV-huMice), jämfört med i silikogenererade 10.000 slumpmässiga integrationshändelser. Integrationsplatser kartläggsPå humant genom (hg19). LV-huMice-integrationsställen är signifikant överrepresenterade i gener ( p <0,0001, chi-kvadrat approximation) ( B ) I silicoanalys av 10.000 slumpmässiga integrationshändelser. Med en enriktad tillvägagångssätt genererade cirka 52% av slumpmässiga integrmer PCR-ampliconer på <500 bp, medan i en dubbelriktad tillvägagångssätt genererade 77% ett PCR-amplicon på <500 bp i antingen vänster eller höger korsning. PCR-amplikoner som är längre än 500 bp sekvenseras ineffektivt med pyrosequencing plattformen 2 , 15 och bör således uteslutas från kvantitativa data analyser. ( C ) Strategi för klonal kvantifiering. Varje enskild klon delar samma vektorintegritet (eller IS). De relativa frekvenserna för de vänstra (x) och höger (y) förbindelserna kombineras för att representera de relativa kvantiteterna av klonpopulationerna (kvantifierbara vektorintegromer eller QVI). integ Rationsplatser som inte har ett GTAC-motiv inom 450 bp diskvalificeras (dQ) och avlägsnas från kvantifieringsanalys. ( D ) De relativa frekvenserna (i förhållande till alla QVI-sekvenser) av 44 QVI-kloner i humaniserade mössrepopulerande celler visas i ett färgschema (vit till röd: O till 0,16). ( E ) Förväntad överskattning av klonfrekvenser med dubbelriktad analys. Baserat på silico 10.000 slumpmässig integrationsanalys förväntas en 1,25-faldig överskattning vid användning av GTAC-motiv-enzymer ( RsaI och CviQI ) på grund av cirka 20% dQ-kloner. En överskattning på 2,56x förväntas på grund av cirka 60% dQ-kloner när man använder TCGA-motivet enzymet ( Taqal ). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Oad / 55812 / 55812table1.jpg "/>
Tabell 1: Oligonukleotider för Lentiviral och Gamma-retroviral Vector Integration Site Analysis. * 5BioTEG: Biotin modifiering vid 5'-änden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 2: Sekvensuppgifter för representativ insertion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna tabell.
1 Karta: Integrationssekvenser kan kartläggas på ett unikt läge (enkel-hit) eller flera loci (multi-hit) av referensgenomet. NA (ej tillgänglig): ingen sekvens detekterades.
2 STRD: Orientering av frågesekvensen i genomet
3 QLEN: längden på frågesekvensen
4 GLEN: den förväntade längden av integrationssitsekvensen, beräknad baserat på avståndet från närmaste tillgängliga GTAC-motiv i genomet till införingsplatsen. GLEN <450 bp accepteras för kvantitativa analyser.
5 Total_Count: totalt sekvensantal
6 Integrationsställen visas med ett kromosomnummer (CHR) och ett sitenummer för den högra korsningen (CHR_SITE1) och ett nummer för den vänstra korsningen (CHR_SITE2). CHR_SITE1 och CHR_SITE2 är 5 bp för varandra för lentivirala vektorer och 4 bp för varandra för MLV (pMX) vektorer
7 Sekvensantal för den högra korsningen (R_A) och den vänstra korsningen av prov A (L_A); Sekvensräkning för den högra korsningen (R_B) och den vänstra korsningen av prov B (L_B)
* Diskvalificerad (dQ): GLEN ≥450 i silico bp
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tvåriktningsanalysen möjliggör samtidig analys av både uppströms (vänster) och nedströms (höger) vektor-värd-DNA-förbindningssekvenser och är användbar i ett antal genterapi-, stamceller- och cancerforskningsapplikationer. Användningen av GTAC-motiv-enzymer (RsaI och CviQI) och det dubbelriktade PCR-förfarandet förbättrar signifikant chanserna för detektering av en integrom (eller en klonal population) jämfört med tidigare TCGA-motiv-enzym ( Taqal ) -baserade analyser 15 , 15 och andra Enriktade LM-PCR-metoder 5 . Tvåriktningsanalysen förbättrar analysen av IS, särskilt i de begränsade DNA-prover som ofta uppstår i kliniska studier eller små djurmodeller.
Steg 1.1-1.7 är kritiska steg och bör göras utan onödiga förseningar. Dessa steg görs vanligtvis på en dag. Testa enzymer före dessa steg rekommenderas starkt. StegS 1.9 och 1.10 är valfria. Dessa steg kommer att reducera interna vektor-DNA-sekvenser som samtidigt amplifieras med IS-sekvenser. Tabell 1 tillhandahåller primeruppsättningar som är lämpliga för att analysera IS av vildtyp NL4.3 HIV-1, NL4.3-härledda vektorer, inklusive FG12 21 och pMX-baserade gammaretrovirala vektorer 22 . Beroende på nukleotidvariationerna i de långa terminala repetitionssekvenserna (LTR) -sekvenserna kan primerkonstruktionen och försöksmetoden behöva en riktig modifiering.
Blat-programvaran som används för mappning är endast kompatibel med fastformat och fungerar inte med fastq-filer. Man kan konvertera fastq-filerna till fasta med olika programvaruverktyg, till exempel FASTX-Toolkit eller BBTools. En användare med grundläggande kunskaper om python kan använda Biopython för att konvertera fastq-filerna till fasta för att kartlägga dem med blat.
Det förväntas att en del av IS kommer inte att detekteras med dubbelriktad IS-analysen och, även om den detekteras, inte kommer att kvalificera sig för nedströms klonal kvantifiering. När GTAC-motiv-enzymer användes, passerade approximativt 23% av integrmerna i sekvensdatan alstrad av pyrosequenseringsplattformen analyskriterierna för kvantitativ IS-sekvensanalys ( Figur 4 ). När en omfattande IS-täckning är kritisk, till exempel i säkerhetsövervakningen av gentekniska celler i genterapi-inställningar, är det lämpligt att välja en analys med obegränsat genomåtkomst till IS 8 , 9 , 10 , 11 , 12 eller för att omanalysera Samma prov med en annan eller optimerad kombination av restrictaser 4 , 18 .
IS-analyser med obegränsad genomåtkomst, såsom icke-restriktiv LAM-PCR och slumpvis skjuvnings-apprOaches 19 , 20 , håller ett särskilt löfte för omfattande IS-analys. Dessa tillvägagångssätt använder teknik som är relativt svår att kontrollera, vilket gör det svårt att förutse resultatet av genomisk DNA-fragmentering och IS-amplifiering. Å andra sidan har IS-analyser med användning av väl karakteriserade restriktionsenzymer två stora fördelar: (1) Det är relativt lätt att kalibrera och optimera analyser, eftersom analysresultaten är mer förutsägbara beroende på enzymreaktionens specificitet och tillgängligheten av Referensgenomsekvenser. (2) Sekvensdata är mycket reproducerbara när analysbetingelserna har optimerats. Den dubbelriktade PCR med optimerade förhållanden har visat sig användbar för storskalig och exakt klonal kvantifiering 2 , 15 . Även om endast en del av befintliga klonpopulationer har analyserats på grund av restriktionsenzymförspänning, mängderna individuella L-kloner mättes exakt, vilket möjliggjorde den exakta bestämningen av klonstorleksvariationer inom och över prov. Ett tillräckligt antal kloner genererades för bestämning av stamcellsbeteendemönster och funktionell heterogenitet.
De PCR-amplikoner som produceras från detta dubbelriktade PCR-förfarandet är lämpliga för någon nedströms sekvenseringsplattform. På grund av analysens höga känslighet bör största försiktigheten vidtas för att förhindra korskontaminering genom att utföra experiment i ett föroreningsfritt rum. Införandet av ett negativt (inget mall) kontrollexperiment rekommenderas för alla PCR-steg. Även med den mest försiktiga övningen är det extremt svårt att förhindra korskontaminering från prov till prov. Vid jämförelse av klonpopulationer från olika prover är det därför lämpligt att använda en kollisionskontroll, vilken avlägsnar potentiell förorenad data 23 och en avskärning för lågfrekventa, opålitliga kloner> 2 för att minimera buller från tvärförorenat DNA. Det dubbelriktade tillvägagångssättet genererar IS-data för båda ändarna av integreringarna, varigenom ytterligare ett tillfälle ges för att minska potentiella felaktiga detekteringsfel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Finansiering tillhandahölls av National Institutes of Health Grants R00-HL116234, U19 AI117941 och R56 HL126544; National Science Foundation Grant DMS-1516675; Koreas nationella forskningsstiftelse (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); Och KRIBB-initiativprogrammet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10 mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2 mL microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100 - 2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50 - 1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
- Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
- Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
- Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
- Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
- Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
- Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
- Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
- Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
- Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
- Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
- Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).
