Summary
Bu el yazması, aynı anda yukarı akış ve aşağı akış vektör-konakçı bağlantı DNA'sını analiz edebilen çift yönlü bir entegrasyon alanı tahlilinin deneysel prosedürünü ve yazılım analizini anlatmaktadır. Çift yönlü PCR ürünleri, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için kullanılabilir. Ortaya çıkan veriler, entegre DNA hedeflerinin yüksek verimli, niceliksel bir karşılaştırması için kullanışlıdır.
Abstract
Entegrasyon Siteleri (IS) tahlilleri, retroviral entegrasyon sitelerinin incelenmesinin ve biyolojik öneminin kritik bir bileşenidir. Yeni retroviral gen terapi çalışmalarında, IS testleri, yeni nesil sıralama ile birlikte, aynı IS'yi paylaşan klonal kök hücre popülasyonlarının karakterize edilmesi için bir hücre izleme aracı olarak kullanılmıştır. Farklı örnekler içindeki ve üzerinde yeniden popülasyon kök hücre klonlarının doğru bir şekilde karşılaştırılması için, tahlil hassasiyeti, veri tekrarlanabilirliği ve tahlilin yüksek verim kapasitesi, en önemli deney kalitesi arasındadır. Bu çalışma, iki yönlü IS analizi için ayrıntılı bir protokol ve veri analizi iş akışı sağlar. İki yönlü test, aynı anda hem yukarı akış hem de aşağı doğru vektör-konak kavşaklarını sıralayabilir. Geleneksel tek yönlü IS sıralama yaklaşımlarıyla karşılaştırıldığında, iki yönlü yaklaşım IS bulma oranlarını önemli ölçüde geliştirir ve t her iki ucundaki entegrasyon olaylarının karakterizasyonuDNA'yı hedef alıyor. Burada açıklanan veri analizi boru hattı, IS dizilerinin referans genom üzerine eşlendiği ve sıralama hatalarını belirleyen çok sayıda karşılaştırma adımıyla özdeş IS dizilerini doğru olarak tanımlar ve numaralandırır. Optimize edilmiş bir analiz prosedürü kullanarak son zamanlarda binlerce Hematopoietik Kök Hücre (HSC) klonunun rhesus makaklarda transplantasyonun ayrıntılı repopülasyon kalıplarını yayınladık ve ilk kez HSC repopülasyonunun kesin zaman noktasını ve HSC reprodüksiyonunun fonksiyonel heterojenliğini gösterdik. Primat sistemi. Aşağıdaki protokol, özdeş IS dizilerini doğru olarak tanımlayan ve nicelik kazandıran adım adım deneysel işlem ve veri analizi iş akışını tanımlar.
Introduction
Retrovirüsler, genomik DNA'larını çeşitli yerlerde konukçu genomuna yerleştirir. Kanserlerin ve viral patogenezin diğer formlarının gelişmesine katkıda bulunabilecek bu benzersiz mülk, bu virüsleri, gen terapisi ve temel biyoloji araştırmaları için hücresel mühendisliğe oldukça uysal hale getirmenin ironik yararımına sahiptir. Viral Entegrasyon Sitesi (İS) - yabancı bir DNA'nın (virüsün) entegre olduğu konak genomu üzerindeki yeri hem entegre virüslerin hem de konakçı hücrelerin kaderi için önemli etkilere sahiptir. IS tahlilleri, retroviral entegrasyon bölgesi seçimini ve patogenezini, kanser gelişimini, kök hücre biyolojisini ve gelişimsel biyolojiyi incelemek için çeşitli biyolojik ve klinik araştırmalar ortamında kullanılmıştır. 1 , 2 , 3 , 4 . Düşük algılama hassasiyeti, zayıf veri tekrarlanabilirliği ve sıkça çapraz bulaşmaIS tahlillerinin mevcut ve planlanan çalışmalara uygulanmasını sınırlayan başlıca faktörler.
Pek çok IS analiz teknolojisi geliştirildi. Bağlayıcı-Aracılı (LM) Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) 5 , ters PCR 6 ve Lineer-Amplifikasyon-Aracılaştırılmış (LAM) PCR 7 dahil olmak üzere sınırlama enzimine dayalı entegrasyon bölgesi testleri en çok kullanılanlardır. Bununla birlikte, alana özgü kısıtlama enzimlerinin kullanılması, IS'nin alınması esnasında bir önyargı üretir ve kısıtlama bölgesi çevresinde yalnızca integromların bir alt kümesinin (konakçı genomuna entegre edilmiş yabancı bir DNA'nın) elde edilmesine izin verir 4 . Vektör IS'yi daha kapsamlı olarak değerlendiren tahlil teknolojileri de son yıllarda tanıtıldı. Bu tahliller, Mu transpozon aracılı PCR 8 , nonrestrictif (nr) -LAM PCR 9 , tip-II kısıtlama enzimi-m( 10) , mekanik kesme ( 11 ) ve genomik DNA'ları parçalamak için Rasgele Heksamer'e Dayalı PCR (Re-free PCR) ( 12 ) kullanılarak çoğaltılabilir. Mevcut teknolojiler, tespit hassasiyeti, genom kapsama alanı, hedef özgünlüğü, yüksek verimli kapasite, analiz prosedürlerinin karmaşıklığı ve hedef bölgelerin göreceli frekanslarının saptanmasında önyargılar olmak üzere farklı seviyelerde değişir. Mevcut tahlillerdeki değişen nitelikler ve bunların kullanılabileceği çeşitli amaçlar göz önüne alındığında, optimal tahlil yaklaşımı dikkatle seçilmelidir.
Bu çalışma, entegre hedef DNA'nın yukarı akış ve akış aşağısında eşzamanlı olarak analiz ederek bulma hızlarını ve dizi nicelik doğruluğunu önemli ölçüde geliştiren çift yönlü bir analiz için ayrıntılı deneysel prosedürleri ve hesaplama veri analizi iş akışını sağlar (bakınız, tahlil prosedürlerinin şematik bir görünümü için Şekil 1). ). Bu yaklaşım aynı zamandaRetroviral entegrasyon sürecini karakterize etmek için araçlar (örneğin, hedef bölge duplikasyonunun geçerliliği ve yukarı akış ve aşağı akış eklemelerinin genomik sekanslarındaki değişiklikler). Diğer iki yönlü yöntemler öncelikle hedef DNA 11 , 13 , 14'ün her iki ucunun klonlanması ve dizilmesi için kullanılmıştır. Bu tahlil, iyi kurulmuş LM-PCR yöntemi ve hesaplama analizi haritalaması kullanılarak ve hem yukarı hem de aşağı doğru kavşakların nicelleştirilmesi için vektör işaretli klonların yüksek verimli ve tekrarlanabilir kantifikasyonu için kapsamlı şekilde optimize edilmiştir. TaqαI enzimi ile çift yönlü analiz, klinik öncesi çalışmalar 2 , 15'de kök hücre gen tedavisinde yüksek verimli klonal niceleme için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu makale, daha sık kesici (RsaI / CviQI - motif: GTAC) kullanılarak tTaqαI tabanlı bir teste kıyasla integromlar tespit etme şansı . Lentiviral (NL4.3 ve türevleri) ve gamma-retroviral (pMX vektörleri) vektör IS analizi için GTAC motif enzimlerini kullanan ayrıntılı deneysel ve veri analizi işlemleri anlatılmıştır. Deneyde kullanılan oligonükleotidler Tablo 1'de listelenmiştir. IS dizisi analizi için bir dahili programlama betiği ek belgede sağlanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Upstream (sol) - ve Downstream (sağ) -Junction Sıralı Kütüphaneleri Oluşturma
- DNA bağlayıcı preparatı:
- 100 uM LINKER_A oligos (son: 20 uM) 2 mcL, 100 uM LINKER_B oligos (final: 20 uM) 2 mcL, 5 M NaCl (final: 1M) 2 mcL ve 2 mcL ekleyerek 10 uL linker DNA çözeltisi hazırlayın ve PCR tüpünde 4 uL nükleaz içermeyen su. Bağlayıcı dizileri için Tablo 1'e bakın.
- Linker DNA çözeltisini 95 ° C'de bir PCR aletinde 5 dakika inkübe edin, çalıştırma programını durdurun ve PCR aletinin gücünü kapatın. Linker DNA'sını yavaşça soğutmak için linker solüsyonunu 30 dakika boyunca cihazda bırakın. Bağlayıcı DNA çözeltisi, 4 ° C'de saklanabilir.
- LTR'ye özgü biyotin-primer uzantısı:
- İn vivo DNA konsantrasyonunu ve genomik DNA'nın 260/280 nm değerlerini belirlemek için UV-Vis spektrofotometre kullanınVeya in vitro deneyler. Nükleaz içermeyen su kullanarak 170 μL genomik DNA çözeltisinin son bir hacmine 1-2 mikrogram örnek genomik DNA seyreltin.
- 10 uM HIV-1'e spesifik biotin primerleri ( Tablo 1'de L-BP'ler ve R-BP'ler): 2.5 μL'yi, dört lentivirene spesifik primerler için toplam 10 uL toplam), 10X'lik termostabil 20 mcL'yi karıştırarak 200 μL PCR reaksiyonu hazırlayın DNA polimeraz tamponu, 4 mcL 10 mM dNTP (son: 200 uM her dNTP), 3 uL 2.5 U / μL termostabil DNA polimeraz ve 163 μL genomik DNA.
NOT: Gamaretroviral vektörler (pMX vektörleri) için, yukarıdaki dört HIV-1'e spesifik biyotin primerleri yerine iki adet 10 uM pMX spesifik biyotin primeri (L-BP ve R-BP: toplam 10 uL) her biri 5 uL kullanın. - Çözümü dört PCR tüpüne bölün (her biri 50 mcL) ve aşağıdaki koşullar altında tek bir genleşme döngüsü uygulayın: 94 ° C'de 5 dakika, 56 ° C'de 3 dakika, 72 ° C'de 5Dk, depolama için 4 ° C.
- Dört PCR reaksiyonunu 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne dökün ve PCR saflaştırma kitinin PCR saflaştırma prosedürünü izleyin. 50 uL elüsyon tamponu (kitte verilen 5 kat suyla seyreltilmiş elüsyon tamponu) ile elute edin. Adım 1.3.1 ile derhal gidiniz veya elute edilen DNA'yı -20 ° C'de saklayınız.
- RsaI ve CviQI sindirimi
- 50 mcL DNA (adım 1.2.4'ten), 10 uL 10x tampon A ve 2 uL (20 U) RsaI enzimi ekleyerek 100 μL sindirim reaksiyonu hazırlayın. Bir PCR aletinde 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- Reaksiyona 1 uL (10 U) CviQI enzimi ekleyin ve bir PCR aleti içinde 25 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Hemen adım 1.4.1 ile devam edin
- Kör bitiş:
- 2.5 μL DNA Polimeraz I büyük (klenow) fragmanı ve 2 uL 10 mM dNTP içeren 4.5-μL karışımı hazırlayın. Transfer 1Adım 1.3.2'deki DNA örneğine 81 L karışım Toplam hacim 102 μL olacaktır. Vorteksleyerek iyice karıştırın ve bir PCR aletinde 25 ° C'de 1 saat inkübe edin. Hemen adım 1.6.1 ile devam edin.
- Streptavidin boncuklarının hazırlanması:
- Kısaca streptavidin boncuk çözeltisini vorteksleyin ve yeni bir 2 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne 50 mcL aktarın. Manyetik stand kullanarak süpernatantı çıkarın ve boncukları 200 μL bağlama solüsyonu ile yıkayın.
- Bağlayıcı çözeltinin 100 μL'sinde boncukları tekrar süspanse edin ve boruyu manyetik standın uzağına yerleştirin. Hemen adım 1.6.1 ile devam edin.
- Streptavidin boncuk bağlama:
- 100 μL yeniden süspansiyon haline getirilmiş boncuk çözeltisine (adım 1.5.2) numune DNA'sının 100 μL'sini (adım 1.4.1) aktarın ve çözeltinin köpürmesini önlemek için pipetle dikkatlice karıştırın. Tüp, dönen bir tekerlek veya silindir üzerinde oda sıcaklığında 3 saat inkübe edin.
- Boncukları yakalamak ve süpernatanı atmak için manyetik standı kullanın. Boncukları 400 μL yıkama çözeltisi ile iki kez yıkayın ve 400 μL 1x T4 DNA ligaz tamponu (nükleaz içermeyen su ile 10X çözeltiden sulandırılmış) içinde iki kez yıkayın.
- 200 μL 1x T4 DNA ligaz tampon (nükleaz ücretsiz su kullanarak 10X çözüm sulandırılmış) boncuk tekrar süspanse edin ve manyetik stand uzağa yerleştirin. Hemen adım 1.7.1 ile devam edin.
- Linker ligasyonu:
- DNA bağlayıcı 0.5 mcL (adım 1.1.2), 10 x T4 DNA ligaz tampon 10 mcL, 5X T4 DNA ligaz tampon 20 mcL (% 25 polietilen içeren karıştırarak 2 mL mikrosantrifüj tüp içinde 400 mcL ligasyon reaksiyon çözümü hazırlayın Glikol), 5 uL T4 DNA ligazı, 164.5 uL nükleaz içermeyen su ve 200 uL tekrar süspansiyon haline getirilmiş boncuklar (basamak 1.6.3). Reaksiyon tüpünü döndürme tekerleğine yerleştirin ve oda sıcaklığında (22 ° C) 3 saat (veya 16 ° C / N) inkübe edin. Boncukları yıkama çözeltisi ile iki kez yıkayın ve manyetik stand kullanarak, 1X ısıya dayanıklı DNA polimeraz tamponu (nükleaz içermeyen su ile 10x çözeltiden seyreltilmiş) ile iki kez yıkayın.
- Boncukları 50 μL 1x termostabil DNA polimeraz PCR tamponu içinde süspansiyon haline getirin ve manyetik standın uzağına yerleştirin. Hemen adım 1.8.1 ile devam edin veya bir gün süreyle 4 ° C'de saklayın.
- Sol ve sağ bağlantı DNA'sının ön amplifikasyonu:
- 10 uM 1L primer 10 mcL, 10 mcM 1R primer 10 mcL, 10 uM primer Link1 (Tablo 1) 20 mcL, 10 uM termostabil DNA polimeraz tampon 10 mcL, 4 mcL 10 mcL ekleyerek 200 μL PCR reaksiyon hazırlayın Adım 1.7.3'teki yeniden askıya alınmış boncuklara (50 uL), 10 mM dNTP'ler (her dNTP'den 200 uM), 8 uL (20 U) termostabil DNA polimeraz ve 88 uL nükleaz içermeyen su ilave edildi.
- Reaksiyon karışımını 4 PCR tüpüne (her biri 501; L) ve aşağıdaki koşullarla PCR gerçekleştirin: 94 ° C inkübasyon 2 dakika boyunca; 20 saniye için 94 ° C, 25 saniye için 56 ° C ve 2 dakika boyunca 72 ° C'lik 25 döngü; Ve son uzantı 72 ° C'de 5 dakika.
- 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 4 PCR reaksiyonu yapın ve PCR saflaştırma kitinin PCR saflaştırma prosedürünü uygulayın. 50 uL elüsyon tamponu ile elute edin.
- Bir UV-Vis spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ve 260/280-nm değerlerini belirleyin; DNA sonraki aşamaya gelene kadar -20 ° C'de saklanabilir. 1.9.1 / 1.10.1 adımlarıyla (isteğe bağlı) veya doğrudan 1.11.1 / 1.12.1 adımlarıyla devam edin.
- Sol taraftaki dahili DNA amplikonunun çıkarılması (isteğe bağlı):
- Adım 1.8.4'ten 100 ng PCR DNA ürününü 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve nükleazsız su kullanarak hacmi 10 μL'ye ayarlayın.
- Sol taraftaki iç D'yi spesifik olarak hedefleyen bir kısıtlama enzimi reaksiyonu hazırlayınNA amplikon.
NOT: Tepkime koşulu, enzim seçimine bağlı olarak farklılık gösterebilir. Örneğin, sol taraftaki dahili DNA'yı NL4.3'e dayalı lentiviral vektörlerden çıkarırken 1 μL pvuII, 2 μL Tampon B ve 7 μL nükleaz içermeyen su ilave edin. Bir PCR aletinde 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Hemen adım 1.11.1 ile devam edin veya -20 ° C'de saklayın.
- Sağ taraftaki dahili DNA amplikonunun çıkarılması (isteğe bağlı):
- Adım 1.9.1'deki gibi devam edin.
- Sağ taraftaki dahili DNA amplikonunu spesifik olarak hedefleyen bir kısıtlama enzimi reaksiyonu hazırlayın.
NOT: Örneğin, sağ taraftaki dahili DNA'yı NL4.3'e dayalı lentiviral vektörlerden çıkarırken, 1 μL sfoI , 2 μL Tampon B ve 7 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. Bir PCR aletinde 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Hemen adım 1.12.1 ile devam edin veya -20 ° C'de saklayın.
- AyrıldıBirleşime özgü amplifikasyon:
- Adım 1.8.4'ten 5 μL DNA (veya isteğe bağlı adım 1.9.2'den), 10 uM 2L-primer (final: 1 μM) 5 μL, 10 uM primer Link2'nin 5 μL'si karıştırılarak 50 μL PCR reaksiyonu hazırlayın (Nihai: her bir dNTP'nin 200 uM'si), 2 mcL (5 U) termostabil DNA polimeraz ve 27 uL nükleaz içermeyen (nihai: 1 uM) 5 mcL 10x termostabil DNA polimeraz tamponu, 1 uL 10 mM dNTP'ler Su.
- PCR'ı aşağıdaki koşullarla gerçekleştirin: 3 dakika 94 ° C inkübasyon; 20 saniye için 94 ° C, 25 saniye için 56 ° C ve 2 dakika boyunca 72 ° C'lik 8-15 döngü; Ve son uzantı 72 ° C'de 5 dakika.
NOT: Amplified DNA, -20 ° C'de saklanabilir. * Çevrim sayısı optimizasyonu önerilir. - PCR saflaştırma kitinin PCR saflaştırma prosedürünü izleyin. 50 uL elüsyon tamponu ile elute edin. DNA konsantrasyonunu ve 260/280 nm değerlerini belirleyin.
- Bütün prosedürler, farklı primerlerin kullanılması haricinde "Sol kavşağa spesifik amplifikasyon" (adım 1.11.1-1.11.3) ile aynıdır; Bu aşamadaki doğru bağlantıya özgü primeri (2R-primeri, bkz. Tablo 1 ) kullanın.
- PCR amplikon uzunluk varyasyonları% 2 agaroz jel elektroforezi veya kapiler elektroforez uygulayarak analiz edin ( Şekil 2 ).
NOT: Bu, tahlil prosedürlerinin tamamlandığını teyit etmek ve PCR band örüntülerine dayalı olarak IS kalıplarının kaba bir şekilde değerlendirilmesi için önemli bir adımdır. Adım 1.11.3 ve 1.12.3'teki saflaştırılmış PCR amplikonu, çeşitli DNA sıralama platformları için kullanılabilir. Klasik zincir sonlandırma (Sanger) dizilimi veya yeni nesil sıralama için uygun örnek hazırlama prosedürlerini uygulayın. DNA -20 ° C'de saklanabilirC.
2. Hesaplamalı IS Sırası Analizi
- Veri dosyalarının hazırlanması:
- Üç girdi veri dosyasını hazırlayın: fasta formatlı bir veri dosyası (Ek veri olarak Test_data.fa), vektör ve linker dizileri için arama motifleri için bir tsv dosyası (ek veride Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv) ve kısıtlama enzimi bilgisi için bir tsv dosyası (Ek veri Enzyme.tsv).
NOT: Bu dosyalar, demultipleksleme, vektör ve bağlayıcı dizilerini düzeltme ve iç vektör dizilerini kaldırma için gereklidir ( Şekil 3A ). Hesaplamalı iş akışını uygulamak için ayrıntılı adım adım talimatlar, tamamlayıcı verilerdeki README.txt dosyasında sağlanmaktadır.
- Üç girdi veri dosyasını hazırlayın: fasta formatlı bir veri dosyası (Ek veri olarak Test_data.fa), vektör ve linker dizileri için arama motifleri için bir tsv dosyası (ek veride Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv) ve kısıtlama enzimi bilgisi için bir tsv dosyası (Ek veri Enzyme.tsv).
- Hesaplamalı analiz:
- Çoğaltma ve kırpma komut dosyalarını çalıştırın.
NOT: Ham dizilim, çoklama ve trimmin için işlenecektirG vektör, bağlayıcı ve primer dizileri (ek README.txt dosyasındaki ADIM-1'e bakın). - İşlenmiş dizileri bir BLAST benzeri hizalama aracı (BLAT; www.genome.ucsc.edu) kullanarak referans genom üzerine eşleştirmek için mapping komutunu çalıştırın (bkz. README.txt dosyasındaki STEP-2).
- Kantitatif IS analiz komut dosyasını çalıştırın (README.txt dosyasındaki ADIM-3'e bakın).
NOT: İki çıktı dosyası (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt ve Final_count.txt) oluşturulur. Haritalama ve dizi numaralandırma stratejileri hakkında daha fazla bilgi, ek verilerin README.txt dosyasında ve daha önceki yayınlar 2 , 15'de bulunabilir.
- Çoğaltma ve kırpma komut dosyalarını çalıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çift yönlü IS tahlili, yukarı akış (sol) ve aşağı akış (sağ) vektör konakçı kavşakları için farklı boyutlarda PCR amplikonları üretti ( Şekil 2 ). Bir PCR amplikonunun boyutu, bir integramdan yukarı ve aşağı doğru en yakın GTAC motifinin konumuna bağlıdır. Deney ayrıca dahili DNA PCR amplikonları üretti: sırasıyla sol ve sağ bağlantıda PCR sırasında polipurin yoluna yakın retroviral sekanslar ve primer bağlanma bölgesi birlikte amplifiye edildi. PCR amplikon bantları kılcal veya agaroz (% 2) elektroforezi ile görselleştirilebilir.
Sıralamadan sonra, hem sol hem de doğru bağlantı sıraları, ham dizileri (demultipleksleme ve düzeltme vektörü ve bağlayıcı DNA dahil) ön işleme koymak için bir kurum içi programlama betiği tarafından analiz edildi, IS dizileri genomda haritalandı, özdeş IS'nin belirlenmesi ve sayılmasıDizileri ve hata düzeltme prosedürlerini uygulayarak ( Şekil 3 ). Referans genomundaki sorgu dizilerinin 5'-ucunun yerleri IS olarak kabul edilir ve her IS'nin başlangıç sayımı için kullanılır. İki eşleşen diziyi (aynı integralten kaynaklanan yukarı akış (sol) ve aşağı doğru (sağ)) olan birleşim dizilerini belirleyen kriterler, retrovirüse spesifik uyumlu entegrasyonun nükleotid diziliş modellerine dayanır ve aşağıdaki gibidir: (i) İki bağlantı sırası Karşıt yönlerde genoma hizalayın. (Ii) İki bağlantı türünün IS'si insan bağışıklık yetersizliği virüsü (HIV) vektörleri için 5-bp örtüşme ve sıçangil lösemi virüsü (MLV) vektörleri için 4-bp örtüşme ile ayrılmıştır. HIV'in iki bağlantı kavşağının ilk 5bp'si ve MLP kavşaklarının 4bp'si ters tamamlayıcıdır.
IS dizisi sayımları üç aşamada belirlenir: (1) eşleme dizileri genom üzerineEşleme kalitesini üreten ve bireysel IS dizilerini "tek isabetli", "çoklu isabetli", "isabet etmeyen" ve "diğer" gruplara ayıran BLAT kullanarak; (2) tek vuruşlu dizileri, çok vuruşlu, vurulmamış ve diğerleri de dahil olmak üzere, alt zamanlamalı olarak eşlenmiş dizilerle karşılaştırmak için Temel Yerel Hizalama Aracı Aracı'nı (BLAST) kullanın; Ve (3) homopolimer hataları da dahil olmak üzere, dizilim hatalarının belirlenmesi ve düzeltilmesi. Çok vurulan sekanslar, iki veya daha fazla genomik pozisyonu yüksek bir haritalama puanı ile hizalayabilen IS sekanslarıdır. Klon popülasyonlarının belirlenmesi ve nicelleştirilmesi için yine de yararlı olmakla birlikte, çok çarpılmış diziler, genomik entegrasyon bölgesi dağılım modellerini karakterize etmek için (örneğin, genler, tekrarlar veya diğer genomik karakterler ile ilişkilendirme) kullanılamaz. Bazı nadir durumlarda, iki bağlantı sırası farklı haritalama nitelikleri gösterir. Örneğin, birinde "tek sıralı", eşleşen dizide "çoklu isabet" gösterilir. Bu gibi durumlarda, her ikisiDizileri "tek vuruşlu" diziler olarak ele alınır.
Anormal bir sorgu boyutu (QSIZE) ile yüksek yüzde genom eşleştirmesini (kimlik) gösteren (veya tam tersi) en uygun optimal haritalama puanı ile IS dizilerinin bir kısmı, "hayır-çalınanlar" dan ayrılmış ve "diğerlerine" Manuel yeniden değerlendirme. Örneğin, genom haritalaması için BLAT kullanırken, bazı IS dizileri ilk veya son 5-10 nükleotideki özdeş olmayan nükleotidlerden dolayı anormal bir QSIZE gösterebilir. Bu diziler, nispeten yüksek kaliteli bir eşleme sonucuna rağmen "tek vuruşlu" veya "çok vurulan" durum için genellikle eşleme ölçütlerini karşılamaz.
Bir örnek ham dizi veri dosyası (Test_DATA.fa: 33,374 dizileri) ve örnek çıktı veri dosyaları ek veri olarak sağlanmaktadır. İnsan yeniden çoğaltan hücrelere ait 1 mikrogram genomik DNA, ödünç verilir Bir hümanize kemik iliği / karaciğer / timus (BLT) fare 17'deki viyal vektörler (FG12) çift yönlü analiz kullanılarak analiz edildi. Genomun her yerinde retroviraller IS bulundu. Tipik olarak, lentiviral vektörler genlerde fazla gösterilirken, gama-retroviral vektörler transkripsiyon başlangıç bölgelerinde ( 16 ) aşırı temsil edilmiştir ( Şekil 4 ). İki insan repopülasyon hücresi örneğinden, yukarı akım (sol) ve aşağı akış (sağ) kavşaklardan 851 dizi, IS sekansı olarak nitelendirildi. Bu sekanslardan, soldaki 93 eşsiz IS ve sağ kavşaklardaki 50 benzersiz IS tespit edildi. Bunlardan 44'ü hem sol hem de sağ kavşakta tanımlandı ve test numunelerinde toplam 99 eşsiz integrom görüldü. IS, rasgele olaylarla karşılaştırıldığında genlerde (% 66, p <0.0001) zengin biçimde zenginleşmiştir ( Şekil 4A ).
"> Örnek veri olarak gama-retrovirüs vektörü (pMX) entegrasyon bölgesi dizileri de dahil edilmiştir PxX ile ifade edilen Oct4, cMyc, Klf4 ve Sox2, 1,611 IS dizileri ve 129 eşsiz benzeri Pmx mühendislik hücresi örneğinden transdüser Sırasıyla sol ve sağ kavşaklarda 65 ve 76 benzersiz IS belirlenmiş olup, 12 kavşakta ikisi kavşakta idi.≥500 bp'lik PCR amplikonlarının, piroekspresyon platformunda zayıf olarak dizilenip, <500 bp'lik PCR amplikonları, dizi uzunlukları 15'e göre belirgin bir önyargı olmadan, genel olarak iyi sıralanmıştır. Böylece, ≥ 500 bp PCR amplikonlarından gelen dizi verileri, uzunluk ile ilişkili sıralama önyargısını kaldırmak için hariç tutulmuştur. Kantitatif klon analizi için sadece <500 bp PCR amplikonundan (ölçülebilir vektör integral adı verilen veya QVI olarak anılacaktır) veriler kullanılmıştır. Vektör integrromlarının bağıl bulma frekansları<500 bp PCR amplikonları üreten IS kavşaklarının yalnızca dizi sayısı kullanılarak hesaplandı ( Şekil 4B- 4D ; ayrıca bkz. Tablo 2 ). Vektörlerin yaklaşık% 77'si, bu strateji ile niceliksel olarak analiz edilebilir ( Şekil 4B ). Sonuç olarak, her QVI'nin hesaplanan frekanslarının, örnekteki gerçek frekansları ( Şekil 4E ) 1.25x fazla tahmin etmesi bekleniyordu.
Şekil 1: İki Yönlü Uyum Yerinin Analizinin Şematik Görünümü. Hücresel DNA (mavi) ile çevrili çift telli retroviral DNA (siyah ve kırmızı) gösterilmiştir. Oklar oligonükleotid primerlerini, yıldız işaretli oklar biotin primerlerini temsil eder. Bağlayıcı DNA'lar mor renkli çizgilerle gösterilir. Kısacası, solun doğrusal bir uzantısıViral Uzun Terminal Tekrarından (LTR) alınan biyotin primerleri (L-BP) ve sağ biyotin primerleri (R-BP), biyotinile edilmiş, çift telli IS DNA üretir. CviQI ve RsaI ile söndürüldükten sonra, biyotinlenmiş çift sarmallı DNA, streptavidin-biyotin-spesifik bağlanma ile zenginleştirildi ve bağlayıcı DNA ile bağlandı. Streptavidin ile yakalanan, bağlayıcıyla bağlanmış vektör-konakçı bağlantı DNA'ları, iki aşamalı PCR ile amplifiye edilir: ön amplifikasyon (hem sol hem de sağ kavşakların amplifikasyonu) ve bunu takiben her biri sol ve sağ kavşakları hedef alan iki iç içe PCR. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Temsilci PCR Amplicon Görüntüsü. ( A ) Kapiler elektroforez analizi PCR amplifikatörünün değişen uzunluklarını gösterirPvuII veya sfoI sindiriminden sonra lentiviral vektör (FG12) entegrasyon bölgelerindeki lizinler . Yukarı akış (sol) ve aşağı akış (sağ) vektörel ana birleşimler için değişken PCR bantları gösterilmektedir. Karanlık ok başları, pvuII veya sfoI sindiriminden sonra kalan dahili vektör DNA amplikonlarını gösterir. DNA boy işaretleyicisi (0,1 - 2,5 kbp) M şeridi üzerindedir. Açık ok başları hizalama markörleri (15 ve 5,000 bp) gösterir. DNA hizalama işaretleyicileri, tüm kanallar arasındaki geçiş süresi değişiminin kalibrasyonu için kullanılır. ( B ) Birden fazla pMX vektörü ile dönüştürülen fare hücresi klonlarındaki gam-retroviral (pMX) vektör entegrasyon bölgeleri. Sol ve sağ kavşak DNA'larının yanı sıra dahili vektör DNA amplikonları (ok başları) gösterilir. Karanlık ve açık ok başları, sırasıyla, iç vektör DNA'sını ve hizalama markörlerini gösterir. DNA büyüklüğü markörü (50-1,500 bp) M şeridi üzerindedir. Kılcal elektroforez ile ilgili ayrıntılar şirkette bulunabilirprotokol. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Entegrasyon Site Sırası Analizi. ( A ) Hesaplamalı veri analizi için bir akış şeması. Bir fasta formatlı dizi dosyası, çoklama-çoğaltma ve kırpma için referans dizisi motifleri içeren bir dosya ve kısıtlama enzimi bilgileri içeren bir dosya da dahil olmak üzere üç veri dosyası gereklidir. Test_DATA.fa (sekans verileri), Demultiplexing_Trimming.tsv (arama dizisi motifleri) ve Enzyme.tsv (sınır enzim tanıma sekansı) dahil olmak üzere örnek dosyalar ek veri dosyaları olarak sağlanmaktadır. Bölüm 1'deki işlenmiş sekanslar (konakçı genom dizileri) BLAT kullanılarak referansa eşlenir. Sorgu sıralamasının 5'-ucundaki yerlerReferans genomundaki eserler, entegrasyon bölgeleri olarak kabul edilir ( Tablo 2 ). Her IS için dizi sayısı, üç aşamada belirlenir: (1) dizileri, BLAT kullanarak genom üzerine diziler; (2) tek vurumlu IS dizilerinin (konukçu genomun eşsiz bir sitesinde hizalanması) genom üzerinde en iyi şekilde eşleştirilen diğer diziler ile karşılaştırılması; Ve (3) sıralama hatalarını belirleme ve düzeltme. Haritalama ve dizi numaralandırma stratejileri hakkında daha fazla bilgi, önceki çalışmalar 2 , 15'de bulunabilir. ( BC ) Aşağı akış (B) ve akış yukarı (C) vektör-konak kavşakları için iki örnek tek sarmallı DNA dizisi gösterilmektedir. Pyrosequencing primerleri A ve B (yeşil), damlacık PCR ve dizilimi için kullanılır. Renk kodları Şekil 1'deki renk kodlarıyla aynıdır. Örnek akış aşağı bağlantı sırası (B), Primer A (yeşil), MID (yeşil), Vektör U5 sonu (kırmızı), konak genomu (mavi), liNker (mor) ve Primer B (yeşil). Karışık (upstream ve downstream) DNA dizilemesinde, primer A, akışaşımı bağlantı noktalarının sıralanması için kullanılır (B) ve primer B, upstream bağlantı noktalarının sıralanması için kullanılır. Örnek yukarı akım bağlantı dizisi (C), Primer B, MID, Vector U3 sonu, konak genomu, linker ve Primer A içerir. Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen burayı tıklayın.
Şekil 4: İki Yönlü Uyum Yerinde Analizin Temsilci Örneği. ( A ) Genler (refseq), Alu ve silinen-üretilen 10.000 rasgele entegrasyon olaylarıyla karşılaştırıldığında, hümanize fare yeniden popülasyon hücrelerinde (LV-huMice) lentiviral vektörlerin LINE 1 (L1) tekrarları yüzdesi entegrasyonu. Entegrasyon siteleri eşleştirildiInsan genomuna (hg19). LV-huMice entegrasyon siteleri, Genler'de önemli derecede fazla temsil edilmektedir ( p <0.0001, ki-kare yaklaşımı) ( B ) 10,000 rasgele integrasyon olayının siliko analizinde. Tek yönlü bir yaklaşımla rasgele integromların yaklaşık% 52'si <500 bp'lik PCR amplikonları üretirken, iki yönlü bir yaklaşımla% 77'si sol veya sağ kavşaklarda <500 bp'lik bir PCR amplikonu üretti. 500 bp'den daha uzun PCR amplikonları, pirolizleme platini 2 , 15 ile verimsiz sekanslıdır ve bu nedenle nicel veri analizlerinden çıkarılmalıdır. ( C ) Klonal kantifikasyon için strateji. Her bireysel klon aynı vektör integrome (veya IS) paylaşır. Sol (x) ve sağ (y) birleşimlerinin göreceli frekansları, klonal popülasyonların göreceli miktarlarını (nicelenebilir vektör integromları veya QVI) temsil etmek üzere birleştirilir. Integ 450 bp içerisinde bir GTAC motifine sahip olmayan rasyon siteleri diskalifiye edilir (dQ) ve nicelik analizi analizinden çıkarılır. ( D ) Hücre yenilenen hümanize farelerde 44 QVI klonunun göreli frekansları (tüm QVI sekanslarına göre) bir renk şemasında (kırmızıdan kıza 0 ile 0.16 arasında) gösterilir. ( E ) Çift yönlü analizle klonal frekansların aşırı tahmin edilmesi bekleniyor. Silico 10,000 rasgele entegrasyon analizine dayanarak GTAC motif enzimlerini ( RsaI ve CviQI ) kullanırken, yaklaşık% 20 dQ klonundan dolayı 1.25 kat fazla tahmin gerçekleştirilmesi beklenir. TCGA motif enzimi ( TaqαI ) kullanıldığında yaklaşık% 60 dQ klonundan dolayı 2.56x aşırı tahmini beklenir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Oad / 55812 / 55812table1.jpg "/>
Tablo 1: Lentiviral ve Gamma-retroviral Vektör Entegrasyon Yerinin Analizi için Oligonükleotidler. * 5BioTEG: 5 'ucundaki biotin modifikasyonu. Bu tablonun daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Temsilci Yerleştirme Saha Dizi Sayımı Verileri. Bu tablonun daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
1 Harita: entegrasyon sitesi dizileri, referans genomun benzersiz bir yerine (tek vuruşlu) veya birden fazla lokusun (çoklu vuruşlu) eşleştirilebilir. NA (mevcut değil): herhangi bir dizi tespit edilmedi.
2 STRD: genomdaki sorgu sırasının yönü
3 QLEN: sorgu dizisinin uzunluğu
4 GLEN: genomdaki en yakın GTAC motifinin ekleme bölgesine olan mesafesine dayanılarak hesaplanan, entegrasyon bölgesi dizisinin beklenen uzunluğu. Nicel analizler için GLEN <450 bp kabul edilir.
5 Total_Count: toplam sıra sayısı
6 İntegral siteleri, bir kromozom numarası (CHR) ve sağ kavşak için bir site numarası (CHR_SITE1) ve sol kavşak için bir sayı (CHR_SITE2) ile gösterilir. CHR_SITE1 ve CHR_SITE2, lentiviral vektörler için 5 bp'dir, MLV (pMX) vektörleri için 4 bp'dir
7 Sağ A kavşağı (R_A) ve A numunesinin sol kavşağı için dizi sayısı (L_A); Doğru kavşağa (R_B) ait sıralı sayımlar ve örnek B'nin (L_B) sol kavşağı
* Diskalifiye (dQ): GLEN ≥450 in silico bp
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çift yönlü analiz hem yukarı akış (sol) hem de akış aşağı (sağ) vektör-konak DNA birleştirici dizilerinin eşzamanlı analizini mümkün kılar ve bir dizi gen terapisi, kök hücre ve kanser araştırma uygulamaları için yararlıdır. GTAC motif enzimlerinin (RsaI ve CviQI) ve çift yönlü PCR yaklaşımının kullanılması, önceki TCGA motif enzimine ( TaqαI ) dayalı tahliller 2 , 15 ve diğerlerine kıyasla bir integrome (veya klonal popülasyon) bulma şansını önemli ölçüde artırır Tek yönlü LM-PCR yaklaşımları 5 . İki yönlü test, özellikle klinik veya küçük hayvan model çalışmalarında ortaya çıkan sınırlı DNA örneklerinde, IS analizini geliştirir.
Adımlar 1.1-1.7 kritik adımdır ve gereksiz gecikmeler olmadan yapılmalıdır. Bu adımlar genellikle bir gün içinde yapılır. Bu aşamalardan önce enzimlerin test edilmesi şiddetle tavsiye edilir. AdımS 1.9 ve 1.10 isteğe bağlıdır. Bu adımlar, IS dizileri ile eşzamanlı olarak çoğaltılan iç vektör DNA dizilerini azaltacaktır. Tablo 1, FG12 21 de dahil olmak üzere, vahşi tip NL4.3 HIV-1, NL4.3 türevli vektörlerin IS'sini ve pMX-bazlı gamamaretroviral vektörleri 22 analiz etmek için uygun primer setleri sağlar. Uzun terminal tekrarındaki (LTR) sekanslardaki nükleotid varyasyonlarına bağlı olarak, primer tasarımı ve deneysel yaklaşım uygun bir modifikasyona ihtiyaç duyabilir.
Haritalama için kullanılan blat yazılımı yalnızca fasta formatıyla uyumludur ve fastq dosyaları ile çalışmaz. Fastq dosyalarını FASTX-Toolkit veya BBTools gibi çeşitli yazılım araçlarını kullanarak fasta'ya dönüştürebilirsiniz. Python'la ilgili temel bilgilere sahip bir kullanıcı, fastfile dosyalarını fastfile dönüşümü için Biopython'u kullanabilir.
IS'nin bir bölümünün iki yönlü I ile algılanmayacağı beklenmektedirS tahlili ve saptanması halinde bile, aşağı akış klonal kantifikasyon için uygun değildir. GTAC motif enzimleri kullanıldığında, piroekspresyon platformu tarafından üretilen dizi verilerindeki integromların yaklaşık% 23'ü nicel IS dizi analizi için analiz kriterlerini geçmedi ( Şekil 4 ). Kapsamlı IS kapsamı kritik olduğunda, örneğin gen tedavisi alanındaki gen mühendisliğine tabi tutulmuş hücrelerin emniyet gözetiminde, IS 8 , 9 , 10 , 11 , 12'ye sınırsız genom erişimine sahip bir testi seçmek veya Aynı örnek, kısıtlayıcılar 4 , 18'in farklı veya optimize kombinasyonuyla.
Sınırlandırılmayan LAM PCR ve rastgele kesme uygulaması gibi sınırsız genom erişimine sahip testler19 , 20 numaralı ekip, kapsamlı IS analizi için özel söz veriyor. Bu yaklaşımlar, kontrol edilmesi nispeten zor olan, genomik DNA fragmentasyonunun ve IS amplifikasyonunun sonucunu tahmin etmeyi zorlaştıran teknolojileri kullanmaktadır. Öte yandan, iyi karakterize edilmiş restriksiyon enzimlerini kullanan IS tahlillerinin iki önemli faydası vardır: (1) Tahlillerin kalibre edilmesi ve optimizasyonu nispeten kolaydır, çünkü tahlil sonuçları enzim reaksiyonunun spesifitesi ve mevcudiyeti nedeniyle daha öngörülebilirdir Referans genom dizileri. (2) Sekans verileri, analiz koşulları optimize edildikten sonra yüksek seviyede tekrar edilebilir. Optimize edilmiş koşullardaki çift yönlü PCR, büyük ölçekli ve doğru klonal kantifikasyon için faydalı olduğu kanıtlanmıştır 2 , 15 . Kısıtlama enzimi yanlılığı nedeniyle mevcut klonal popülasyonların sadece bir kısmı analiz edilmiş olsa da, bireylerin miktarları 1 klonları doğru bir şekilde ölçülür ve böylece numuneler içinde ve örneklerdeki klon ebadı varyasyonlarının doğru bir şekilde belirlenmesini sağlar. Kök hücre davranış kalıplarını ve fonksiyonel heterojenliği belirlemek için yeterli sayıda klon üretildi.
Bu iki yönlü PCR prosedüründen üretilen PCR amplikonları, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için uygundur. Deneyin yüksek duyarlılığı nedeniyle kirlenmeyi önleyen bir odada deneyler yaparak çapraz bulaşmayı önlemek için azami özen gösterilmelidir. Negatif (şablon içermeyen) bir kontrol deneyinin dahil edilmesi, tüm PCR aşamaları için tavsiye edilir. En dikkatli uygulama olsa dahi, numuneden numuneye çapraz kontaminasyonu önlemek son derece zordur. Bu nedenle, farklı numunelerdeki klonal popülasyonları karşılaştırırken, olası kontamine verileri 23 kaldıran bir çarpışma kontrolü ve düşük frekanslı, güvenilmez klonlar için bir kesim kullanılması önerilir> 2 çapraz bulaşmış DNA'dan gelen gürültüyü en aza indirgemek için. İki yönlü yaklaşım, entegrasyonun her iki uçları için IS verisi üretir ve böylece potansiyel sahte pozitif algılama hatalarını azaltmak için ek bir fırsat sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Finansman, Ulusal Sağlık Teşvik Kuruluşları R00-HL116234, U19 AI117941 ve R56 HL126544 tarafından sağlandı; Ulusal Bilim Vakfı Grant DMS-1516675; Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); Ve KRIBB girişim programı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10 mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2 mL microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100 - 2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50 - 1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
- Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
- Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
- Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
- Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
- Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
- Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
- Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
- Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
- Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
- Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
- Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).
