Summary
यह पांडुलिपि एक द्विदिश एकीकरण साइट परख के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया और सॉफ्टवेयर विश्लेषण का वर्णन करता है जो एक साथ अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम वेक्टर-होस्ट जंक्शन डीएनए का विश्लेषण कर सकता है। द्वैधिक पीसीआर उत्पादों का उपयोग किसी भी डाउनस्ट्रीम अनुक्रमण मंच के लिए किया जा सकता है। परिणामस्वरूप डेटा उच्च-थ्रुपुट, एकीकृत डीएनए लक्ष्यों की मात्रात्मक तुलना के लिए उपयोगी होते हैं।
Abstract
एकीकरण साइट (आईएस) assays रेट्रोवायरल एकीकरण साइटों के अध्ययन और उनके जैविक महत्व का एक महत्वपूर्ण घटक हैं। हाल के रेट्रोवायरल जीन थेरेपी स्टडीज में आईएस एसेल्स, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ संयोजन में क्लोनल स्टेम सेल आबादी को उसी आईएस को साझा करने के लिए सेल-ट्रैकिंग उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है। स्टेम सेल क्लोन के भीतर और विभिन्न नमूनों में repopulating सटीक तुलना के लिए, पता लगाने की संवेदनशीलता, डेटा प्रजनन क्षमता, और परख की उच्च-थ्रुपुट क्षमता सबसे महत्वपूर्ण परख गुणों में से हैं। यह काम द्विदिश आईएस विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह प्रदान करता है। द्विदिश परख एक साथ दोनों अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम वेक्टर-होस्ट जंक्शनों को अनुक्रमित कर सकता है। पारंपरिक यूनिडायरेक्शनल आईएस अनुक्रमण के तरीकों के मुकाबले, द्विदिश दृष्टिकोण में आईएस की पहचान दरों में सुधार और टी के दोनों छोरों पर एकीकरण की घटनाओं की विशेषतावह डीएनए को लक्षित करता है यहां वर्णित डेटा विश्लेषण पाइप लाइन सटीक रूप से पहचान करता है और संदर्भ के कई चरणों के माध्यम से एक समान आईएस श्रृंखला को दर्शाता है जो संदर्भ जीनोम पर आईएस श्रृंखला को मैप करता है और क्रमिक त्रुटियों को निर्धारित करता है। अनुकूलित अनुकूलित प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, हमने हाल ही में हजारों हेमटोपोएटिक स्टेम सेल (एचएससी) क्लोनों को रीसस मकाकों में ट्रांसप्लांट के बाद विस्तृत प्रकाशित किया है, जो पहली बार एचएससी रिपॉप्लेशन का सटीक समय बिंदु और एचएससी की कार्यात्मक विविधता को दर्शाता है। प्राइमेट सिस्टम निम्नलिखित प्रोटोकॉल चरण-दर-चरण प्रयोगात्मक प्रक्रिया और डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो का वर्णन करता है जो समान आईएस सीक्वेंस को सही रूप से पहचानता है और मात्रा देता है।
Introduction
रेट्रोवायरस अपने जीनोमिक डीएनए को विभिन्न साइटों पर मेजबान जीनोम में डालें। यह अनूठी संपत्ति, जो कैंसर और वायरल पैथोजेनेसिस के अन्य रूपों के विकास में योगदान दे सकती है, इन वायरस को जीन थेरेपी और मूल जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए सेलुलर इंजीनियरिंग के लिए अत्यधिक सक्षम बनाने का विडंबनात्मक लाभ है। वायरल इंटीग्रेशन साइट (आईएस) - होस्ट जीनोम का स्थान जहां एक विदेशी डीएनए (वायरस) एकीकृत है - दोनों एकीकृत वायरस और मेजबान कोशिकाओं के भाग्य के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं। रेट्रोवायरल एकीकरण साइट चयन और रोगजनन, कैंसर विकास, स्टेम कोशिका जीव विज्ञान और विकास जीव विज्ञान 1 , 2 , 3 , 4 का अध्ययन करने के लिए विभिन्न जैविक और नैदानिक अनुसंधान सेटिंग्स में IS assays का उपयोग किया गया है। निम्न पहचान संवेदनशीलता, खराब डेटा प्रतिरूपकता, और लगातार पार-संदूषण शामिल हैंवर्तमान और नियोजित पढ़ाई के लिए आईएस एशेज के आवेदनों को सीमित करने वाले मुख्य कारक
कई IS विश्लेषण तकनीकों को विकसित किया गया है। लिंकर-मध्यस्थता (एलएम) पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) 5 , उलटा पीसीआर 6 , और रैखिक-प्रत्यारोपण-मध्यस्थता (एलएएम) पीसीआर 7 सहित प्रतिबंध एंजाइम-आधारित एकीकरण साइट assays, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है। साइट-विशिष्ट प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग, हालांकि आईएस की पुनर्प्राप्ति के दौरान एक पूर्वाग्रह उत्पन्न करता है, प्रतिबंध साइट के आसपास के क्षेत्र में केवल एक एकीकृत संकाय (एक विदेशी डीएनए जो मेजबान जीनोम में एकीकृत होता है) को अनुमति देता है 4 । हाल ही के वर्षों में वेक्टर तकनीक जो अधिक व्यापक रूप से वेक्टर आईएस का आकलन कर रहे हैं का आकलन किया गया है। ये assays विभिन्न रणनीतियों को रोजगार, जिसमें एमयू ट्रांसपोसन-मध्यस्थता पीसीआर 8 , गैर-पट्टात्मक (एनआर) -एलएम पीसीआर 9 , टाइप-II प्रतिबंध एंजाइम-एमEdiated पाचन 10 , यांत्रिक कर्तन 11 , और यादृच्छिक hexamer- आधारित पीसीआर (पुन: मुक्त पीसीआर) 12 , टुकड़ा जीनोमिक डीएनए करने के लिए और बढ़ाना है वर्तमान प्रौद्योगिकियों में पता लगाने की संवेदनशीलता, जीनोम कवरेज, लक्ष्य विशिष्टता, उच्च-थ्रुपुट क्षमता, परख प्रक्रियाओं की जटिलता, और लक्षित स्थलों के रिश्तेदार आवृत्तियों का पता लगाने में पूर्वाग्रहों के स्तर भिन्न होते हैं। मौजूदा assays के विभिन्न गुणों और विभिन्न प्रयोजनों के लिए जिनके लिए वे उपयोग किया जा सकता है, इष्टतम परख दृष्टिकोण को सावधानी से चुना जाना चाहिए
यह काम विस्तृत प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और एक द्विदिशा परख के लिए एक कम्प्यूटेशनल डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो प्रदान करता है जो एक साथ एकीकृत रेट डीएनए की आईएस अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम के विश्लेषण के साथ-साथ पहचान दर और अनुक्रम मात्रा का ठहराव सटीकता में सुधार करता है (आवरण प्रक्रियाओं के लिए योजनाबद्ध दृश्य के लिए चित्रा 1 देखें )। यह दृष्टिकोण भी प्रदान करता हैरेट्रोवायरल एकीकरण प्रक्रिया को चिह्नित करने का मतलब है (उदाहरण के लिए, लक्ष्य साइट दोहराव की निष्ठा और अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्रविष्टि के जीनोमिक अनुक्रमों में भिन्नता)। लक्ष्यीकरण डीएनए 11 , 13 , 14 के दोनों छोरों के क्लोनिंग और अनुक्रमण के लिए मुख्य रूप से अन्य द्विदिश तरीकों का इस्तेमाल किया गया है। अच्छी तरह से स्थापित एलएम-पीसीआर पद्धति और कम्प्यूटेशनल विश्लेषण मैपिंग का उपयोग करते हुए, और अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम जंक्शनों दोनों को बढ़ाए जाने के लिए, इस परख को बड़े पैमाने पर उच्च-थ्रुपुट और वेक्टर-चिह्नित क्लोनों के पुन: उत्पन्न करने योग्य मात्रा के लिए अनुकूलित किया गया है। Taqxii एंजाइम के साथ द्विदिश विश्लेषण स्टेम सेल जीन थेरेपी प्रीक्लिनिनिक अध्ययन 2 , 15 में उच्च-थ्रूपूप क्लोनल मात्रा का ठहराव के लिए उपयोगी साबित हुआ है। यह पत्र एक संशोधित पद्धति का वर्णन करता है जो अधिक बार कटर (आरएआई / सीवीआईयूआई - आकृति: जीटीएसी) का उपयोग करता है जो कि डबल्सवह एक Taqxi- आधारित परख की तुलना में integromes का पता लगाने की संभावना है । लैटिवायरल (एनएल 4.3 और उसके डेरिवेटिव) और गामा-रेट्रोवायरल (पीएमएक्स वैक्टर) वेक्टर आईएस विश्लेषण के लिए जीटीएसी मटेफ एंजाइम का उपयोग करने वाले विस्तृत प्रयोगात्मक और डेटा विश्लेषण प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है। परख में इस्तेमाल किए गए ओलिगोनक्लियोटाइड्स तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं। आईएस अनुक्रम विश्लेषण के लिए इन-हाउस प्रोग्रामिंग स्क्रिप्ट पूरक दस्तावेज में उपलब्ध कराई गई है।
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Protocol
1. अपस्ट्रीम उत्पन्न (बाएं) - और डाउनस्ट्रीम (दाएं) -जंक्शन अनुक्रम पुस्तकालयों
- डीएनए लिंकर तैयारी:
- 100 माइक्रोन LINKER_A oligos (अंतिम: 20 माइक्रोन), 100 माइक्रोन LINKER_B oligos (अंतिम: 20 माइक्रोन) के 2 μL, 5 एम NaCl (अंतिम: 1 एम) के 2 μL, और 2 μL जोड़कर 10 μL लिंकर डीएनए समाधान तैयार करें, और पीसीआर ट्यूब में 4 μL न्यूकेलेज फ्री पानी। लिंकर दृश्यों के लिए तालिका 1 देखें।
- लिंकर डीएनए समाधान को 95 डिग्री सेल्सियस पर एक पीसीआर उपकरण में 5 मिनट के लिए सेते हैं, रन प्रोग्राम को रोकें, और पीसीआर उपकरण बिजली बंद करें। 30 मिनट के लिए उपकरण में लिंकर समाधान को छोड़ें, लिंकर डीएनए को धीरे-धीरे शांत कर दें। लिंकर डीएनए समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है
- एलटीआर-विशिष्ट बायोटिन-प्राइमर एक्सटेंशन:
- विवो में जीनोमिक डीएनए से डीएनए एकाग्रता और 260/280 एनएम मान निर्धारित करने के लिए एक यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करेंया इन विट्रो प्रयोगों में न्युकले-मुक्त पानी का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए समाधान के 170 μL के अंतिम मात्रा में नमूना जीनोमिक डीएनए के 1-2 μg को पतला।
- 10 माइक्रोन एचआईवी-1-विशिष्ट बायोटिन प्राइमरों (एल-बीपी और आर-बीपी: 1 टेबल में : चार लैन्टीवायरस-विशिष्ट प्राइमरों के लिए 10 μL की कुल) में से प्रत्येक में 2.5 μL को मिलाकर 200 μL पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करें, 20 μL 10 एक्स थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ बफर, 4 μL 10 मिमी डीएनटीपी (अंतिम: प्रत्येक डीएनटीपी के 200 माइक्रोन), 3 μL 2.5 यू / μ एल थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ और 163 μL जीनोमिक डीएनए।
नोट: गैमेरेरोवोवरल वैक्टर (पीएमएक्स वैक्टर) के लिए, उपरोक्त चार एचआईवी-1-विशिष्ट बायोटिन प्राइमरों के बजाय दो 10 सुक्ष्ममापी पीएमएक्स-विशिष्ट बायोटिन प्राइमरों (एल-बीपी और आर-बीपी: कुल 10 μL) में से प्रत्येक में 5 μL का उपयोग करें। - चार पीसीआर ट्यूबों (प्रत्येक 50 μL) में समाधान को विभाजित करें और निम्नलिखित परिस्थिति में एक विस्तार चक्र को चलाएं: 5 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 56 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट, 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 5न्यूनतम, और भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
- सभी चार पीसीआर प्रतिक्रियाओं को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में पूल करें और पीसीआर शुद्धि किट की पीसीआर शुद्धि प्रक्रिया का पालन करें। एल्यूशन बफर के 50 μL (किट में प्रदान किए गए 5 गुना पानी-पतला एल्यूशन बफर) के साथ एल्यूट करें। तुरंत चरण 1.3.1 के साथ आगे बढ़ें या -20 डिग्री सेल्सियस पर eluted डीएनए स्टोर
- रुईआई और सीवीएआईआई पाचन
- डीएनए के 50 μL (चरण 1.2.4 से), 10 μL 10x बफर ए और 2 आईएल एंजाइम के 2 μL (20 यू) जोड़कर 100 μL पाचन प्रतिक्रिया तैयार करें। एक पीसीआर उपकरण में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- प्रतिक्रिया के लिए 1 μL (10 यू) का सीवीक्यू एंजाइम जोड़ें और 25 डिग्री सेल्सियस पर एक पीसीआर उपकरण में 30 मिनट के लिए सेते हैं। चरण 1.4.1 के साथ तत्काल आगे बढ़ें
- ब्लंट समाप्त:
- 2.5 μL डीएनए पोलीमरेज़ I बड़े (klenow) टुकड़ा और 2 μL 10 मिमी dNTPs युक्त 4.5-μL मिश्रण तैयार करें। स्थानांतरण 181. चरण 1.3.2 से डीएनए नमूने के मिश्रण का एल। कुल मात्रा 102 μL होगी। पीओआर उपकरण में भंवर से 25 डिग्री सेल्सियस तक और 1 घंटे के लिए सेते हुए अच्छी तरह मिक्स करें। तुरंत चरण 1.6.1 के साथ आगे बढ़ें।
- स्ट्रेप्टिविडिन मोती की तैयारी:
- संक्षेप में स्ट्रेप्टिविन मादा समाधान के भंवर को भंग करें और एक नए 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 50 μL स्थानांतरण करें। चुंबकीय स्टैंड का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला निकालें और 200 μL बाध्यकारी समाधान के साथ मोतियों को धो लें।
- 100 μL बाध्यकारी समाधान में मोतियों को फिर से खोलें और ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड से दूर रखें। तुरंत चरण 1.6.1 के साथ आगे बढ़ें।
- स्ट्रेप्टिविन मादा बाइंडिंग:
- 100 μL फिर से निलंबित मनका समाधान (चरण 1.5.2) करने के लिए नमूना डीएनए (कदम 1.4.1) के 100 μL स्थानांतरण और समाधान के किसी भी foaming से बचने के लिए pipetting द्वारा ध्यान से मिश्रण। घूर्णन व्हील या रोलर पर 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब सेते।
- मोतियों को पकड़ने और सतह पर तैरनेवाला को त्यागने के लिए चुंबकीय स्टैंड का उपयोग करें। मोती को 400 μL धोने के लिए दो बार धो लें और 400 μL में 1x टी 4 डीएनए लेगेज बफर (10 एनसीईईस से न्युकले-फ्री पानी का उपयोग करके हल्का) में दो बार धो लें।
- 200 μL 1x T4 डीएनए ligase बफर (10 एक्स समाधान से nuclease मुक्त पानी का उपयोग से पतला) में मोती resuspend और चुंबकीय स्टैंड से दूर जगह है। चरण 1.7.1 के साथ तुरंत आगे बढ़ें।
- लिंकर लैजिंग:
- डीएनए लिंकर (चरण 1.1.2), 10 एक्स टी 4 डीएनए लेगेज बफर के 10 μL, 5 एक्स टी 4 डीएनए लेगेज बफर के 20 μL (25% पॉलीथीन युक्त) के 0.5 μL मिलाकर एक 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 400 μL बाघ प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया समाधान तैयार करें ग्लाइकॉल), टी 4 डीएनए लैगेज के 5 μL, 164.5 μL नूसलेज़ मुक्त पानी, और 200 माइक्रोन फिर से निलंबित मोती (चरण 1.6.3)। रोटेटिंग व्हील पर प्रतिक्रिया ट्यूब रखें और आरटी (22 डिग्री सेल्सियस) पर 3 घंटे (या 16 डिग्री सीओ / एन) के लिए सेते हैं। मोती धोने के समाधान के साथ दो बार धोएं और 1X थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ बफर के साथ दो बार (चुंबकीय स्टैंड का उपयोग करके 10 ग्राम समाधान से न्युकले से मुक्त पानी का उपयोग किया गया पतला) धोएं।
- 1 एक्स थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ पीसीआर बफर के 50 μL में मोतियों को फिर से बाएं और इसे चुंबकीय स्टैंड से दूर रखें। तुरंत चरण 1.8.1 के साथ आगे बढ़ें या एक दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- दोनों बाएं और दाएं जंक्शन डीएनए का पूर्व-प्रवर्धन:
- 10 माइक्रोन 1 एल-प्राइमर के 10 μL, 10 माइक्रोन 1 आर-प्राइमर के 10 μL, 10 माइक्रोन प्राइमर लिंक 1 (टेबल 1) के 20 μL, 10 एक्स थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ बफर के 10 μL, 4 μ एल जोड़कर 200 μL पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करें। चरण 1.7.3 से 10 मिमी डीएनटीपी (अंतिम: प्रत्येक डीएनटीपी के 200 माइक्रोग्राम), 8 μL (20 यू) थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़, और 88 μL एन्यूकेलेज फ्री पानी को फिर से निलंबित मोती (50 μL) के लिए।
- 4 पीसीआर ट्यूबों में प्रतिक्रिया मिश्रण को विभाजित करें (प्रत्येक 501; एल) और पीसीआर को निम्नलिखित शर्त के साथ ले जाना: 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन; 20 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 25 चक्र, 25 डिग्री के लिए 56 डिग्री सेल्सियस और 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार
- सभी 4 पीसीआर प्रतिक्रियाओं को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में पूल करें और पीसीआर शुद्धि किट की पीसीआर शुद्धि प्रक्रिया का पालन करें। एल्यूशन बफर के 50 μL के साथ एल्यूट करें।
- यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता और 260/280-एनएम मान निर्धारित करें; अगले चरण के लिए तैयार होने तक डीएनए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। चरण 1.9.1 / 1.10.1 (वैकल्पिक) के साथ आगे बढ़ें या सीधे चरणों 1.11.1 / 1.12.1 के साथ।
- बाईं ओर आंतरिक डीएनए एम्प्लिकॉन (वैकल्पिक) को निकालना:
- चरण 1.8.4 से 100 एमजी पीसीआर डीएनए उत्पाद तक 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब तक ट्रांसफर करें और न्युकले-फ्री पानी का उपयोग करके वॉल्यूम को 10 μL में समायोजित करें।
- विशेष रूप से बाईं तरफ के आंतरिक डी को लक्षित करने वाले प्रतिबंध एंजाइम प्रतिक्रिया तैयार करेंएनए एम्प्लिकॉन
नोट: एंजाइम की पसंद के आधार पर प्रतिक्रिया की स्थिति भिन्न हो सकती है। उदाहरण के लिए, जब एनएल 4.3-आधारित लैन्टीवियरल वैक्टर से बाएं ओर के आंतरिक डीएनए को हटाते हैं, तो पीयूयूआई के 1 μL, बफर बी के 2 μL और न्युकले -मुक्त पानी के 7 μL को जोड़ें। एक पीसीआर उपकरण में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। तुरंत चरण 1.11.1 के साथ आगे बढ़ें या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
- दाईं ओर आंतरिक डीएनए एम्प्लिकॉन (वैकल्पिक) को हटाने से:
- चरण 1.9.1 के समान ही आगे बढ़ें।
- विशेष रूप से दाहिनी ओर आंतरिक डीएनए एम्प्लिकॉन को लक्षित करने के लिए प्रतिबंध एंजाइम प्रतिक्रिया तैयार करें।
नोट: उदाहरण के लिए, जब एनएल 4.3-आधारित लैन्टीवियरल वैक्टर से दाईं ओर की आंतरिक डीएनए हटाने, 1 μL एसएफआईआई , बफर बी के 2 μL, और 7 μL न्युकले -फ्री पानी जोड़ें। एक पीसीआर उपकरण में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। चरण 1.12.1 के साथ तुरंत आगे बढ़ें या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
- बाएं-जंक्शन-विशिष्ट प्रवर्धन:
- चरण 1.8.4 (या वैकल्पिक चरण 1.9.2) से 5 μL डीएनए को मिलाकर एक 50 μL पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करें, 5 μL 10 माइक्रोन 2 एल-प्राइमर (अंतिम: 1 माइक्रोन), 5 माइक्रोन 10 माइक्रोन प्राइमर लिंक 2 (अंतिम: 1 सुक्ष्ममापी), 5 μL 10x थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ बफर, 1 माइक्रोन 10 मिमी डीएनटीपी (फाइनल: प्रत्येक डीएनटीपी के 200 माइक्रोन), थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ के 2 μL (5 यू), और न्युकले-मुक्त 27 μL पानी।
- निम्नलिखित शर्त के साथ पीसीआर को बाहर करें: 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन; 20 डिग्री सेल्सियस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 8-15 चक्र, 25 डिग्री के लिए 56 डिग्री सेल्सियस और 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार
नोट: अम्लीफाइड डीएनए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है * साइकिल संख्या अनुकूलन का सुझाव दिया है। - पीसीआर शुद्धिकरण किट की पीसीआर शुद्धि प्रक्रिया का पालन करें। एल्यूशन बफर के 50 μL के साथ एल्यूट करें। डीएनए एकाग्रता और 260/280 एनएम मूल्यों को निर्धारित करें।
- सभी प्रक्रियाएं "वाम-जंक्शन-विशिष्ट प्रवर्धन" (चरण 1.11.1-1.11.3) के समान हैं, अलग प्राइमरों के उपयोग के अलावा; इस चरण में सही-जंक्शन-विशिष्ट प्राइमर (2 आर-प्राइमर, तालिका 1 देखें) का उपयोग करें।
- 2% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन या केशिका वैद्युतकणसंच ( चित्रा 2 ) प्रदर्शन करके पीसीआर एम्प्लिकॉन लंबाई विविधताओं का विश्लेषण करें।
नोट: इस परख प्रक्रियाओं को पूरा करने की पुष्टि करने और पीसीआर बैंड पैटर्नों के आधार पर आईएस पैटर्न का मोटा मूल्यांकन करने के लिए यह एक आवश्यक कदम है। चरण 1.11.3 और 1.12.3 से शुद्ध PCR amplicon का उपयोग विभिन्न डीएनए अनुक्रमण प्लैटफॉर्म के लिए किया जा सकता है। शास्त्रीय श्रृंखला समाप्ति (सेंगर) अनुक्रमण या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए उचित नमूना तैयार करने की प्रक्रियाओं के साथ आगे बढ़ें। डीएनए -20 डिग्री पर संग्रहीत किया जा सकता है;सी।
2. कम्प्यूटेशनल IS अनुक्रम विश्लेषण है
- डेटा फ़ाइलों की तैयारी:
- तीन इनपुट डेटा फ़ाइलों को तैयार करें: एक फाटा प्रारूप अनुक्रम डेटा फ़ाइल (पूरक डेटा में Test_data.fa), वेक्टर और लिंकर अनुक्रमों के लिए खोज रूपांकनों (पूरक डेटा में Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv) के लिए एक टीएसवी फ़ाइल और प्रतिबंध एंजाइम जानकारी के लिए एक टीएसवी फ़ाइल (पूरक डेटा में एनज़ीएम.टीएसएस)।
नोट: इन फ़ाइलों को डिमल्टीप्लेक्सिंग, वेक्टर और लिंकर अनुक्रमों को ट्रिम करने, और आंतरिक वेक्टर अनुक्रमों ( चित्रा 3 ए ) को हटाने के लिए आवश्यक है। कम्प्यूटेशनल वर्कफ़्लो को कार्यान्वित करने के लिए विस्तृत चरण-दर-चरण निर्देशों को पूरक डेटा में README.txt फ़ाइल में प्रदान किया गया है।
- तीन इनपुट डेटा फ़ाइलों को तैयार करें: एक फाटा प्रारूप अनुक्रम डेटा फ़ाइल (पूरक डेटा में Test_data.fa), वेक्टर और लिंकर अनुक्रमों के लिए खोज रूपांकनों (पूरक डेटा में Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv) के लिए एक टीएसवी फ़ाइल और प्रतिबंध एंजाइम जानकारी के लिए एक टीएसवी फ़ाइल (पूरक डेटा में एनज़ीएम.टीएसएस)।
- कम्प्यूटेशनल विश्लेषण:
- डेमल्टी एलेक्लेक्स और रनिंग स्क्रिप्ट चलाएं।
नोट: कच्चे अनुक्रम पर डिमल्टीप्लेक्सिंग और ट्रिमिन के लिए प्रोसेस किया जाएगावेक्टर, लिंकर, और प्राइमर अनुक्रमों के जी (देखें पूरक -17 फ़ाइल में पूरक -1)। - मानचित्रण कमांड को चलाएं (देखें REEME-TEX फाइल में STEP-2) संसाधित अनुक्रमों को संदर्भ जीनोम पर एक विस्फोट जैसी संरेखण उपकरण (BLAT; www.genome.ucsc.edu) का उपयोग करने के लिए मैप करने के लिए।
- मात्रात्मक IS विश्लेषण स्क्रिप्ट चलाएं (README.txt फ़ाइल में STEP-3 देखें)।
नोट: दो आउटपुट फाइलें (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt और Final_count.txt) उत्पन्न हो जाएंगी। मानचित्रण और अनुक्रम गणन रणनीतियों पर अधिक विवरण "पूरक डेटा में README.txt फ़ाइल और पिछले प्रकाशनों 2 , 15 में पाया जा सकता है।
- डेमल्टी एलेक्लेक्स और रनिंग स्क्रिप्ट चलाएं।
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Representative Results
द्विदिश आईएस परख ने अपस्ट्रीम (बाएं) और डाउनस्ट्रीम (दाएं) सदिश मेजबान जंक्शनों ( चित्रा 2 ) दोनों के लिए पीसीआर एम्प्लिकंस के विभिन्न आकारों को जन्म दिया। एक पीसीआर एम्प्लिकॉन का आकार एक निकटतम जीटीएसी मूल भाव के स्थान पर निर्भर करता है और एक ईदोइम से डाउनस्ट्रीम है। परख ने आंतरिक डीएनए पीसीआर एम्प्लिक्ंस भी तैयार किया: पॉलीपुरीन पथ के पास रेट्रोवायरल अनुक्रम और प्राइमर बाध्यकारी साइट क्रमशः बाएं और दाएं जंक्शन पीसीआर के दौरान क्रमशः बढ़ा दी गई थी। पीसीआर एम्प्लिकॉन बैंड को केशिका या एगरोज़ (2%) वैद्युतकणसंचलन द्वारा देखा जा सकता है।
अनुक्रमण के बाद, बाएं और दाएं जंक्शन के दोनों दृश्यों का विश्लेषण एक इन-हाउस प्रोग्रामिंग स्क्रिप्ट के लिए कच्चे अनुक्रमों को प्रीप्रोसिंग करने के लिए किया गया था (जिसमें डिमलेट एलेक्लेक्सिंग और वेक्टर और लिंकर डीएनए शामिल हैं), जीनॉम पर आई सी अनुक्रमों को पहचानना, समान आईएसआई की पहचान करना और उनकी गणना करनाअनुक्रम, और त्रुटि सुधार प्रक्रियाओं को लागू करने ( चित्रा 3 )। संदर्भ जीनोम में क्वेरी अनुक्रमों के 5'-अंत के स्थान आईएस माना जाता है और प्रत्येक आईएस की आरंभिक गणना के लिए उपयोग किया जाता है। दो मिलान अनुक्रमों का निर्धारण मापदंड - अपस्ट्रीम (बाएं) और डाउनस्ट्रीम (दाएं) जंक्शन अनुक्रम उसी एकमान से उत्पन्न होता है- रेट्रोवायरस-विशिष्ट ठोस एकीकरण के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम पैटर्न पर आधारित हैं और निम्नानुसार हैं: (i) दो जंक्शन अनुक्रम वही विपरीत ओरिएंटेशन में जीनोम पर संरेखित करें (Ii) दो जंक्शन अनुक्रमों का आईएसएच मानव इम्यूनोडिफीसिन्सी वायरस (एचआईवी) वैक्टर के लिए 5 बीपी ओवरलैप और मुरीइन लेकिमिया वायरस (एमएलवी) वैक्टर के लिए 4 बीपी ओवरलैप द्वारा अलग किया गया है। एचआईवी के दो जंक्शनों और एमएलवी जंक्शनों के 4 बीपी के पहले 5 बीपी रिवर्स-पूरक हैं।
अनुक्रम की गणना तीन चरणों में की जाती है: (1) जेनोम पर आईआईएस अनुक्रम मैप करनाBLAT का उपयोग करते हुए, जो मैपिंग गुणवत्ता को उत्पन्न करता है और "एकल-हिट," "बहु-हिट," "नो-हिट" और "अन्य" समूहों में व्यक्तिगत आईएस अनुक्रमों को अलग करता है; (2) बेसिक स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट) का प्रयोग करके एकल-हिट अनुक्रमों को अन्य उप-मूल रूप से मैप किए गए दृश्यों के साथ तुलना करना, जिसमें मल्टी-हिट, नो-हिट और अन्य शामिल हैं; और (3) सीक्वेंसिंग त्रुटियों को पहचानना और सुधारना, जिसमें होमॉलीकिमर त्रुटियां शामिल हैं बहु-हिट अनुक्रम आईएस अनुक्रम हैं जो उच्च मैपिंग स्कोर वाले दो या दो से अधिक जीनोमिक पदों को संरेखित कर सकते हैं। क्लोनल आबादी की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए अभी भी उपयोगी है, मल्टी-हिट अनुक्रम जीनोमिक एकीकरण साइट वितरण पैटर्न (उदाहरण के लिए, जीन, पुनरावृत्ति या अन्य जीनोमिक वर्णों के साथ संबंध) को वर्णित करने के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है। कुछ दुर्लभ मामलों में, दो जंक्शन अनुक्रम विभिन्न मानचित्रण गुण दिखाते हैं। उदाहरण के लिए, एक "एकल-हिट" दिखाता है, जबकि मिलान अनुक्रम "बहु-हिट" दिखाता है। ऐसे मामलों में, दोनोंदृश्यों को "एकल-हिट" दृश्यों के रूप में माना जाता है
उप-मैपिंग स्कोर वाले आईएस अनुक्रमों का एक हिस्सा, जो असामान्य प्रश्न आकार (क्यूएसएसजेईई) या इसके विपरीत के साथ उच्च प्रतिशत जीनोम मिलान (पहचान) को दिखाता है, "नॉट-हिट" से अलग हो गया और एक अतिरिक्त और प्रायः के लिए "दूसरों" में वर्गीकृत किया गया मैनुअल पुनः मूल्यांकन उदाहरण के लिए, जीनोम मैपिंग के लिए BLAT का प्रयोग करते समय, कुछ आईएस श्रृंखलाएं पहली या आखिरी 5-10 न्युक्लिओटाइड में मिस मिलान वाले न्यूक्लियोटाइड के कारण एक असामान्य क्यूएसईएसईज़ दिखा सकती हैं। अपेक्षाकृत उच्च-गुणवत्ता वाले मैपिंग परिणाम होने के बावजूद ये दृश्य अक्सर "एकल-हिट" या "बहु-हिट" स्थिति के मानचित्रण मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं।
एक नमूना कच्चे अनुक्रम डेटा फ़ाइल (Test_DATA.fa: 33,374 अनुक्रम) और नमूना आउटपुट डेटा फ़ाइलें पूरक डेटा के रूप में प्रदान की जाती हैं। मानव repopulating कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए की 1 ग्राम, व्रत के साथ transduced मानवीय अस्थि मज्जा / यकृत / थाइमस (बीएलटी) 17 में आईवीरल वैक्टर (एफजी 12) का द्विदिश परख का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। रेट्रोवायरल आईएस पूरे जीनोम में पाया गया था आमतौर पर, जीन में लैन्टेवियरल वैक्टर को अधिक व्यक्त किया जाता है, जबकि गामा-रेट्रोवायरल वैक्टर ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट्स 16 ( चित्रा 4 ) में अधिक से अधिक प्रतिनिधित्व करते हैं। दो मानव पुनर्निर्मित सेल के नमूनों से, कुल 1,081 अनुक्रम-अपस्ट्रीम (बाएं) से 851 और डाउनस्ट्रीम (दाएं) जंक्शनों के 230-ई सी सीक्वेंस के रूप में योग्य थे। इन दृश्यों से, बाएं में 93 अद्वितीय आईएस और सही जंक्शनों में 50 अद्वितीय आईएस की पहचान की गई है। इनमें से, दोनों (बाएं और दाएं) जंक्शनों में 44 की पहचान की गई थी, जिसमें टेस्ट नमूने में कुल 99 अनूठे विशिष्टताएं दिखायी गयी थीं। यादृच्छिक घटनाओं ( चित्रा 4 ए ) की तुलना में जीन में काफी समृद्ध है (66%, पी <0.0001)।
"> नमूना गामा-रेट्रोवायरस वेक्टर (पीएमएक्स) एकीकरण साइट दृश्यों को भी परीक्षण डेटा फ़ाइल में शामिल किया गया है। मिश्रित पीएमएक्स-इंजीनियर वाला नमूना नमूने से, अक्टूबर 4, सीएमवायसी, क्लफ्फ़ 4, और एसओएक्स 2, सीएमआईसी 660 आईएस दृश्यों और 12 9 अद्वितीय आईएस की पहचान की गई। क्रमशः बाएं और दाएं जंक्शनों में 65 और 76 अद्वितीय आईएस की पहचान की गई, 12 दोनों जंक्शनों में थे।यह पहले से दिखाया गया है कि पीआरयूआरएक्सेनिंग प्लेटफार्म में पीसीआर एम्प्लिकंस का खराब क्रम है, जबकि <500 बीपी के पीसीआर एम्प्लिकिक्स आमतौर पर क्रमशः 15 के अनुक्रम के बिना एक उल्लेखनीय पूर्वाग्रह के बिना अच्छी तरह से क्रमबद्ध होते हैं। इस प्रकार, ≥ 500 बीपी पीसीआर एम्प्लिकॉन के अनुक्रम डेटा को लंबाई से जुड़े अनुक्रमण पक्षपात को हटाने के लिए बाहर रखा गया था। मात्रात्मक क्लोनल विश्लेषण के लिए केवल <500 बीपी पीसीआर एम्प्लिकॉन (जिसे क्वांटिफेएबल वेक्टर ईटीएमआई या क्यूवीआई कहा जाता है) का डेटा इस्तेमाल किया गया था। सदिश पूर्णांक के सापेक्ष खोज आवृत्तियोंआईएस जंक्शनों के केवल क्रम संख्याओं का उपयोग करके <500 बीपी पीसीआर एम्प्लिकेशन्स ( चित्रा 4 बी -4 डी ; तालिका 2 भी देखें) पैदा कर रहे थे। इस रणनीति ( चित्रा 4 बी ) द्वारा लगभग 77% वैक्टर का मात्रात्मक विश्लेषण किया जा सकता है। नतीजतन, प्रत्येक क्यूवीआई के लिए गणना की गई आवृत्तियों को नमूने ( चित्रा 4 ई ) में 1.25x द्वारा वास्तविक आवृत्तियों का अनुमान लगाने का अनुमान था।
चित्रा 1: द्विदिश एकीकरण साइट विश्लेषण का एक योजनाबद्ध दृष्टिकोण। सेलुलर डीएनए (नीला) द्वारा flanked डबल-फंसे रेट्रोवायरल डीएनए (काला और लाल) दिखाए जाते हैं। तीर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमरों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और एस्ट्रिक के साथ तीर बायोटिन प्राइमरों का प्रतिनिधित्व करते हैं। लिंकर डीएनए बैंगनी लाइनों द्वारा चिह्नित हैं संक्षेप में, बाएं का एक रैखिक विस्तारवायरल लम्बा टर्मिनल दोहराव (एलटीआर) से बायोटिन प्राइमर्स (एल-बीपी) और दाएं बायोटिन प्राइमर्स (आर-बीपी) बायोटिनिलाटेड, डबल स्ट्रैंड आईएसएनए बनाता है। सीवीक्यूआई और आरएआई के साथ पाचन के बाद, बायोटिनिलेटेड डबल-फंसेड डीएनए स्ट्रेक्टिविन-बायोटिन-विशिष्ट बाइंडिंग का उपयोग करके समृद्ध होते हैं और लिंकर डीएनए से जुड़े होते हैं। स्ट्रेप्टविदिन-कब्जा, लिंकर-लिगीटेड वेक्टर-होस्ट जंक्शन डीएनए दो-चरण के पीसीआर द्वारा विस्तारित किया जाता है: प्री-एम्प्लीफिकेशन (दोनों बाएं और दाएं जंक्शनों का प्रवर्धन) दो नेस्टेड पीसीआर के बाद, प्रत्येक लक्ष्यीकरण बायां और दाएं जंक्शनों। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: प्रतिनिधि पीसीआर एम्प्लिकॉन छवि ( ए ) केशिलरी वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण पीसीआर amp की अलग-अलग लंबाई से पता चलता हैलाइसोवायरल वेक्टर (एफजी 12) इंटीग्रेशन साइट्स में पीवीयूआई या एसएफओआई पाचन के बाद लाइसेंस अपस्ट्रीम (बाएं) और डाउनस्ट्रीम (दाएं) वेक्टर मेजबान जंक्शनों के लिए पीसीआर बैंड बदलते दिखाए जाते हैं। अंधेरे तीर सिर pvuII या sfoI पाचन के बाद शेष आंतरिक वेक्टर डीएनए एम्प्लिकॉन दर्शाते हैं। डीएनए आकार मार्कर (0.1 - 2.5 केबीपी) एम लेन पर है। खुला तीर सिर संरेखण मार्कर (15 और 5,000 बीपी) से संकेत मिलता है। डीएनए संरेखण मार्करों को सभी चैनलों में प्रवास समय भिन्नता के अंशांकन के लिए उपयोग किया जाता है। ( बी ) गामा-रेट्रोवायरल (पीएमएक्स) वेक्टर इंटीग्रेशन साइट्स जिसमें मूरीन सेल क्लोन्स में कई पीएमएक्स वैक्टर होते हैं। वाम- और दाएं जंक्शन डीएनए, साथ ही साथ आंतरिक वेक्टर डीएनए एम्प्लिकॉन (एरो हेड), दिखाए जाते हैं। अंधेरे और खुले तीर का क्रम क्रमशः आंतरिक वेक्टर डीएनए और संरेखण मार्करों से मिलता है। डीएनए आकार मार्कर (50-1,500 बीपी) एम लेन पर है केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस पर विवरण कंपनी में पाया जा सकता हैमसविदा बनाना। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3: एकता साइट अनुक्रम विश्लेषण ( ए ) कम्प्यूटेशनल डेटा विश्लेषण के लिए एक प्रवाह संचित्र फास्टा फॉर्मेट अनुक्रम फ़ाइल, डेमल्टिप्लेक्सिंग और ट्रिमिंग के लिए संदर्भ अनुक्रम रूपांकनों वाली एक फ़ाइल और प्रतिबंध एंजाइम जानकारी वाली एक फाइल सहित तीन डेटा फ़ाइलों की आवश्यकता है। Test_DATA.fa (अनुक्रम डेटा), डेमल्टीप्लेक्सिंगटैरमिंग.टी.एस.व्यू (खोज अनुक्रम रूपांकनों) और एनज़ाइम.टीटीएस (प्रतिबंध एंजाइम मान्यता अनुक्रम) सहित नमूना फ़ाइलें, पूरक डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान की जाती हैं। भाग 1 से प्रक्रमित अनुक्रम (मेजबान-जीनोम अनुक्रम) BLAT का उपयोग करते हुए संदर्भ के खिलाफ मैप किए जाएंगे। क्वेरी sequenc के 5'-अंत में स्थानसंदर्भ जीनोम में es को एकीकरण साइटों ( तालिका 2 ) माना जाता है। प्रत्येक IS के लिए अनुक्रम की गणना तीन चरणों में निर्धारित की जाती है: (1) बीएलएटी का उपयोग करते हुए जीनोम पर आईआईएस अनुक्रम मैप करना; (2) सिंगल-हिट आईएस अनुक्रमों की तुलना (मेजबान जीनोम की एक अनूठी साइट पर संरेखित) अन्य दृश्यों के साथ जो जीनोम पर पूरी तरह से मैप किए गए थे; और (3) अनुक्रमण त्रुटि को पहचानने और सुधारना। मैपिंग और अनुक्रम गणन रणनीतियों पर अधिक विवरण पिछले अध्ययनों में पाया जा सकता है 2 , 15 । ( बीसी ) डाउनस्ट्रीम (बी) और अपस्ट्रीम (सी) वेक्टर-होस्ट जंक्शनों के लिए दो नमूना एकल-फंसे डीएनए दृश्यों को दिखाया गया है। पीरोसेक्विंगिंग प्राइमरों ए और बी (हरा) का उपयोग छोटी बूंद पीसीआर और अनुक्रमण के लिए किया जाता है। रंग कोड उन चित्रों 1 के साथ सहमत हैं। नमूना डाउनस्ट्रीम जंक्शन अनुक्रम (बी) में प्राइमर ए (हरा), मध्य (हरा), वेक्टर यू 5 अंत (लाल), मेजबान जीनोम (नीला), ली शामिल हैंएनकेआर (बैंगनी), और प्राइमर बी (हरा) मिश्रित (अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम) डीएनए अनुक्रमण में, प्राइमर ए का उपयोग डाउनस्ट्रीम जंक्शन (बी) के अनुक्रमण के लिए किया जाता है, और प्राइमर बी अपस्ट्रीम जंक्शनों के अनुक्रमण के लिए उपयोग किया जाता है नमूना अपस्ट्रीम जंक्शन अनुक्रम (सी) में प्राइमर बी, एमआईडी, वेक्टर यू 3 अंत, होस्ट जीनोम, लिंकर, और प्राइमर ए शामिल हैं । इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: द्विदिश एकीकरण साइट विश्लेषण का प्रतिनिधि उदाहरण। ( ए ) जीन (refseq), अलू, और लाइन 1 (एल 1) में प्रतिशत एकीकरण मानवीय माउस रिपॉपुलेटिंग कोशिकाओं (एलवी-एचयूएमआईसीई) में लैंटिवायरल वैक्टर के दोहराता है, जिसमें सिल्लिको द्वारा निर्मित 10,000 यादृच्छिक एकीकरण की घटनाएं हैं। एकता साइटों को मैप किया जाता हैमानव जीनोम (एचजी 1 9) पर एलवी-एचयूइस एकीकरण साइटों पर जीन ( पी <0.0001, ची-स्क्वायर सन्निकटन) में काफी अधिक प्रतिनिधित्व किया गया है ( बी ) 10,000 रैंडम इंटीग्रेशन इवेंट्स के सिलिको विश्लेषण में। एक यूनिडायरेक्शनल दृष्टिकोण के साथ, लगभग 52% यादृच्छिक अभिकर्मक <500 बीपी के पीसीआर एम्प्लिकॉन उत्पन्न करते हैं, जबकि द्विदिश दृष्टिकोण के साथ, 77% ने बाएं या दाएं जंक्शनों में <500 बीपी का पीसीआर एम्प्लिकॉन उत्पन्न किया। 500 बीपी से अधिक पीसीआर एम्प्लिकिक्स अक्षमता से pyrosequencing platfor 2 , 15 के साथ अनुक्रमित हैं और इस प्रकार मात्रात्मक डेटा विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए ( सी ) क्लोन मात्रा का ठहराव के लिए रणनीति प्रत्येक व्यक्ति क्लोन एक ही सदिश पूर्णांक (या आईएस) को साझा करता है बाएं (एक्स) और दाएं (y) जंक्शनों की रिश्तेदार आवृत्तियों को क्लोनल आबादी (मात्रात्मक वेक्टर ईन्स्टोमॉम्स, या क्यूवीआई) के सापेक्ष मात्रा का प्रतिनिधित्व करने के लिए जोड़ा जाता है। integ राशन साइट्स जिनके पास 450 बीपी के भीतर जीटीएसी प्रपत्र नहीं है, उन्हें अयोग्य (डीक्यू) और मात्रा का विश्लेषण विश्लेषण से निकाला जाता है। ( डी ) मानवकृत चूहों repopulating कोशिकाओं में 44 QVI क्लोनों की रिश्तेदार आवृत्तियों (सभी QVI दृश्यों के सापेक्ष) एक रंग योजना (सफेद से लाल: 0 से 0.16) में दिखाए जाते हैं। ( ई ) द्विदिश विश्लेषण के साथ क्लोन आवृत्तियों की अनुमानित अधिक अनुमान 10,000 रैंडम एकीकरण विश्लेषण के आधार पर, लगभग 20% डीक्यू क्लोन की वजह से जीटीएसी मटेफ एंजाइम ( रुपये और आईवीआईसीआई ) का उपयोग करते समय 1.25 गुना अधिक अनुमान की उम्मीद होती है। टीसीजीए आकृति एन्जाइम ( ताक़ीई ) का इस्तेमाल करते समय लगभग 60% डीक्यू क्लोन की वजह से 2.56x अधिक अनुमान की उम्मीद है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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सारणी 1: लेंटिवायरल और गामा-रेट्रोवायरल वेक्टर इंटीग्रेशन साइट विश्लेषण के लिए ओलिगोनक्लियोटाइड्स। * 5 बीओईटीईजी: 5 'अंत में बायोटिन संशोधन कृपया इस तालिका के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 2: प्रतिनिधि प्रविष्टि साइट अनुक्रम गिनती डेटा कृपया इस तालिका के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
1 नक्शा: एकीकरण साइट अनुक्रम को एक विशिष्ट स्थान (सिंगल-हिट) या संदर्भ वाले जीनोम के एकाधिक लोकी (बहु-हिट) पर मैप किया जा सकता है। एनए (उपलब्ध नहीं): कोई क्रम नहीं मिला।
2 एसटीआरडी: जीनोम में क्वेरी क्रम की ओर उन्मुखीकरण
3 क्यूएलएन: क्वेरी अनुक्रम की लंबाई
4 GLEN: एकीकरण साइट अनुक्रम की अपेक्षित लम्बाई, जीनोम में सबसे निकटतम उपलब्ध जीटीएसी आकृति से सम्मिलन साइट पर आधारित गणना की गई। GLEN <450 बीपी मात्रात्मक विश्लेषण के लिए स्वीकार किए जाते हैं
5 कुलकाउंट: कुल क्रम संख्या
6 एकीकरण साइटों को एक गुणसूत्र संख्या (सीएचआर) और सही जंक्शन (सीआरआरसीआईटी 1) के लिए एक साइट संख्या और बाएं जंक्शन (सीएचआरसीआईटी 2) के लिए एक नंबर द्वारा दिखाया गया है। सीआरआरसीआईटी 1 और सीआरआरआईटीईटी 2 एमएलवी (पीएमएक्स) वैक्टर के लिए लैन्टीवायरल वैक्टर के लिए 5 बीपी और 4 बीपी हैं
7 सही जंक्शन (आर_ए) के लिए अनुक्रम की गणना और नमूना ए (एल_ए) के बाएं जंक्शन; सही जंक्शन (आरबीआई) के लिए अनुक्रम की गणना और नमूना बी (एलबी) के बाएं जंक्शन
* अयोग्य (डीक्यू): सिलीको बीपी में GLEN ≥450
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Discussion
द्विदिश परख दोनों अपस्ट्रीम (बाएं) और डाउनस्ट्रीम (दाएं) वेक्टर-होस्ट डीएनए जंक्शन अनुक्रमों के एक साथ विश्लेषण को सक्षम बनाता है और कई जीन थेरेपी, स्टेम सेल और कैंसर अनुसंधान अनुप्रयोगों में उपयोगी है। जीटीएसी-आकृति एन्जाइम्स (आरएआई और सीवीआईयूआई) और द्विदिश पीसीआर दृष्टिकोण का उपयोग, पिछले टीसीजीए-एफ़ेफ़ एंजाइम ( टैक़ीइ ) के आधार पर एंबेडेड (या एक क्लोनल आबादी) का पता लगाने की संभावनाओं में सुधार करता है-आधारित एशेज 2 , 15 और अन्य यूनिडायरेक्शनल एलएम-पीसीआर 5 द्विदिश परख आईएस के विश्लेषण में सुधार, विशेष रूप से सीमित डीएनए नमूनों में जो अक्सर नैदानिक या छोटे-जानवर-मॉडल अध्ययनों में उत्पन्न होती हैं।
चरण 1.1-1.7 महत्वपूर्ण चरण हैं और अनावश्यक विलंब के बिना किया जाना चाहिए। ये कदम आम तौर पर एक दिन में किए जाते हैं। इन चरणों से पहले एंजाइम का परीक्षण करना अत्यधिक अनुशंसित है। चरणएस 1.9 और 1.10 वैकल्पिक हैं। इन चरणों में आंतरिक वेक्टर डीएनए दृश्यों को कम किया जाएगा जो अनुक्रमित रूप से आईएस श्रृंखलाओं के साथ बढ़ते हैं। तालिका 1 आईएसएस के जंगली प्रकार एनएल 4.3 एचआईवी-1, एनएल 4.3-व्युत्पन्न वैक्टर का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त प्राइमर सेट प्रदान करता है, जिसमें एफजी 21 और पीएमएक्स-आधारित गैमेंवरोवायरल वैक्टर 22 शामिल हैं । लंबे टर्मिनल दोहराने (एलटीआर) अनुक्रमों में न्यूक्लियोटाइड विविधताओं के आधार पर प्राइमर डिजाइन और प्रायोगिक दृष्टिकोण को उचित संशोधन की आवश्यकता हो सकती है।
मैपिंग के लिए उपयोग किए गए ब्लेट सॉफ्टवेयर केवल फाटा प्रारूप के साथ संगत है और फास्टक फाइलों के साथ काम नहीं करता है। फ़ास्टेक्स टू टूलकिट या बीबी टूल्स जैसी विभिन्न सॉफ़्टवेयर टूल्स का उपयोग करके फास्टए में फास्टा को परिवर्तित कर सकते हैं। अजगर के बुनियादी ज्ञान के साथ एक उपयोगकर्ता, फाइटा को ब्लैक के साथ मानचित्रण करने के लिए फास्टा फाईल्स को बदलने के लिए बायॉप्थन का इस्तेमाल कर सकता है।
उम्मीद की जाती है कि आईएस का एक हिस्सा द्विदिश I के साथ नहीं पाया जाएगाएस परख और, यहां तक कि अगर पता चला, डाउनस्ट्रीम क्लोनल मात्रा का ठहराव के लिए योग्य नहीं होगा। जब GTAC-motif एंजाइमों का उपयोग किया गया था, तो pyrosequencing प्लेटफ़ॉर्म द्वारा उत्पन्न अनुक्रम डेटा में लगभग 23% integromes मात्रात्मक आईएस अनुक्रम विश्लेषण ( चित्रा 4 ) के लिए विश्लेषण मापदंड पास नहीं किया। जब व्यापक आईएस कवरेज महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए जीन थेरेपी सेटिंग्स में जीन-इंजीनियर कोशिकाओं की सुरक्षा की निगरानी में, आईएस 8 , 9 , 10 , 11 , 12 या फिर से विश्लेषण करने के लिए अप्रतिबंधित जीनोम पहुंच के साथ एक परख चुनने की सलाह दी जाती है 4 , 18 के प्रतिबंधों के एक अलग या अनुकूलित संयोजन के साथ एक ही नमूना
गैर-प्रतिबंधित जीनोम पहुंच के साथ आई एस assays, जैसे कि गैर-प्रतिबंधात्मक एलएएम पीसीआर और यादृच्छिक कतरन अनुमोदन1 9 , 20 के ओचों, व्यापक आईएस विश्लेषण के लिए विशिष्ट वादे रखें। ये दृष्टिकोण उन प्रौद्योगिकियों का उपयोग करते हैं जो नियंत्रित करने के लिए अपेक्षाकृत कठिन हैं, जिससे जीनोमिक डीएनए विखंडन और आईएम प्रवर्धन के नतीजे का अनुमान लगाने में मुश्किल हो रही है। दूसरी ओर, अच्छी तरह से चिह्नित प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करने वाले आईएस एशेज में दो प्रमुख लाभ हैं: (1) एंजाइम की प्रतिक्रिया की विशिष्टता और एंजाइम की प्रतिक्रिया की वजह से परख परिणामों को अधिक अनुमान लगाया जाता है क्योंकि यह जांचना और अनुकूलन करना आसान है। संदर्भ जीनोम अनुक्रम (2) अनुक्रम स्थितियों का अनुकूलन हो जाने के बाद सीक्वेंस डेटा अत्यधिक प्रतिलिपि बनाने योग्य हैं। अनुकूलित शर्तों के साथ द्विदिश पीसीआर बड़े पैमाने पर और सटीक क्लोनल मात्रा का ठहराव 2 , 15 के लिए उपयोगी साबित हुआ है। हालांकि मौजूदा क्लोनल आबादी का केवल एक हिस्सा प्रतिबंध एंजाइम पूर्वाग्रह के कारण विश्लेषण किया गया है, व्यक्तिगत मात्रा एल क्लोनों को सही ढंग से मापा गया, जिससे नमूने के भीतर और पूरे क्लोन आकार भिन्नता के सटीक निर्धारण को सक्षम किया जा सके। स्टेम कोशिका व्यवहार पैटर्न और कार्यात्मक विविधता को निर्धारित करने के लिए एक पर्याप्त संख्या में क्लोन तैयार किए गए थे।
इस द्विदिश पीसीआर प्रक्रिया से बने पीसीआर एम्प्लिकिक्स किसी भी डाउनस्ट्रीम अनुक्रमण मंच के लिए उपयुक्त हैं। परख की उच्च संवेदनशीलता के कारण, प्रदूषण रहित कमरे में प्रयोग करके क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए अत्यधिक सावधानी बरती जानी चाहिए। सभी पीसीआर चरणों के लिए एक नकारात्मक (ना-टेम्प्लेट) नियंत्रण प्रयोग को शामिल किया जाता है। यहां तक कि सबसे सावधानीपूर्वक अभ्यास के साथ, नमूना-टू-नमूना क्रॉस-संदूषण को रोकने में बहुत मुश्किल है। इस प्रकार, विभिन्न नमूनों से क्लोनल आबादी की तुलना करते समय, यह एक टकराव नियंत्रण को नियंत्रित करने की सलाह दी जाती है, जो संभावित दूषित डेटा को निकाल देता है 23 , और कम आवृत्ति, अविश्वसनीय क्लोनों के लिए एक कटऑफ> क्रॉस-दूषित डीएनए से शोर को कम करने के लिए 2 द्विदिश दृष्टिकोण, एकीकृत संवर्ग के दोनों छोरों के लिए आईएस डेटा बनाता है, जिससे संभावित गलत-सकारात्मक पहचान त्रुटियों को कम करने का एक अतिरिक्त मौका प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
अनुदान राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान R00-HL116234, U19 AI117941, और R56 एचएल 126544 द्वारा प्रदान किया गया था; राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रांट डीएमएस -1516675; नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ़ कोरिया (एनआरएफ-2011-0030049, एनआरएफ-2014 एम 3 सी 9 ए 3064552); और केआरआईबी पहल कार्यक्रम।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10 mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2 mL microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100 - 2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50 - 1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
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