Summary
Dieses Manuskript beschreibt die experimentelle Prozedur und Softwareanalyse für einen bidirektionalen Integrationsort-Assay, der gleichzeitig stromaufwärts und nachgeschaltete Vektor-Host-Junction-DNA analysieren kann. Bidirektionale PCR-Produkte können für jede nachgeschaltete Sequenzplattform eingesetzt werden. Die resultierenden Daten sind nützlich für einen hochdurchsatzreichen, quantitativen Vergleich von integrierten DNA-Targets.
Abstract
Integration Site (IS) Assays sind ein kritischer Bestandteil der Studie der retroviralen Integrationsstellen und ihrer biologischen Bedeutung. In den letzten retroviralen Gentherapie-Studien wurden IS-Assays in Kombination mit der Sequenzierung der nächsten Generation als Zell-Tracking-Tool verwendet, um klonale Stammzellpopulationen zu charakterisieren, die das gleiche IS teilen. Für den genauen Vergleich von repopulierenden Stammzellklonen innerhalb und über verschiedene Proben gehören die Nachweisempfindlichkeit, die Datenreproduzierbarkeit und die Hochdurchsatzkapazität des Assays zu den wichtigsten Assayqualitäten. Diese Arbeit bietet einen detaillierten Protokoll- und Datenanalyse-Workflow für die bidirektionale IS-Analyse. Der bidirektionale Assay kann gleichzeitig sowohl stromaufwärts als auch nachgeschaltete Vektor-Host-Übergänge abbilden. Im Vergleich zu konventionellen unidirektionalen IS-Sequenzierungsansätzen verbessert der bidirektionale Ansatz die IS-Erkennungsraten und die Charakterisierung von Integrationsereignissen an beiden Enden von tEr zielt auf DNA. Die hier beschriebene Datenanalyse-Pipeline identifiziert und zählt identische IS-Sequenzen durch mehrere Vergleichsschritte, die IS-Sequenzen auf das Referenzgenom abbilden und Sequenzfehler bestimmen. Mit einem optimierten Assayverfahren haben wir vor kurzem die detaillierten Wiederholungsmuster von Tausenden von Hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Klonen nach Transplantation in Rhesusmakaken verabreicht und zeigen zum ersten Mal den genauen Zeitpunkt der HSC - Wiederbelegung und die funktionelle Heterogenität der HSCs in der Primasystem. Das folgende Protokoll beschreibt den Schritt-für-Schritt-experimentellen Prozedur- und Datenanalyse-Workflow, der identische IS-Sequenzen genau identifiziert und quantifiziert.
Introduction
Retroviren setzen ihre genomische DNA in das Wirtsgenom an verschiedenen Stellen ein. Diese einzigartige Eigenschaft, die zur Entwicklung von Krebs und anderen Formen der viralen Pathogenese beitragen kann, hat den ironischen Vorteil, diese Viren für die Zelltherapie für die Gentherapie und die Grundlagenforschung zugänglich zu machen. Die virale Integrationsstelle (IS) - der Standort auf dem Wirtsgenom, in dem eine fremde DNA (Virus) integriert ist - hat wichtige Implikationen für das Schicksal sowohl der integrierten Viren als auch der Wirtszellen. IS-Assays wurden in verschiedenen biologischen und klinischen Forschungsstufen verwendet, um die retrovirale Integrationssortierung und -pathogenese, die Krebsentwicklung, die Stammzellbiologie und die Entwicklungsbiologie 1 , 2 , 3 , 4 zu untersuchen. Niedrige Erkennungsempfindlichkeit, schlechte Datenreproduzierbarkeit und häufige Kreuzkontamination gehören dazuDie Schlüsselfaktoren, die die Anwendung von IS-Assays auf aktuelle und geplante Studien beschränken.
Es wurden viele IS-Analysetechnologien entwickelt. Restriktionsenzym-basierte Integrationsstellen-Assays, einschließlich Linker-vermittelte (LM) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 5 , inverse PCR 6 und Linear-Amplification-Mediated (LAM) PCR 7 , sind die am häufigsten verwendeten. Die Verwendung von ortsspezifischen Restriktionsenzymen erzeugt jedoch während des Abrufs des IS eine Vorspannung, die nur eine Teilmenge von Integromen (eine in das Wirtsgenom integrierte Fremd-DNA) in der Nähe der zu erholenden Restriktionsstelle erlaubt. In den letzten Jahren wurden auch Assay-Technologien eingeführt, die den Vektor IS umfassender beurteilen. Diese Assays verwenden verschiedene Strategien, einschließlich Mu transposonvermittelter PCR 8 , nichtrestriktives (nr) -LAM PCR 9 , Typ-II Restriktionsenzym-mDer abgetrennte Verdauung 10 , die mechanische Scherung 11 und die zufällige Hexamer-basierte PCR (Re-free PCR) 12 , um genomische DNAs zu zersplittern und IS zu verstärken. Die derzeitigen Technologien weisen unterschiedliche Erfassungsempfindlichkeiten, die Genomabdeckung, die Zielspezifität, die hohe Durchsatzkapazität, die Komplexität der Assayverfahren und die Vorspannung bei der Erfassung der relativen Frequenzen von Zielstellen auf. Angesichts der unterschiedlichen Qualitäten der vorhandenen Assays und der Vielfalt der Zwecke, für die sie verwendet werden können, sollte der optimale Assay-Ansatz sorgfältig ausgewählt werden.
Diese Arbeit liefert detaillierte experimentelle Verfahren und einen rechnerischen Datenanalyse-Workflow für einen bidirektionalen Assay, der die Erkennungsraten und die Sequenzquantifizierungsgenauigkeit durch gleichzeitiges Analysieren des IS stromaufwärts und stromabwärts der integrierten Ziel-DNA signifikant verbessert (siehe Abbildung 1 für eine schematische Ansicht der Assay-Verfahren ). Dieser Ansatz bietet auchS die Mittel, um den retroviralen Integrationsprozess zu charakterisieren (z. B. die Treue der Zielortduplikation und Variationen in den genomischen Sequenzen von Upstream- und Downstream-Insertionen). Andere bidirektionale Verfahren wurden hauptsächlich für die Klonierung und Sequenzierung beider Enden der Ziel-DNA 11 , 13 , 14 verwendet. Dieser Assay ist weitgehend optimiert für die Hochdurchsatz- und reproduzierbare Quantifizierung von Vektor-markierten Klonen unter Verwendung des etablierten LM-PCR-Verfahrens und der Rechenanalyse-Mapping und zur Quantifizierung sowohl der Upstream- als auch der Downstream-Junctions. Die bidirektionale Analyse mit dem TaqαI-Enzym hat sich für die Hochgeschwindigkeits-Clonal-Quantifizierung in der präklinischen Studie der Stammzell-Gentherapie als nützlich erwiesen 2 , 15 . Dieses Papier beschreibt eine modifizierte Methode mit einem häufiger Cutter (RsaI / CviQI - Motiv: GTAC), die t verdoppeltEr schätzt die Integrome im Vergleich zu einem TaqαI-basierten Assay . Detaillierte experimentelle und Datenanalyseverfahren, die GTAC-Motivenzyme für lentivirale (NL4.3 und ihre Derivate) und gamma-retrovirale (pMX-Vektoren) Vektor-IS-Analyse verwenden, werden beschrieben. Die in dem Assay verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle 1 aufgelistet. In dem ergänzenden Dokument ist ein eigenständiges Programmierskript für die IS-Sequenzanalyse enthalten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Upstream (links) - und nachgeschaltete (rechts) -Funktionssequenzbibliotheken erzeugen
- DNA-Linker-Präparation:
- Eine 10 & mgr; l Linker-DNA-Lösung wird durch Zugabe von 2 & mgr; l 100 & mgr; M LINKER_A-Oligos (endgültig: 20 & mgr; M), 2 & mgr; l 100 & mgr; M LINKER_B-Oligos (endgültig: 20 & mgr; M), 2 & mgr; l 5 M NaCl (endgültig: 1 M) 4 μl nukleasefreies Wasser in einem PCR-Röhrchen. Siehe Tabelle 1 für die Linker-Sequenzen.
- Inkubieren Sie die Linker-DNA-Lösung bei 95 ° C für 5 min in einem PCR-Instrument, stoppen Sie das laufprogramm und schalten Sie das PCR-Instrument aus. Lassen Sie die Linker-Lösung in das Instrument für 30 min, um langsam abkühlen die Linker-DNA. Die Linker-DNA-Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden.
- LTR-spezifische Biotin-Primer-Erweiterung:
- Verwenden Sie ein UV-Vis-Spektrophotometer, um die DNA-Konzentration und 260/280 nm-Werte der genomischen DNA aus in vivo zu bestimmenOder in vitro Experimente Verdünnen Sie 1-2 μg Probe genomische DNA auf ein Endvolumen von 170 μl genomischer DNA-Lösung unter Verwendung von nukleasefreiem Wasser.
- Eine 200 & mgr; l PCR-Reaktion durch Mischen von 2,5 & mgr; l von jeweils 10 & mgr; M HIV-1-spezifischen Biotin-Primern (L-BPs und R-BPs in Tabelle 1 : insgesamt 10 & mgr; l für vier Lentivirus-spezifische Primer), 20 & mgr; l 10X-Thermostabilität, DNA-Polymerasepuffer, 4 & mgr; l 10 mM dNTPs (endgültig: 200 & mgr; M von jedem dNTP), 3 & mgr; l 2,5 U / & mgr; l thermostabile DNA-Polymerase und 163 & mgr; l genomische DNA.
HINWEIS: Für gammaretrovirale Vektoren (pMX-Vektoren) verwenden Sie jeweils 5 μl von jeweils 10 μM pMX-spezifischen Biotin-Primern (L-BP und R-BP: insgesamt 10 μl) anstelle der vier HIV-1-spezifischen Biotin-Primer oben. - Teilen Sie die Lösung in vier PCR-Röhrchen (jeweils 50 μl) und führen Sie einen einzigen Extensionszyklus unter folgenden Bedingungen durch: 94 ° C für 5 min, 56 ° C für 3 min, 72 ° C für 5Min und 4 ° C für die Lagerung.
- Pool alle vier PCR-Reaktionen in ein 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen und folgen dem PCR-Reinigungsverfahren des PCR-Reinigungskits. Mit 50 μl Elutionspuffer (5-fach wasserverdünnter Elutionspuffer im Kit) eluieren. Gehen Sie sofort mit Schritt 1.3.1 vor oder lagern Sie die eluierte DNA bei -20 ° C.
- RsaI und CviQI Verdauung
- Eine 100 & mgr; l Verdauungsreaktion durch Zugabe von 50 & mgr; l DNA (aus Schritt 1.2.4), 10 & mgr; l 10 × Puffer A und 2 & mgr; l (20 U) RsaI-Enzym vorbereiten. Inkubieren bei 37 ° C für 1 h in einem PCR-Instrument.
- 1 & mgr; l (10 U) CviQI-Enzym der Reaktion zugeben und bei 25 ° C für 30 min in einem PCR-Instrument inkubieren. Sofort mit Schritt 1.4.1 fortfahren
- Stumpfes Ende:
- Vorbereitung einer 4,5-ul-Mischung, die 2,5 & mgr; l DNA-Polymerase I großes (Klenow) -Fragment und 2 & mgr; l 10 mM dNTPs enthält. Übertragung 181; L der Mischung zu der DNA-Probe aus Schritt 1.3.2. Das Gesamtvolumen beträgt 102 μl. Mischen Sie gut durch Vortexen und inkubieren bei 25 ° C für 1 h in einem PCR-Instrument. Sofort mit Schritt 1.6.1 fortfahren.
- Herstellung von Streptavidinperlen:
- Die Streptavidin-Kügelchen-Lösung kurz vorwirbeln und 50 μl in ein neues 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Den Überstand mit dem Magnetständer entfernen und die Perlen mit 200 μl Bindungslösung waschen.
- Die Perlen in 100 & mgr; l Bindungslösung resuspendieren und das Röhrchen von dem Magnetständer wegführen. Sofort mit Schritt 1.6.1 fortfahren.
- Streptavidin-Perlenbindung:
- Übertragen Sie 100 μl Proben-DNA (Schritt 1.4.1) auf die 100 μl re-suspendierte Perllösung (Schritt 1.5.2) und mischen Sie sorgfältig durch Pipettieren, um ein Schäumen der Lösung zu vermeiden. Das Röhrchen bei Raumtemperatur für 3 h auf einem rotierenden Rad oder einer Rolle inkubieren.
- Verwenden Sie den Magnetständer, um die Perlen zu fangen und den Überstand zu verwerfen. Waschen Sie die Kügelchen zweimal in 400 & mgr; l Waschlösung und zweimal in 400 & mgr; l 1x T4-DNA-Ligasepuffer (verdünnt aus 10facher Lösung unter Verwendung von nukleasefreiem Wasser).
- Die Perlen in 200 & mgr; l 1x T4-DNA-Ligasepuffer (verdünnt aus 10X-Lösung unter Verwendung von nukleasefreiem Wasser) resuspendieren und von dem magnetischen Stand wegführen. Sofort mit Schritt 1.7.1 fortfahren.
- Linker ligation:
- Eine 400 & mgr; l Ligationsreaktionslösung in einem 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen durch Mischen von 0,5 & mgr; l des DNA-Linkers (Schritt 1.1.2), 10 & mgr; l 10 × T4-DNA-Ligasepuffer, 20 & mgr; l 5 × T4-DNA-Ligasepuffer (enthaltend 25% Polyethylen) Glykol), 5 & mgr; l T4-DNA-Ligase, 164,5 & mgr; l nukleasefreies Wasser und 200 & mgr; l der wieder suspendierten Perlen (Schritt 1.6.3). Das Reaktionsrohr auf das rotierende Rad stellen und bei RT (22 ° C) für 3 h (oder 16 ° CO / N) inkubieren. Waschen Sie die Perlen zweimal mit der Waschlösung und zweimal mit 1X thermostabilem DNA-Polymerase-Puffer (verdünnt aus 10x Lösung unter Verwendung von nukleasefreiem Wasser) unter Verwendung des magnetischen Standes.
- Die Perlen in 50 μl 1x thermostabilem DNA-Polymerase-PCR-Puffer resuspendieren und vom magnetischen Stand ablegen. Sofort mit Schritt 1.8.1 fortfahren oder bei 4 ° C bis zu einem Tag lagern.
- Vorverstärkung der linken und rechten Kreuzungs-DNA:
- Vorbereitung einer 200 & mgr; l PCR-Reaktion durch Zugabe von 10 & mgr; l 10 & mgr; M 1L-Primer, 10 & mgr; l 10 & mgr; M 1R-Primer, 20 & mgr; l des 10 & mgr; M-Primers Link1 (Tabelle 1), 10 & mgr; l 10X thermostabiler DNA-Polymerase-Puffer, 4 & mgr; l 10 mM dNTPs (endgültig: 200 & mgr; M von jedem dNTP), 8 & mgr; l (20 U) thermostabile DNA-Polymerase und 88 & mgr; l nukleasefreies Wasser zu den wieder suspendierten Perlen (50 & mgr; l) aus Schritt 1.7.3.
- Aliquot die Reaktionsmischung in 4 PCR-Röhrchen (jeweils 501; L) und Durchführung der PCR mit der folgenden Bedingung: 94 ° C Inkubation für 2 min; 25 Zyklen von 94 ° C für 20 s, 56 ° C für 25 s und 72 ° C für 2 min; Und eine endgültige Verlängerung bei 72 ° C für 5 min.
- Alle 4 PCR-Reaktionen in ein 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen bringen und dem PCR-Reinigungsverfahren des PCR-Reinigungskits folgen. Mit 50 μl Elutionspuffer eluieren
- Bestimmen Sie die DNA-Konzentration und 260/280-nm-Werte mit einem UV-Vis-Spektrophotometer; Die DNA kann bei -20 ° C gelagert werden, bis sie für den nächsten Schritt fertig ist. Fahren Sie mit den Schritten 1.9.1 / 1.10.1 (optional) oder direkt mit den Schritten 1.11.1 / 1.12.1 fort.
- Entfernen des linken internen DNA-Amplicons (optional):
- Übertragen Sie bis zu 100 ng PCR-DNA-Produkt aus Schritt 1.8.4 in ein 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie das Volumen auf 10 μl unter Verwendung von nukleasefreiem Wasser ein.
- Bereiten Sie eine Restriktionsenzymreaktion vor, die speziell auf die linke interne D abzieltNA amplicon
HINWEIS: Die Reaktionsbedingungen können je nach Wahl des Enzyms abweichen. Zum Beispiel, wenn man die linke interne DNA von NL4.3-basierten lentiviralen Vektoren entfernt, fügen Sie 1 & mgr; l PvuII , 2 & mgr; l Puffer B und 7 & mgr; l nukleasefreies Wasser hinzu. Inkubieren bei 37 ° C für 1 h in einem PCR-Instrument. Sofort mit Schritt 1.11.1 oder bei -20 ° C aufbewahren.
- Entfernen des rechtsseitigen internen DNA-Amplicons (optional):
- Gehen Sie wie in Schritt 1.9.1 vor.
- Bereiten Sie eine Restriktionsenzymreaktion vor, die speziell auf das rechtsseitige interne DNA-Amplicon abzielt.
HINWEIS: Zum Beispiel, wenn man die rechtsseitige interne DNA aus NL4.3-basierten lentiviralen Vektoren entfernt, fügen Sie 1 μl sfoI , 2 μl Puffer B und 7 μl nukleasefreies Wasser hinzu. Inkubieren bei 37 ° C für 1 h in einem PCR-Instrument. Sofort mit Schritt 1.12.1 fortfahren oder bei -20 ° C lagern.
- Links-junction-spezifische Verstärkung:
- Eine 50 μl PCR-Reaktion wird durch Mischen von 5 μl DNA aus Schritt 1.8.4 (oder aus dem optionalen Schritt 1.9.2), 5 μl 10 μM 2L-Primer (endgültig: 1 μM), 5 μl 10 μM Primer Link2, hergestellt (Endgültig: 1 μM), 5 μl 10x thermostabiler DNA-Polymerasepuffer, 1 μl 10 mM dNTPs (endgültig: 200 μM von jedem dNTP), 2 μl (5 U) thermostabile DNA-Polymerase und 27 μl nukleasefreies Wasser.
- Führen Sie die PCR mit der folgenden Bedingung aus: 94 ° C Inkubation für 3 min; 8-15 Zyklen von 94 ° C für 20 s, 56 ° C für 25 s und 72 ° C für 2 min; Und eine endgültige Verlängerung bei 72 ° C für 5 min.
HINWEIS: Amplifizierte DNA kann bei -20 ° C gelagert werden. * Zykluszahl-Optimierung wird vorgeschlagen. - Befolgen Sie das PCR-Reinigungsverfahren des PCR-Reinigungskits. Mit 50 μl Elutionspuffer eluieren Bestimmen Sie die DNA-Konzentration und 260/280 nm Werte.
- Alle Verfahren sind identisch mit der "Links-Junction-spezifischen Verstärkung" (Schritte 1.11.1-1.11.3), mit Ausnahme der Verwendung verschiedener Primer; Verwenden Sie in diesem Schritt die rechtsverknüpfungsspezifische Primer (2R-Primer, siehe Tabelle 1 ).
- Analysieren Sie die PCR-Amplikon-Längenvariationen, indem Sie 2% Agarose-Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese durchführen (Abbildung 2 ).
HINWEIS: Dies ist ein wesentlicher Schritt, um den Abschluss der Assay-Verfahren zu bestätigen und eine grobe Bewertung von IS-Mustern auf der Grundlage der PCR-Bandmuster zu machen. Das gereinigte PCR-Amplicon aus den Schritten 1.11.3 und 1.12.3 kann für verschiedene DNA-Sequenzierungsplattformen verwendet werden. Gehen Sie mit den entsprechenden Probenvorbereitungsverfahren für die klassische Kettenabbruch- (Sanger-) Sequenzierung oder Sequenzierung der nächsten Generation vor. Die DNA kann bei -20 ° gelagert werdenC;
2. Berechnungs-IS-Sequenzanalyse
- Vorbereitung der Datendateien:
- Vorbereiten von drei Eingabedatendateien: eine Fasta-Format-Sequenz-Datendatei (Test_data.fa in ergänzenden Daten), eine tsv-Datei für die Suchmotive für Vektor- und Linkersequenzen (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv in ergänzenden Daten) und eine tsv-Datei für Restriktionsenzyminformationen (Enzym.sv in ergänzenden Daten).
HINWEIS: Diese Dateien sind zum Demultiplexen, Trimmen von Vektor- und Linkersequenzen und zum Entfernen interner Vektorsequenzen erforderlich (Abbildung 3A ). Detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Implementierung des rechnerischen Workflows finden Sie in der README.txt-Datei in den ergänzenden Daten.
- Vorbereiten von drei Eingabedatendateien: eine Fasta-Format-Sequenz-Datendatei (Test_data.fa in ergänzenden Daten), eine tsv-Datei für die Suchmotive für Vektor- und Linkersequenzen (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv in ergänzenden Daten) und eine tsv-Datei für Restriktionsenzyminformationen (Enzym.sv in ergänzenden Daten).
- Berechnungsanalyse:
- Führen Sie Demultiplex- und Trimm-Scripts aus.
HINWEIS: Die Rohsequenz wird zum Demultiplexen und zum Trimmin verarbeitetG der Vektor-, Linker- und Primersequenzen (siehe STEP-1 in der ergänzenden README.txt-Datei). - Führen Sie den Mapping-Befehl aus (siehe STEP-2 in der README.txt-Datei), um die verarbeiteten Sequenzen mit einem BLAST-ähnlichen Ausrichtungswerkzeug (BLAT; www.genome.ucsc.edu) auf das Referenzgenom abzubilden.
- Führen Sie das quantitative IS-Analyse-Skript aus (siehe STEP-3 in der Datei README.txt).
HINWEIS: Es werden zwei Ausgabedateien (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt und Final_count.txt) erzeugt. Weitere Details zu Mapping- und Sequenz-Enumerationsstrategien finden Sie in der Datei "README.txt" in den ergänzenden Daten und in den vorherigen Publikationen 2 , 15 .
- Führen Sie Demultiplex- und Trimm-Scripts aus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der bidirektionale IS-Assay erzeugte verschiedene Größen von PCR-Amplicons sowohl für die stromaufwärts (links) als auch für den stromabwärtigen (rechten) Vektor-Host-Übergang (Abbildung 2 ). Die Größe eines PCR-Amplicons hängt von der Lage des nächsten GTAC-Motivs stromaufwärts und stromabwärts von einem Integrom ab. Der Assay erzeugte auch interne DNA-PCR-Amplifikate: retrovirale Sequenzen in der Nähe des Polypurintrakts und der Primerbindungsstelle wurden gleichzeitig während der Links- bzw. Rechten-Kreuzungs-PCR amplifiziert. PCR-Amplikonbanden können durch Kapillar- oder Agarose (2%) Elektrophorese visualisiert werden.
Nach der Sequenzierung wurden sowohl die Links- als auch die Rechten-Junction-Sequenz durch ein hauseigenes Programmierskript zur Vorverarbeitung von Rohsequenzen (einschließlich Demultiplexing und Trimmvektor und Linker-DNA) analysiert, IS-Sequenzen auf das Genom abgebildet, identifiziertes und zählendes identisches ISSequenzen und Anwendung von Fehlerkorrekturprozeduren (Abbildung 3 ). Orte des 5'-Endes der Abfragesequenzen im Referenzgenom gelten als IS und werden für die Anfangszählung jedes IS verwendet. Die Kriterien, die die beiden passenden Sequenzen bestimmen, stromaufwärts (links) und stromabwärts (rechts), die aus demselben Integrom stammen, basieren auf den Nukleotidsequenzmustern der retrovirus-spezifischen konzertierten Integration und sind wie folgt: (i) Zwei Verbindungssequenzen Auf das Genom in den entgegengesetzten Orientierungen ausrichten. (Ii) Die IS der beiden Verbindungssequenzen werden durch eine 5-bp-Überlappung für humane Immunschwäche-Virus (HIV) -Vektoren und eine 4-bp-Überlappung für murine Leukämievirus (MLV) -Vektoren getrennt. Die ersten 5 bp der beiden Knotenpunkte von HIV und 4 bp von MLV-Übergängen sind umgekehrt komplementär.
IS-Sequenzzählungen werden in drei Schritten bestimmt: (1) Kartierung von IS-Sequenzen auf das GenomMit BLAT, der die Mapping-Qualität erzeugt und einzelne IS-Sequenzen in "Single-Hit", "Multi-Hit", "No-Hit" und "Andere" Gruppen trennt; (2) mit dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), um Single-Hit-Sequenzen mit anderen suboptimal zugeordneten Sequenzen zu vergleichen, einschließlich Multi-Hits, No-Hits und andere; Und (3) Identifizieren und Korrigieren von Sequenzierungsfehlern, einschließlich Homopolymerfehlern. Multi-Hit-Sequenzen sind IS-Sequenzen, die zwei oder mehr genomische Positionen mit einem hohen Mapping-Score ausrichten können. Obwohl es für die Identifizierung und Quantifizierung von klonalen Populationen noch nützlich ist, können die Multi-Hit-Sequenzen nicht zur Charakterisierung von Verteilungsmustern der genomischen Integrationsstelle (z. B. Assoziation mit Genen, Wiederholungen oder anderen genomischen Zeichen) verwendet werden. In einigen seltenen Fällen zeigen die beiden Verbindungssequenzen unterschiedliche Abbildungsqualitäten. Zum Beispiel zeigt man "Single-Hit", während die Matching-Sequenz "Multi-Hit" zeigt. In solchen Fällen sind beideSequenzen werden als "Single-Hit" -Sequenzen behandelt.
Ein Teil der IS-Sequenzen mit suboptimalen Mapping-Scores, die eine hohe prozentuale Genom-Matching (Identität) mit einer abnormen Abfragegröße (QSIZE) oder umgekehrt zeigen, wurden von "No-Hits" getrennt und in "andere" für eine zusätzliche und oft gruppiert Manuelle Neubewertung Zum Beispiel können bei der Verwendung von BLAT für die Genomabbildung einige IS-Sequenzen eine abnormale QSIZE aufgrund von fehlangepassten Nukleotiden in den ersten oder letzten 5-10 Nukleotiden zeigen. Diese Sequenzen entsprechen oft nicht den Mapping-Kriterien für den "Single-Hit" - oder "Multi-Hit" -Status, trotz eines relativ hochwertigen Mapping-Ergebnisses.
Als Ergänzungsdaten werden eine Beispiel-Rohsequenz-Datendatei (Test_DATA.fa: 33.374 Sequenzen) und Sample-Ausgabedatendateien bereitgestellt. 1 μg genomische DNA aus humanen repopulierenden Zellen, transduziert mit Lent Ivirale Vektoren (FG12) in einer humanisierten Knochenmark / Leber / Thymus (BLT) Maus 17 wurden unter Verwendung des bidirektionalen Assays analysiert. Retrovirale IS wurden überall im Genom gefunden. Typischerweise sind lentivirale Vektoren in Genen überrepräsentiert, während gamma-retrovirale Vektoren in den Transkriptionsstartstellen 16 ( 4 ) überrepräsentiert sind. Von zwei menschlichen repopulierenden Zellproben wurden insgesamt 1.081 Sequenzen-851 aus dem vorgeschalteten (links) und 230 die stromabwärts liegenden (rechten) Übergänge als IS-Sequenzen qualifiziert. Aus diesen Sequenzen wurden 93 einzigartige IS in der linken und 50 einzigartigen IS in den richtigen Kreuzungen identifiziert. Davon wurden 44 in beiden (linken und rechten) Kreuzungen identifiziert, wobei insgesamt 99 einzigartige Integrome in den Testproben gezeigt wurden. IS sind im Vergleich zu zufälligen Ereignissen signifikant an Genen angereichert (Abbildung 66), p <0,0001) (Abbildung 4A ).
"> Beispiel-Gamma-Retrovirus-Vektor (pMX) -Integrations-Site-Sequenzen sind ebenfalls in der Testdatendatei enthalten. Aus einer gemischten Pmx-konstruierten Zellprobe, transduziert mit pMX, das Oct4, cMyc, Klf4 und Sox2, 1,611 IS Sequenzen und 129 einzigartig exprimiert IS wurden identifiziert. Von 65 und 76 einzigartige IS identifiziert in der linken und rechten Kreuzungen, jeweils 12 waren in beiden Kreuzungen.Es wurde bereits gezeigt, dass PCR-Amplifikate von ≥ 500 bp in der Pyrosequenzierungsplattform schlecht sequenziert sind, während PCR-Amplifikate von <500 bp im Allgemeinen gut sequenziert sind, ohne eine bemerkenswerte Vorspannung in Bezug auf Sequenzlängen 15 . Somit wurden Sequenzdaten von ≥ 500 bp PCR-Amplifikaten ausgeschlossen, um die längenbezogene Sequenzierungsvorspannung zu entfernen. Für die quantitative Klonalanalyse wurden nur Daten von <500 bp PCR-Amplicon (als quantifizierbarer Vektor-Integrom oder QVI bezeichnet) verwendet. Die relativen Erkennungsfrequenzen von VektorintegritätenWurden unter Verwendung nur der Sequenzzählungen von IS-Übergängen berechnet, die <500 bp PCR-Amplicons erzeugen ( Abbildung 4B -4D , siehe auch Tabelle 2 ). Ungefähr 77% der Vektoren konnten durch diese Strategie quantitativ analysiert werden (Abbildung 4B ). Als Ergebnis wurde erwartet, dass die berechneten Frequenzen für jedes QVI die wahren Frequenzen in der Probe ( Fig. 4E ) um 1,25x überschätzen würden.
Abbildung 1: Eine schematische Darstellung der bidirektionalen Integrationsseitenanalyse. Doppelsträngige retrovirale DNA (schwarz und rot), die von zellulärer DNA (blau) flankiert ist, werden gezeigt. Die Pfeile stellen Oligonukleotid-Primer dar, und Pfeile mit einem Sternchen stellen Biotin-Primer dar. Linker-DNAs sind mit lila Linien bezeichnet. Kurz gesagt, eine lineare Erweiterung von linksBiotin-Primer (L-BP) und rechter Biotin-Primer (R-BP) aus dem viralen Long Terminal Repeat (LTR) erzeugt biotinylierte, doppelsträngige IS-DNA. Nach der Verdauung mit CviQI und RsaI wird die biotinylierte doppelsträngige DNA mit Streptavidin-Biotin-spezifischer Bindung angereichert und mit Linker-DNA ligiert. Streptavidin-gefangene, Linker-ligierte Vektor-Wirts-Junction-DNAs werden durch eine zweistufige PCR amplifiziert: Vorverstärkung (Amplifikation sowohl der linken als auch der rechten Kreuzung), gefolgt von zwei verschachtelten PCRs, die jeweils auf Links- und Rechtsverknüpfungen ausgerichtet sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentatives PCR Amplicon Image. ( A ) Die Kapillarelektrophoreseanalyse zeigt unterschiedliche Längen des PCR-AmpsLizenzen in lentiviralen Vektor (FG12) Integrationsstellen nach pvuII oder sfoI- Verdauung . Unterschiedliche PCR-Bänder für vorgelagerte (linke) und nachgeschaltete (rechte) Vektor-Host-Übergänge werden gezeigt. Die dunklen Pfeilköpfe zeigen die internen Vektor-DNA-Ampullen an, die nach der PvuII- oder SfoI- Verdauung verbleiben. Der DNA-Größenmarker (0,1 - 2,5 kbp) befindet sich auf der M-Spur. Die offenen Pfeilköpfe zeigen Ausrichtungsmarkierungen (15 & 5000 bp) an. DNA-Ausrichtungsmarkierungen werden für die Kalibrierung der Migrationszeitvariation über alle Kanäle verwendet. ( B ) Gamma-retrovirale (pMX) Vektorintegrationsstellen in murinen Zellklonen, die mit mehreren pMX-Vektoren transduziert wurden. Links- und rechtsverknüpfte DNAs sowie interne Vektor-DNA-Amplifikate (Pfeilköpfe) werden gezeigt. Die dunklen und offenen Pfeilköpfe zeigen interne Vektor-DNA und Ausrichtungsmarkierungen an. Der DNA-Größenmarker (50-1.500 bp) befindet sich auf der M-Spur. Details zur Kapillarelektrophorese finden Sie im UnternehmenProtokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Integration Site Sequence Analysis. ( A ) Ein Flussdiagramm für die Berechnungsdatenanalyse. Es sind drei Datendateien, darunter eine Fasta-Format-Sequenzdatei, eine Datei mit Referenzsequenzmotiven für Demultiplexing und Trimmen sowie eine Datei mit Restriktionsenzyminformationen erforderlich. Beispieldateien, einschließlich Test_DATA.fa (Sequenzdaten), Demultiplexing_Trimming.tsv (Suchsequenzmotive) und Enzyme.tsv (Restriktionsenzymerkennungssequenz) werden als ergänzende Datendateien bereitgestellt. Die verarbeiteten Sequenzen (Host-Genom-Sequenzen) aus Teil 1 werden mit BLAT auf die Referenz abgebildet. Standorte am 5'-Ende der Abfrage-SequenzEs werden im Referenzgenom als Integrationsorte betrachtet ( Tabelle 2 ). Die Sequenzzählungen für jedes IS werden in drei Schritten bestimmt: (1) Mapping von IS-Sequenzen auf das Genom unter Verwendung von BLAT; (2) Vergleich von Single-Hit-IS-Sequenzen (Ausrichtung auf eine einzigartige Stelle des Wirtsgenoms) mit anderen Sequenzen, die suboptimal auf das Genom abgebildet wurden; Und (3) Identifizieren und Korrigieren von Sequenzfehlern. Weitere Details zu Mapping- und Sequenz-Enumerationsstrategien finden sich in früheren Studien 2 , 15 . ( BC ) Zwei Beispiel einzelsträngige DNA-Sequenzen für die stromabwärtigen (B) und die stromaufwärtigen (C) Vektor-Host-Übergänge sind gezeigt. Pyrosequenzierungsprimer A und B (grün) werden für Tröpfchen-PCR und Sequenzierung verwendet. Die Farbcodes stimmen mit denen in Abbildung 1 überein. Die stromabwärts liegende Sperrsequenz (B) enthält Primer A (grün), MID (grün), Vektor U5 Ende (rot), Wirtsgenom (blau), liNker (lila) und Primer B (grün). In einer gemischten (stromaufwärts und stromabwärts) DNA-Sequenzierung wird Primer A zur Sequenzierung der stromabwärtigen Übergänge (B) verwendet, und Primer B wird für die Sequenzierung der stromaufwärtigen Übergänge verwendet. Die Probe-Upstream-Junction-Sequenz (C) enthält Primer B, MID, Vector U3 Ende, Host Genom, Linker und Primer A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentatives Beispiel für die bidirektionale Integrationsseitenanalyse. ( A ) Prozentintegration in Genen (Refseq), Alu und LINE 1 (L1) Wiederholungen von lentiviralen Vektoren in humanisierten Maus-Repopulationszellen (LV-huMice), im Vergleich zu silico- generierten 10.000 zufälligen Integrationsereignissen. Integrationsseiten werden zugeordnetAuf das menschliche Genom (hg19). LV-huMice-Integrationsstandorte sind in Genen signifikant dargestellt ( p <0,0001, Chi-Quadrat-Approximation) ( B ) Bei der Silico- Analyse von 10.000 zufälligen Integrationsereignissen. Bei einem unidirektionalen Ansatz erzeugten etwa 52% der zufälligen Integrome PCR-Amplifikate von <500 bp, wohingegen 77% bei einem bidirektionalen Ansatz ein PCR-Amplicon von <500 bp in den linken oder rechten Übergängen erzeugten. PCR-Amplifikate, die länger als 500 bp sind, werden mit dem Pyrosequenzierungs-Platin 2 , 15 ineffizient sequenziert und sollten daher aus quantitativen Datenanalysen ausgeschlossen werden. ( C ) Strategie für die klonale Quantifizierung Jeder einzelne Klon teilt denselben Vektorintegrom (oder IS). Die relativen Frequenzen der linken (x) und rechten (y) -Junktionen werden kombiniert, um die relativen Größen der klonalen Populationen (quantifizierbare Vektor-Integrome oder QVI) darzustellen. Integ Rationsstellen, die kein GTAC-Motiv innerhalb von 450 bp haben, werden disqualifiziert (dQ) und aus der Quantifizierungsanalyse entfernt. ( D ) Die relativen Frequenzen (relativ zu allen QVI-Sequenzen) von 44 QVI-Klonen in humanisierten Mäusen, die Zellen rezyklieren, werden in einem Farbschema (weiß bis rot: 0 bis 0,16) gezeigt. ( E ) Erwartete Überschätzung der Klonfrequenzen mit bidirektionaler Analyse. Basierend auf in Silico 10.000 zufällige Integrationsanalyse wird bei der Verwendung von GTAC-Motivenzymen ( RsaI und CviQI ) wegen etwa 20% dQ-Klonen eine 1,25-fache Überschätzung erwartet. Eine 2.56x Überschätzung wird erwartet, weil etwa 60% dQ Klone bei der Verwendung des TCGA Motiv Enzyms (TaqαI). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Oad / 55812 / 55812table1.jpg "/>
Tabelle 1: Oligonukleotide für lentivirale und Gamma-retrovirale Vektorintegrations-Standortanalyse. * 5BioTEG: Biotin-Modifikation am 5'-Ende. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Tabelle 2: Repräsentative Insertion Site Sequence Count Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
1 Map: Integrations-Site-Sequenzen können auf einen einzigartigen Ort (Single-Hit) oder mehrere Loci (Multi-Hit) des Referenzgenoms abgebildet werden. NA (nicht verfügbar): keine Sequenz wurde erkannt.
2 STRD: Orientierung der Abfragesequenz im Genom
3 QLEN: die Länge der Abfragefolge
4 GLEN: die erwartete Länge der Integrationsort-Sequenz, berechnet auf der Entfernung vom nächstgelegenen GTAC-Motiv im Genom zur Insertionsstelle. GLEN <450 bp werden für quantitative Analysen akzeptiert.
5 Total_Count: Gesamtsequenzzählung
6 Integrationsstellen werden durch eine Chromosomenzahl (CHR) und eine Ortsnummer für die rechte Kreuzung (CHR_SITE1) und eine Zahl für die linke Kreuzung (CHR_SITE2) angezeigt. CHR_SITE1 und CHR_SITE2 sind 5 bp auseinander für lentivirale Vektoren und 4 bp auseinander für MLV (pMX) Vektoren
7 Sequenz zählt für die rechte Kreuzung (R_A) und die linke Kreuzung der Probe A (L_A); Sequenz zählt für den rechten Übergang (R_B) und den linken Knotenpunkt der Probe B (L_B)
* Disqualifiziert (dQ): GLEN ≥450 in silico bp
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der bidirektionale Assay ermöglicht die gleichzeitige Analyse sowohl der vorgelagerten (links) als auch der stromabwärtigen (rechten) Vektor-Host-DNA-Junktionssequenzen und ist in einer Anzahl von Gentherapie-, Stammzell- und Krebsforschungsanwendungen nützlich. Die Verwendung von GTAC-Motiv-Enzymen (RsaI und CviQI) und der bidirektionale PCR-Ansatz verbessern signifikant die Chancen, eine Integrome (oder eine klonische Population) im Vergleich zu früheren TCGA-Motiv-Enzymen (TaqαI) -basierten Assays 2 , 15 und anderen zu detektieren Unidirektionale LM-PCR-Ansätze 5 . Der bidirektionale Assay verbessert die Analyse von IS, insbesondere in den begrenzten DNA-Proben, die häufig in klinischen oder kleinen Tiermodellstudien auftreten.
Die Schritte 1.1-1.7 sind kritischer Schritt und sollten ohne unnötige Verzögerungen durchgeführt werden. Diese Schritte werden in der Regel an einem Tag durchgeführt. Die Prüfung von Enzymen vor diesen Schritten ist sehr empfehlenswert. SchrittS 1.9 und 1.10 sind optional. Diese Schritte reduzieren interne Vektor-DNA-Sequenzen, die gleichzeitig mit IS-Sequenzen amplifiziert werden. Tabelle 1 liefert Primer-Sets, die für die Analyse des IS von Wildtyp-NL4.3-HIV-1, NL4.3-abgeleiteten Vektoren, einschließlich FG12 21 , und pMX-basierten gammaretroviralen Vektoren 22 geeignet sind . Abhängig von den Nukleotidvariationen in den langen terminalen Wiederholungssequenzen (LTR) können die Primer-Konstruktion und der experimentelle Ansatz eine geeignete Modifikation erfordern.
Die Blat-Software, die für die Zuordnung verwendet wird, ist nur mit dem Fasta-Format kompatibel und funktioniert nicht mit Fastq-Dateien. Man kann die Fastq-Dateien mit verschiedenen Software-Tools wie FASTX-Toolkit oder BBTools in Fasta umwandeln. Ein Benutzer mit Grundkenntnissen von Python kann Biopython verwenden, um die Fastq-Dateien in Fasta umzuwandeln, um sie mit Blat zuzuordnen.
Es wird erwartet, dass ein Teil des IS nicht mit dem bidirektionalen I erkannt wirdS-Assay und, auch wenn erkannt, nicht für die nachgeschaltete Klonqualifizierung qualifizieren. Als GTAC-Motiv-Enzyme verwendet wurden, haben etwa 23% der Integrome in den von der Pyrosequenzierungsplattform erzeugten Sequenzdaten die Analysekriterien für die quantitative IS-Sequenzanalyse nicht überschritten (Abbildung 4 ). Wenn eine umfassende IS-Abdeckung entscheidend ist, z. B. bei der Sicherheitsüberwachung von gentechnischen Zellen in Gentherapie-Einstellungen, empfiehlt es sich, einen Assay mit uneingeschränktem Genomzugang auf IS 8 , 9 , 10 , 11 , 12 zu wählen oder zu reanalysieren Gleiche Probe mit einer anderen oder optimierten Kombination von Restriktionen 4 , 18 .
IS-Assays mit uneingeschränktem Genomzugang, wie z. B. nicht-restriktive LAM-PCR und zufällige Scher-ApprOaches 19 , 20 , halten besondere Versprechen für umfassende IS-Analyse. Diese Ansätze verwenden Technologien, die relativ schwer zu kontrollieren sind, was es schwierig macht, das Ergebnis der genomischen DNA-Fragmentierung und der IS-Amplifikation vorherzusagen. Auf der anderen Seite haben IS-Assays, die gut charakterisierte Restriktionsenzyme verwenden, zwei Hauptvorteile: (1) Es ist relativ einfach, Assays zu kalibrieren und zu optimieren, da die Assay-Ergebnisse aufgrund der Spezifität der Enzymreaktion und der Verfügbarkeit von mehr vorhersehbar sind Referenzgenomsequenzen. (2) Sequenzdaten sind hochgradig reproduzierbar, sobald die Assaybedingungen optimiert wurden. Die bidirektionale PCR mit optimierten Bedingungen hat sich für eine großangelegte und genaue Klonqualifizierung 2 , 15 bewährt. Obwohl nur ein Teil der vorhandenen Klonpopulationen aufgrund der Restriktionsenzym-Bias analysiert wurde, wurden die Mengen an Individuen L Klone wurden genau gemessen, wodurch die genaue Bestimmung von Klongrößenvariationen innerhalb und über Proben ermöglicht wurde. Es wurde eine ausreichende Anzahl von Klonen erzeugt, um Stammzellverhaltensmuster und funktionelle Heterogenität zu bestimmen.
Die aus diesem bidirektionalen PCR-Verfahren hergestellten PCR-Amplicons eignen sich für jede nachgeschaltete Sequenzierungsplattform. Wegen der hohen Empfindlichkeit des Assays sollte die äußerste Sorgfalt angewendet werden, um eine Kreuzkontamination durch Experimente in einem kontaminationsfreien Raum zu verhindern. Die Einbeziehung eines negativen (No-Template) Control Experiments wird für alle PCR-Schritte empfohlen. Sogar mit der sorgfältigsten Praxis ist die Vermeidung von Proben-zu-Proben-Kreuzkontamination extrem schwierig. Somit ist es beim Vergleich von Klonpopulationen von verschiedenen Proben ratsam, eine Kollisionskontrolle zu verwenden, die potentielle kontaminierte Daten 23 und einen Cutoff für niederfrequente, unzuverlässige Klone entfernt> 2, um das Rauschen von Kreuzkontaminierten DNA zu minimieren. Der bidirektionale Ansatz erzeugt IS-Daten für beide Enden der Integrome und bietet dadurch eine zusätzliche Möglichkeit, potentielle falsch-positive Detektionsfehler zu reduzieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Finanzierung erfolgte durch die National Institutes of Health Grants R00-HL116234, U19 AI117941 und R56 HL126544; Die National Science Foundation gewährt DMS-1516675; Die Nationale Forschungsstiftung von Korea (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); Und das KRIBB-Initiativprogramm.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10 mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2 mL microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100 - 2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50 - 1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
- Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
- Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
- Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
- Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
- Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
- Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
- Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
- Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
- Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
- Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
- Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).
