Summary
Questo studio dimostra la tecnica per rendere un modello minimamente invasivo e facilmente riproducibile di ischemia del midollo spinale nei ratti. Vari gradi di deficit dell'utensile posteriore possono essere prodotti controllando il tempo di occlusione aortica.
Abstract
L'ischemia del midollo spinale è una complicazione fatale dopo l'intervento aneurisma toracoabdominale aortica. I ricercatori possono studiare le strategie per prevenire e curare questa complicazione utilizzando modelli sperimentali di ischemia del midollo spinale. Il modello qui descritto mostra diversi gradi di paraplegia che si riferiscono alla lunghezza dell'occlusione dopo l'occlusione toracica aortica in un modello di ischemia del midollo spinale.
Un 2-Fr. Il catetere a palloncino è stato avanzato attraverso l'arteria femorale nell'aorta toracica discendente fino a quando la punta del catetere è stata posta all'arteria subclaviana sinistra nei ratti maschi Sprague-Dawley anestetizzati. L'ischemia del midollo spinale è stata indotta dalla gonfiatura del palloncino del catetere. Dopo un periodo di occlusione (9, 10 o 11 minuti), il pallone è stato sgonfiato. La valutazione neurologica è stata eseguita utilizzando l'indice di deficit motorio a 24 ore dopo l'intervento chirurgico e il midollo spinale è stato raccolto per l'esame istopatologico.
I ratti sottoposti a 9 minuti di occlusione aortica hanno mostrato una debolezza motorica lieve e reversibile nell'arto posteriore. I ratti sottoposti a 10 minuti di occlusione aortica presentati con insufficienza motorica moderata ma reversibile. I ratti sottoposti a 11 minuti di occlusione aortica sono esposti in completa e persistente La neuroni motoria nelle sezioni del midollo spinale è stata più conservata nei ratti sottoposti a una durata minore di occlusione aortica.I ricercatori possono ottenere un deficit di trazione posteriore riproducibile dopo l'occlusione toracica aortica utilizzando questo modello di ischemia del midollo spinale.
Introduction
La paraplegia è una complicazione fatale della chirurgia aneurisma toracoabdominale aortica. Esso deriva da lesione del midollo spinale-reperfusione che si verifica durante il cross-clamping e il non-clamping dell'arto. 1 Diverse strategie, tra cui l'ipotermia sistemica e il drenaggio cerebrospinale sono state introdotte per proteggere il midollo spinale, 2 , 3 , 4 ma molti pazienti rimangono colpiti dalla lesione.
Sono stati introdotti diversi modelli di ischemia spinale animale per indagare la patogenesi e sviluppare strategie protettive contro il danno. Nello studio in corso, abbiamo delineato un modello di ratti di ischemia del midollo spinale basato sul metodo di Taira e Marsala. 5 Il sistema di circolazione spinale nei ratti è molto simile alla vascolare del midollo spinale e sistema di garanzia in esseri umani, anche se ci sono alcune differenze nelle dimensioni eluogo. 6 , 7 Pertanto, un ratto è un animale adatto ad anatomia da utilizzare per un modello sperimentale che indaga la patogenesi, le complicanze e il trattamento dell'ischemia del midollo spinale. Inoltre, questo modello di ischemia del midollo spinale produce un'occlusione aortica affidabile con un intervento minimo utilizzando una occlusione intravascolare di pallone dell'arto toracico.
In questo studio abbiamo dimostrato che questo modello di ratti di ischemia del midollo spinale induce deficit di motilità riproducibili negli arti posteriori che variano in gravità a seconda del tempo di occlusione aortica.
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Protocol
Questo protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di Seoul National University Bundang Hospital. La cura degli animali e le esperienze sperimentali sono state condotte secondo le istruzioni nazionali degli istituti di salute degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Preparazione chirurgica
- Prima dell'operazione, sciacquare i cateteri con salina sterile per assicurare la penetrazione.
- Mettere una coperta riscaldante sul tavolo operatorio e coprire la tavola con un tappeto sterile.
- Posizionare i ratti maschi Sprague-Dawley (270-330 g) in una scatola acrilica con 3,0% -4,0% di isoflurano in ossigeno al 100%.
- Applicare il lubrificante agli occhi del ratto.
- Posizionare il ratto sul tavolo operatorio in posizione supina e mantenere l'anestesia usando una maschera facciale con una continua somministrazione di isoflurano inalato (1,0% -2,5 vol%).
- Posizionare una sonda rettale per monitorare e mantenere la temperatura corporea tra 37,0 e 38,0 ° C.
2. Cateterizzazione dell'arteria femorale
- Scorri delicatamente l'area inguinale destra usando Betadine e il 70% di etanolo.
- Fai un'incisione orizzontale di 2 cm con le forbici sulla zona inguinale destra.
- Utilizzando un retrattore, esporre il campo chirurgico.
- Dissectare l'arteria femorale dalla vena circostante e dal nervo. Isolare una sezione di 1 cm dell'arteria utilizzando pinze curve e pinze sbilanciate.
- Utilizzando una sutura di seta nera 4,0, posizionare una cravatta allentata su entrambe le estremità prossime e distali dell'arteria per massimizzare l'esposizione.
- Effettuare un'incisione sull'arteria femorale utilizzando micro-forbici.
- Inserire un 2-Fr. Catetere a palloncino in arteria femorale con micro-pinze. Fissare il catetere alla vasca di circa 1 cm dalla testa del catetere con la legatura prossimale e quindi legare la legatura distale.
3. Cateterizzazione dell'arteria carotidea
- Scrutare il collo anteriore destro utilizzando betadIne e il 70% di etanolo, quindi fai una incisione cutanea.
- Utilizzando un retrattore, esporre il campo chirurgico. Isolare una sezione di 1 cm dell'arteria e legarla leggermente utilizzando una sutura di seta sulle estremità prossime e distali dell'arteria per massimizzare l'esposizione.
- Puntare l'arteria carotide usando un catetere endovenoso 24 G, e avanzare il prossimo 1 cm del catetere verso il cuore.
- Fissare il catetere con la legatura prossimale e quindi legare la legatura distale.
- Utilizzando un rubinetto a 3 vie, collegare l'estremità distale del catetere al serbatoio micro-tubo pieno-salino e serbatoio esterno.
4. Cateterizzazione dell'arteria del ciglio
- Scrub la zona ventrale della coda usando betadina e il 70% di etanolo e fai un'incisione della pelle di 2 cm.
- Disseccare l'arteria coda dalle strutture circostanti e isolare una sezione di 1 cm dell'arteria utilizzando pinze curve e pinze sbilanciate.
- Utilizzando una sutura di seta nera 4,0, posizionare uno scioltoLegame su entrambe le estremità prossime e distali dell'arteria per massimizzare l'esposizione.
- Puntare l'arteria coda usando un catetere endovenoso 24 G, e far avanzare il catetere nell'arteria.
- Fissare il catetere alla vasca (circa 1 cm dalla testa del catetere) con la legatura prossimale e legare la legatura distale.
- Collegare la parte distale del catetere al dispositivo di monitoraggio della pressione arteriosa.
5. Induzione dell'ischemia del midollo spinale
- Dopo che la cateterizzazione è completa, avanzare i 2 Fr. Catetere a palloncino in arteria toracica discendente in modo che la punta del catetere raggiunga l'arteria subclaviana sinistra.
- Inserire a una profondità di 10 cm dal luogo di inserimento.
- Iniettare 150 unità di eparina ad una concentrazione di 100 unità / mL nel catetere carotideo.
- Gonfiare il palloncino del catetere con 0,05 ml di soluzione salina.
- Contemporaneamente, scolare il sangue nel contenitore di sangue esterno dal cArteria arotica per regolare la pressione arteriosa prossimale a 80 mmHg.
- Collegare il sistema di monitoraggio della pressione arteriosa al residuo lumen del rubinetto di arresto a 3 vie e controllare la quantità di drenaggio del sangue con il monitoraggio della pressione arteriosa.
- Confermare il successo dell'occlusione aortica con una brusca diminuzione e perdita continua di pressione arteriosa distale.
- Dopo l'occlusione aortica di 9, 10 o 11 min, sgonfiare il palloncino del catetere Fogarty e reinfettare il sangue drenato.
6. Cura post-chirurgica e valutazione neurologica
- Durante il monitoraggio della pressione arteriosa attraverso l'arteria coda, rimuovere i cateteri dalle arterie femorali e carotide e chiudere le ferite con suture di seta.
- Dopo aver confermato che la pressione arteriosa è recuperata al raggio normale, rimuovere il catetere dall'arteria della coda e chiudere la ferita.
- Dopo il recupero dall'anestesia, riportare il ratto nella sua gabbia.
- Valuta hiLa funzionalità del motore degli arti a 24 ore dopo la chirurgia usando l'indice di deficit motorio ( Tabella 1 ). L'indice del deficit motore è definito come la somma del punteggio di ambulation e del punteggio di posizionamento / passo. Un indice di disavanzo motore di 6 indica il disavanzo massimo.
7. Valutazione istopatologica
- Dopo la valutazione neurologica, anestetizzano i ratti con isoflurano somministrato a maschera, li sacrificano per perfusione transcartica con 100 ml di salina eparinizzata sotto anestesia e estraggono il midollo spinale. 8
- Incorporare le sezioni del cavo dal livello delle vertebre lombari 3-5 in paraffina.
- Separare le sezioni trasversali con ematoxilina ed eosina (H & E).
- Osservare la lesione neuronale del motore sotto un microscopio. 9
8. Analisi statistica
- Eseguire l'analisi statistica usando il pacchetto statistico per la versione delle scienze sociali 20. Il motore defL'indice di icit dei tre gruppi è stato confrontato utilizzando il test di Kruskal-Wallis, seguito da un test Mann-Whitney U. Un valore P <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Representative Results
Durante un periodo di ischemia del midollo spinale, l'occlusione aortica è stata eseguita per 9 minuti (n = 3), 10 min (n = 3) o 11 min (n = 3). L'indice di deficit motorio nei ratti è riportato nella tabella 2. I ratti che hanno subito 9 minuti di occlusione aortica hanno mostrato una lieve e reversibile malfunzionamento del motore nell'arto posteriore. I ratti sottoposti a 10 minuti di occlusione aortica presentano un deficit motorio moderato, ma non una completa paralisi. I ratti che hanno subito 11 minuti di occlusione hanno mostrato una paralisi completa e persistente.
Le foto rappresentative delle sezioni del midollo spinale colorate con H & E sono mostrate in Figura 1 . I neuroni motori nelle sezioni del midollo spinale erano più conservati nei ratti sottoposti ad una durata più breve di occlusione aortica.
Figura 1 . Esame istologicoDelle sezioni del midollo spinale
I neuroni motori erano più conservati nei ratti sottoposti ad una durata più breve di occlusione aortica (ingrandimento originale, 200X). Barra di scala in tutte le immagini = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Ambulazione (camminare con le estremità inferiori) | Posizionamento / passo riflesso |
| 0: normale (ambulation simmetrica e coordinata) | 0: normale |
| 1: le zampe piatte sotto il corpo quando camminano, ma presentano atassia | 1: debole |
| 2: camminare a cavallo | 2: nessun passo |
| 3: movimento nelle estremità inferiori, ma incapace di cavalcare | |
| 4: nessun movimento, trascina le estremità inferiori |
Tabella 1. Valutazione dell'ambulanza e del posizionamento / passo riflesso.
| Tempo di occlusione aortica | 24 h dopo l'intervento chirurgico |
| 9 min (n = 3) | 2 (2 - 3) |
| 10 min (n = 3) | 4 (4 - 4) |
| 11 min (n = 3) | 5 (5 - 6) |
Tabella 2. Indice di deficit di motore. I valori sono presentati come media (interquartile range).
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Discussion
Nello studio in corso, abbiamo dimostrato un modello di ratti di ischemia del midollo spinale basato sul metodo di Taira e Marsala 5 che induce variabili di deficit motorio nell'arto posteriore a seconda del tempo di occlusione aortica.
La lunghezza dell'occlusione aortica può influire sul grado di deficit motorio. Se il tempo di occlusione aortica è più lungo, il deficit motorio diventa più grave. Quindi i ricercatori possono raggiungere un certo grado di deficit motorio controllando il tempo di occlusione aortica in questo modello.
Il nostro modello coinvolge la legatura della comune arteria carotidea e dell'arteria femorale e la possibilità di deficit neurologici derivanti dalla legatura di queste arterie è una preoccupazione potenziale. Tuttavia, i ratti hanno sistemi di rete collaterali efficienti. Così, quando l'arteria carotidea o l'arteria femorale è legata, flusso di sangue sufficiente può essere fornito dalla vasta rete collaterale. Carot unilaterale L'arresto dell'arteria d è riportato che produce solo effetti secondari sul flusso sanguigno cerebrale. 10 , 11 Anche se l'occlusione dell'arteria carotide unilaterale può produrre ictus nei ratti, questo avviene solo quando in combinazione con grave ipossia sistemica. 12 Durante il nostro esperimento, non si è verificato l'ipossia sistemica e nessuno dei ratti presentato con deficit neurologici suggestivi di infarto cerebrale. Inoltre, quando l'arteria femorale dei ratti è legata, la circolazione collaterale fornisce un sufficiente flusso di sangue ai muscoli dell'arto posteriore. 13 Questa circolazione collaterale fornisce sufficiente flusso di sangue ai muscoli degli arti posteriori quando sono a riposo, ma non fornisce sufficiente flusso durante l'esercizio. 14
Inoltre, la pressione arteriosa prossimale durante l'ischemia del midollo spinale influenza lo sviluppo di deficit motori. Secondo uno studio precedente,Rif "> 5 la fornitura di sangue collaterale è quasi scomparsa alla pressione arteriosa prossimale di 40 mmHg durante il bloccaggio aortico in un modello di ischemia spinale del ratto. Quindi, gli studi successivi hanno mantenuto la pressione arteriosa prossimale a 40 mmHg durante l'ischemia del midollo spinale nei loro modelli di spinale ratto cavo ischemia. 9, 15, 16 Tuttavia, in questo protocollo, abbiamo mantenuto la pressione arteriosa prossimale a 80 mmHg in occlusione aortica perché si raccomanda di mantenere la pressione arteriosa media a 80 mmHg o superiore per la conservazione adeguata perfusione midollo spinale durante midollo spinale Ischemia nella pratica clinica, 17 anche se potrebbe esserci una differenza in ciò che costituisce un'adeguata pressione arteriosa prossima tra umani e roditori.
La vasculatura del midollo spinale e il sistema collaterale dei ratti e degli esseri umani sono simili, 6 , 7 che rende i topi una scelta appropriata per un modello di ischemia sperimentale del midollo spinale. Tuttavia, non dovrebbe essere scontato che i risultati possono essere diversi in base alla specie in cui si verifica l'ischemia del midollo spinale.
In conclusione, i ricercatori possono facilmente adottare questo modello di ratti di ischemia del midollo spinale e ottenere risultati altamente riproducibili. Inoltre, possono modificare il tempo di occlusione aortico per variare il grado di deficit motorio prodotto. Come tale, questo modello può facilitare ulteriori studi che esaminano la fisiopatologia sottostante delle complicanze neurologiche a seguito dell'aneurisma aortico toracoabdominale e permettono lo sviluppo di strategie neuroprotettive contro queste complicanze.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 2012R1A1A3014010 della Fondazione Nazionale di Ricerca del governo coreano.
Acknowledgments
Gli autori non hanno alcun riconoscimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fogarty Arterial Embolectomy catheter | Edward Life Sciences | 120602F | a balloon-tipped catheter inserted into the femoral artery |
| BD Insyte-N Autoguard Shielded IV catheter | BD | 381411 | 24-gauge intravenous catheter |
| 50 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 50mL | Facial mask |
| 1 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 1ml | |
| Recal probe | HARVARD APPARATUS | 50-7221F | Rectal probe for temperature monitoring |
| Micro dissecting spring scissor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-10 | Micro-scissor |
| SCISSOR (SHARP-SHARP) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-51-12-S | Scissors |
| Retractor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-74A | Retractor |
| Micro forcep | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-29 | Micro-forceps |
| MOSQUITO FORCEP (Curved) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-44-CPK | Curved forceps |
| DRESSING FORCEP | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-37-16S | Blunted forceps |
| 4/0 black silk | Woori Medical | S431 | 4.0 black silk suture |
| 3-WAY STOCK | Seonwon Medcal | D-98-01 | 3-way stopcock |
| Patient monitor | PHILIPS | MP20 | The arterial pressure monitoring device. |
| Heating blanket | Self production | Heating blanket | |
| Microtube and external reservoir | Self production | Microtube and external reservoir | |
| Heparin | JW Pharmaceutical | Heparin | |
| 0.9% NS 1000ml | JW Pharmaceutical | Normal saline | |
| Isoflurane | Hana Med | Isoflurane |
References
- Greenberg, R. K., et al. Contemporary analysis of descending thoracic and thoracoabdominal aneurysm repair: a comparison of endovascular and open techniques. Circulation. 118 (8), 808-817 (2008).
- Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 59 (2), 79-90 (2011).
- Fleck, T. M., et al. Improved outcome in thoracoabdominal aortic aneurysm repair: the role of cerebrospinal fluid drainage. Neurocrit Care. 2 (1), 11-16 (2005).
- Kouchoukos, N. T., et al. Hypothermic bypass and circulatory arrest for operations on the descending thoracic and thoracoabdominal aorta. Ann Thorac Surg. 60 (1), 67-76 (1995).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Tveten, L. Spinal cord vascularity. III. The spinal cord arteries in man. Acta Radiol Diagn (Stockh). 17 (3), 257-273 (1976).
- Woollam, D. H., Millen, J. W. The arterial supply of the spinal cord and its significance. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 18 (2), 97-102 (1955).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Umehara, S., Goyagi, T., Nishikawa, T., Tobe, Y., Masaki, Y. Esmolol and landiolol, selective β1 adrenoreceptor antagonists, provide neuroprotection against spinal cord ischemia and reperfusion in rats. Anesth Analg. 110 (4), 1133-1137 (2010).
- De Ley, G., Nshimyumuremyi, J. B., Leusen, I. Hemispheric blood flow in the rat after unilateral common carotid occlusion: evolution with time. Stroke. 16 (1), 69-73 (1985).
- Coyle, P., Panzenbeck, M. J. Collateral development after carotid artery occlusion in Fischer 344 rats. Stroke. 21 (2), 316-321 (1990).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am J Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Prior, B. M., et al. Time course of changes in collateral blood flow and isolated vessel size and gene expression after femoral artery occlusion in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2434-H2447 (2004).
- Yang, H. T., Feng, Y., Allen, L. A., Protter, A., Terjung, R. L. Efficacy and specificity of bFGFincreased collateral flow in experimental peripheral arterial insufficiency. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (6), H1966-H1973 (2000).
- Kakinohana, M., Fuchigami, T., Nakamura, S., Sasara, T., Kawabata, T., Sugahara, K. Intrathecal administration of morphine, but not small dose, induced spastic paraparesis after a noninjurious interval of aortic occlusion in rats. Anesth Analg. 96 (3), 769-775 (2003).
- Horiuchi, T., et al. The effects of the delta-opioid agonist SNC80 on hind-limb motor function and neuronal injury after spinal cord ischemia in rats. Anesth Analg. 99 (1), 235-240 (2004).
- Griepp, R. B., Griepp, E. B. Spinal cord perfusion and protection during descending thoracic and thoracoabdominal aortic surgery: the collateral network concept. Ann Thorac Surg. 83 (2), S865-S869 (2007).
