Summary
Denne undersøgelse viser teknikken til at lave en minimalt invasiv og let reproducerbar model af rygmarvs-iskæmi hos rotter. Forskellige grader af baklidsmotorunderskud kan produceres ved at kontrollere aortaeklusionstiden.
Abstract
Rygmarvs-iskæmi er en dødelig komplikation efter thoracoabdominal aorta aneurysm kirurgi. Forskere kan undersøge strategierne til forebyggelse og behandling af denne komplikation ved hjælp af eksperimentelle modeller af rygmarvs-iskæmi. Den her beskrevne model demonstrerer varierende grader af paraplegi, der vedrører længden af okklusion efter thorax aortaeklusion i en rotte rygmarvs-iskæmimodel.
En 2-Fr. Ballon-tippede kateter blev fremført gennem lårbenet i den nedadgående thoracale aorta, indtil kateterspidsen blev anbragt til venstre subklavierarterien i bedøvede Sprague-Dawley-hanrotter. Ryggmidlets iskæmi blev induceret ved at opblæste kateterballonen. Efter en bestemt okklusionsperiode (9, 10 eller 11 minutter) blev ballonen deflateret. Neurologisk vurdering blev udført ved anvendelse af motorunderskud indekset 24 timer efter operationen, og rygmarven blev høstet til histopatologisk undersøgelse.
Rotter, der gennemgik 9 min aortaeklusion, viste mild og reversibel motorisk svækkelse i bagbenet. Rotter udsat for 10 min aortisk okklusion præsenteret med moderat, men reversibel motorisk svækkelse. Rotter udsat for 11 min aortaeklusion viste fuldstændige og vedholdende Lammelsen. Motorneuronerne i rygmarvsektionerne blev mere konserverede hos rotter udsat for kortere varighed af aortaeklusion.Forskere kan opnå et reproducerbart baklidsmotorunderskud efter thorax aortaeklusion med denne rygmarvs-iskæmimodel.
Introduction
Paraplegi er en dødelig komplikation af thoracoabdominal aorta aneurysm kirurgi. Det skyldes rygmarvs-iskæmie-reperfusionsskade, der opstår under kryds-klemning og afklemning af aorta. 1 Flere strategier, herunder systemisk hypotermi og cerebrospinal dræning, er blevet indført for at beskytte rygmarven, 2 , 3 , 4, men mange patienter forbliver påvirket af skaden.
Flere animalske rygmarvs-iskæmimodeller er blevet introduceret for at undersøge dets patogenese og udforme beskyttelsesstrategier mod skaden. I den nuværende undersøgelse skitserer vi en rottemodel af rygmarvs-iskæmi baseret på Taira og Marsalas metode. 5 Spinalcirkulationssystemet i rotter ligner meget på rygmarvets vaskulære og sikkerhedsstillelse hos mennesker, selv om der er nogle forskelle i størrelse ogbeliggenhed. 6 , 7 Således er en rotte et anatomisk egnet dyr til at udnytte til en forsøgsmodel, der undersøger patogenese, komplikationer og behandling af rygmarvs-iskæmi. Desuden frembringer denne rygmarvs-iskæmimodel pålidelig aortaeklusion med minimal indgriben ved anvendelse af en intravaskulær balloneklusion af thorax aorta.
I denne undersøgelse viste vi, at denne rotte-model af rygmarvs-iskæmi inducerer reproducerbare motoriske underskud i baglederne, der varierer i sværhedsgrad afhængigt af aortaeklusionstiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol blev godkendt af den institutionelle dyrepleje og brugskomité i Seoul National University Bundang Hospital. Dyrpleje og forsøg blev udført i henhold til De Forenede Nationers National Institutes of Health Guide til pleje og brug af laboratoriedyr.
1. Kirurgisk Forberedelse
- Før kirurgi skylles katetrene med sterilt saltvand for at sikre patency.
- Sæt et opvarmningstæppe på betjeningsbordet, og dækk bordet med en steril drapering.
- Placer Male Sprague-Dawley-rotter (270-330 g) i en acrylkasse med 3,0% -4,0% isofluran i 100% oxygen.
- Påfør smøremiddel på rotterens øjne.
- Placer rotten på betjeningsbordet i ryglinjen og oprethold anæstesi ved hjælp af en ansigtsmaske med kontinuerlig administration af inhaleret isofluran (1,0% -2,5 vol.%).
- Placer en rektal probe til overvågning og vedligeholdelse af kropstemperaturen mellem 37,0-38,0 ° C.
2. Femoral Arteriekateterisering
- Skrub det højre injektionsområde forsigtigt med Betadine og 70% ethanol.
- Lav et 2 cm vandret hudindsnit med saks på højre injektionsområde.
- Brug en retraktor, udsæt det kirurgiske felt.
- Dissect femoral artery fra den omgivende vene og nerve. Isolér en 1 cm sektion af arterien ved hjælp af buede pincet og tunge tang.
- Ved hjælp af en 4,0 sorte silke sutur placeres et løst slips på både proksimale og distale ender af arterien for at maksimere eksponeringen.
- Lav et snit på lårbenet ved hjælp af mikrosaks.
- Indsæt en 2-Fr. Ballon-tippet kateter ind i lårbenet arterien ved hjælp af mikro-tang. Sikre kateteret til karret ca. 1 cm fra kateterhovedet med den proximale ligatur og binde den distale ligatur.
3. Carotidartisk kateterisering
- Skrub den højre forreste hals ved hjælp af betadIne og 70% ethanol, og lav derefter et hudindsnit.
- Brug en retraktor, udsæt det kirurgiske felt. Isolér en 1 cm sektion af arterien, og bind det løst ved hjælp af en silke sutur på både proksimale og distale ender af arterien for at maksimere eksponeringen.
- Punkter carotidarterien ved hjælp af et 24 G intravenøst kateter, og før den proximale 1 cm af kateteret mod hjertet.
- Sikre kateteret med den proximale ligatur og binde den distale ligatur.
- Brug en 3-vejs stopdåse til at forbinde kateterets distale ende til det saltvandfyldte mikrorør og det eksterne reservoir.
4. Tail Artery Catheterization
- Skrub det ventrale område af halen ved hjælp af betadin og 70% ethanol, og lav et 2 cm hudindsnit.
- Dissect hale arterien fra de omgivende strukturer og isolere en 1 cm sektion af arterien ved hjælp af buede pincet og stump tænger.
- Brug en 4,0 sorte silke sutur, læg en løsBinde på både de proximale og distale ender af arterien for at maksimere eksponeringen.
- Punktere hale arterien ved hjælp af et 24 G intravenøst kateter, og før kateteret ind i arterien.
- Sikre kateteret til karret (ca. 1 cm fra kateterhovedet) med den proximale ligatur og binde den distale ligatur.
- Tilslut kateterets distale del til overvågningsapparatet til arterielt tryk.
5. Induktion af rygmarvs-iskæmi
- Efter kateterisering er færdig, fortsæt 2 Fr. Ballon-tippet kateter ind i den nedadgående thoracale aorta, så kateterets spids når den venstre subklave arterie.
- Indsæt i en dybde på 10 cm fra indsættelsesstedet.
- Injicer 150 enheder heparin i en koncentration på 100 enheder / ml i karotidkatetret.
- Inflater kateterballonen med 0,05 ml saltopløsning.
- Træk samtidig blodet i den ydre blodbeholder fra cArotidarterie for at regulere det proksimale arterieltryk til 80 mmHg.
- Forbind det arterielle trykovervågningssystem til den resterende lumen i 3-vejs stophanen, og kontroller mængden af bloddræning ved overvågning af arterielt tryk.
- Bekræft succesen af aortaeklusion med en abrupt reduktion og kontinuerligt tab af distalt arterielt tryk.
- Efter aortaeklusion af 9, 10 eller 11 minutter skal Deflate Fogarty-kateterballonen og genfylde det dræne blod.
6. Postkirurgisk pleje og neurologisk vurdering
- Under overvågning af arterielt tryk gennem hale arterien, fjern katetrene fra lårbenet og karotidarterierne og luk sårene med silke suturer.
- Efter at have bekræftet, at arterielt tryk genvindes til det normale område, skal kateteret fjernes fra halearterien og lukke såret.
- Efter tilbagesøgning fra anæstesien, returner rotten til sit bur.
- Vurdere hejNd limmotorfunktion efter 24 timer efter kirurgi ved brug af motorunderskudsindekset ( tabel 1 ). Motorunderskudsindekset er defineret som summen af ambulationsscoren og placerings- / trinrefleksresultatet. Et motorunderskudsindeks på 6 angiver det maksimale underskud.
7. Histopatologisk vurdering
- Efter den neurologiske vurdering bedøves rotter med maskeafleveret isofluran, ofre dem ved transkardial perfusion med 100 ml hepariniseret saltvand under anæstesi og ekstraher rygmarven. 8
- Sæt ledningssektionerne ind fra lændehvirvelen 3-5 i paraffin.
- Farve tværsnit med hæmatoxylin og eosin (H & E).
- Overhold motoren neuron skade under et mikroskop. 9
8. Statistisk analyse
- Udfør statistisk analyse ved hjælp af statistisk pakke til Social Sciences version 20. Motoren defIcit-indeks for de tre grupper blev sammenlignet under anvendelse af Kruskal-Wallis-testen, efterfulgt af en Mann-Whitney U- test. En P- værdi <0,05 blev betragtet statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under en periode med rygmarvs-iskæmi blev aortisk okklusion udført i 9 minutter (n = 3), 10 min (n = 3) eller 11 min (n = 3). Motorunderskuddet i rotter er vist i tabel 2. Rotter, der gennemgik 9 min aortaeklusion, viste en mild og reversibel motorisk svækkelse i bagbenet. Rotter udsat for 10 min aortaeklusion med moderat motorunderskud, men ikke fuldstændig lammelse. Rotter, der gennemgik 11 min okklusionstid viste fuldstændig og vedvarende lammelse.
Repræsentative fotografier af rygmarvsektioner farvet med H & E er vist i figur 1 . Motorneuronerne i rygmarvsektionerne blev mere konserverede hos rotter underkastet en kortere varighed af aortaeklusion.
Figur 1 . Histologisk eksamenInation af rygmarvsektioner
Motorneuronerne blev mere bevaret hos rotter underkastet en kortere varighed af aortaeklusion (original forstørrelse, 200X). Skalbjælke i alle billeder = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Ambulation (walking med nedre ekstremiteter) | Placering / trinrefleks |
| 0: normal (symmetrisk og koordineret ambulation) | 0: normal |
| 1: tæer flad under kroppen, når man går, men ataxi er til stede | 1: svag |
| 2: Knogle-walking | 2: ingen stepping |
| 3: bevægelse i nedre ekstremiteter, men ikke i stand til at gå i gang | |
| 4: Ingen bevægelse, trækker nedre ekstremiteter |
Tabel 1. Evaluering af Ambulation og Placing / Stepping Reflex.
| Aortisk okklusionstid | 24 timer efter operationen |
| 9 min (n = 3) | 2 (2 - 3) |
| 10 min (n = 3) | 4 (4 - 4) |
| 11 min (n = 3) | 5 (5 - 6) |
Tabel 2. Motorunderskudsindeks. Værdierne præsenteres som median (interkvartile rækkevidde).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den aktuelle undersøgelse demonstrerede vi en rottemodel af rygmarvs-iskæmi baseret på Taira og Marsala's metode 5, der inducerer variable grader af motorunderskud i bagbenet afhængigt af aortisk okklusionstid.
Længden af aortaeklusion kan påvirke graden af motorunderskud. Hvis aortaeklusionstiden er længere, bliver motorunderskuddet mere alvorligt. Således kan forskere opnå en vis grad af motorunderskud ved at kontrollere aortaeklusionstiden i denne model.
Vores model involverer ligering af den fælles carotidarterie og lårarterien, og muligheden for neurologiske underskud som følge af ligering af disse arterier er et potentielt problem. Imidlertid har rotter effektive sikkerhedsnetværkssystemer. Således, når carotidarterien eller lårarterien er ligeret, kan tilstrækkelig blodgennemstrømning tilvejebringes af det omfattende sikkerhedsnet. Unilateral caroti D artery okklusion er rapporteret at producere kun mindre virkninger på cerebral blodgennemstrømning. 10 , 11 Selvom unilateral carotidarterieeklusion kan producere slagtilfælde hos rotter, sker dette kun i kombination med alvorlig systemisk hypoxi. 12 Under vores forsøg forekom der ingen systemisk hypoxi, og ingen af rotterne blev præsenteret med neurologiske underskud, der tyder på cerebralt infarkt. Endvidere tilvejebringer sikringscirkulationen tilstrækkelig blodgennemstrømning til baglemmusklerne, når lårbenet er roteret. 13 Denne sikkerhedscirkulation giver tilstrækkelig blodgennemstrømning til baglemmusklerne, når de er i ro, men giver ikke tilstrækkelig strøm under træning. 14
Desuden påvirker det proksimale arterielt tryk under rygmarvs-iskæmi udviklingen af motorunderskud. Ifølge en tidligere undersøgelse,Ref "> 5 forsyningssikkerheden blodtilførslen forsvandt næsten ved det proximale arterielle tryk på 40 mmHg under aortisk klemning i en rotte-spinal iskæmiemodel. Således opretholdt efterfølgende undersøgelser det proksimale arterieltryk ved 40 mmHg under rygmarvs-iskæmi i deres modeller af rotterespinal 9 , 15 , 16. I denne protokol fastholdt vi imidlertid det proksimale arterieltryk ved 80 mmHg under aortisk okklusion, fordi det anbefales at opretholde det gennemsnitlige arterielle tryk ved 80 mmHg eller derover for at bevare tilstrækkelig rygmarvsperfusion under rygmarven Iskæmi i den kliniske praksis, 17 selvom der kan være forskel på, hvad der udgør et passende proksimalt arterielt tryk mellem mennesker og gnavere.
Ryggmargenens vaskulatur og sikkerhedssystem af rotter og mennesker er ens, 6 , 7, der gør rotter til et passende valg til en eksperimentel rygmarvs-iskæmimodel. Det bør dog ikke diskonteres, at resultaterne kan være forskellige i henhold til arten, hvor rygmarvs-iskæmi opstår.
Afslutningsvis kan forskere let vedtage denne rotte-model af rygmarvs-iskæmi og opnå høj reproducerbare fund. Desuden kan de ændre aortaeklusionstiden for at variere graden af produceret motorunderskud. Som sådan kan denne model lette yderligere undersøgelser, der undersøger den underliggende patofysiologi af neurologiske komplikationer efter thoracoabdominal aorta-aneurisme og tillader udvikling af neuroprotektive strategier mod disse komplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser. Dette arbejde blev støttet af bevilling 2012R1A1A3014010 fra National Research Foundation of Korean Government.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen anerkendelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fogarty Arterial Embolectomy catheter | Edward Life Sciences | 120602F | a balloon-tipped catheter inserted into the femoral artery |
| BD Insyte-N Autoguard Shielded IV catheter | BD | 381411 | 24-gauge intravenous catheter |
| 50 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 50mL | Facial mask |
| 1 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 1ml | |
| Recal probe | HARVARD APPARATUS | 50-7221F | Rectal probe for temperature monitoring |
| Micro dissecting spring scissor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-10 | Micro-scissor |
| SCISSOR (SHARP-SHARP) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-51-12-S | Scissors |
| Retractor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-74A | Retractor |
| Micro forcep | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-29 | Micro-forceps |
| MOSQUITO FORCEP (Curved) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-44-CPK | Curved forceps |
| DRESSING FORCEP | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-37-16S | Blunted forceps |
| 4/0 black silk | Woori Medical | S431 | 4.0 black silk suture |
| 3-WAY STOCK | Seonwon Medcal | D-98-01 | 3-way stopcock |
| Patient monitor | PHILIPS | MP20 | The arterial pressure monitoring device. |
| Heating blanket | Self production | Heating blanket | |
| Microtube and external reservoir | Self production | Microtube and external reservoir | |
| Heparin | JW Pharmaceutical | Heparin | |
| 0.9% NS 1000ml | JW Pharmaceutical | Normal saline | |
| Isoflurane | Hana Med | Isoflurane |
References
- Greenberg, R. K., et al. Contemporary analysis of descending thoracic and thoracoabdominal aneurysm repair: a comparison of endovascular and open techniques. Circulation. 118 (8), 808-817 (2008).
- Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 59 (2), 79-90 (2011).
- Fleck, T. M., et al. Improved outcome in thoracoabdominal aortic aneurysm repair: the role of cerebrospinal fluid drainage. Neurocrit Care. 2 (1), 11-16 (2005).
- Kouchoukos, N. T., et al. Hypothermic bypass and circulatory arrest for operations on the descending thoracic and thoracoabdominal aorta. Ann Thorac Surg. 60 (1), 67-76 (1995).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Tveten, L. Spinal cord vascularity. III. The spinal cord arteries in man. Acta Radiol Diagn (Stockh). 17 (3), 257-273 (1976).
- Woollam, D. H., Millen, J. W. The arterial supply of the spinal cord and its significance. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 18 (2), 97-102 (1955).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Umehara, S., Goyagi, T., Nishikawa, T., Tobe, Y., Masaki, Y. Esmolol and landiolol, selective β1 adrenoreceptor antagonists, provide neuroprotection against spinal cord ischemia and reperfusion in rats. Anesth Analg. 110 (4), 1133-1137 (2010).
- De Ley, G., Nshimyumuremyi, J. B., Leusen, I. Hemispheric blood flow in the rat after unilateral common carotid occlusion: evolution with time. Stroke. 16 (1), 69-73 (1985).
- Coyle, P., Panzenbeck, M. J. Collateral development after carotid artery occlusion in Fischer 344 rats. Stroke. 21 (2), 316-321 (1990).
- Levine, S.
- Prior, B. M., et al. Time course of changes in collateral blood flow and isolated vessel size and gene expression after femoral artery occlusion in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2434-H2447 (2004).
- Yang, H. T., Feng, Y., Allen, L. A., Protter, A., Terjung, R. L. Efficacy and specificity of bFGFincreased collateral flow in experimental peripheral arterial insufficiency. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (6), H1966-H1973 (2000).
- Kakinohana, M., Fuchigami, T., Nakamura, S., Sasara, T., Kawabata, T., Sugahara, K. Intrathecal administration of morphine, but not small dose, induced spastic paraparesis after a noninjurious interval of aortic occlusion in rats. Anesth Analg. 96 (3), 769-775 (2003).
- Horiuchi, T., et al. The effects of the delta-opioid agonist SNC80 on hind-limb motor function and neuronal injury after spinal cord ischemia in rats. Anesth Analg. 99 (1), 235-240 (2004).
- Griepp, R. B., Griepp, E. B. Spinal cord perfusion and protection during descending thoracic and thoracoabdominal aortic surgery: the collateral network concept. Ann Thorac Surg. 83 (2), S865-S869 (2007).
