Summary
この研究は、ラットにおいて最小侵襲性で容易に再現可能な脊髄虚血モデルを作製する技術を実証している。大動脈閉塞時間を制御することにより、様々な程度の後肢運動欠損を生じさせることができる。
Abstract
脊髄虚血は、胸腔腹部大動脈瘤手術後の致命的な合併症である。研究者は、脊髄虚血の実験モデルを用いてこの合併症を予防および治療するための戦略を調査することができる。ここに記載されたモデルは、ラットの脊髄虚血モデルにおける胸部大動脈閉塞後の閉塞の長さに関連する様々な程度の対麻痺を示す。
2-Fr。バルーン先端カテーテルを、麻酔した雄Sprague-Dawleyラットの左鎖骨下動脈にカテーテル先端を配置するまで、大腿動脈を通して下行胸部大動脈に前進させた。カテーテルバルーンを膨張させることによって脊髄虚血を誘発した。一定の閉塞（9,10または11分）後、バルーンは収縮した。手術後24時間で運動異常を用いて神経学的評価を行い、病理組織学的検査のために脊髄を採取した。
10分の大動脈閉塞を受けたラットは、中程度ではあるが可逆的な運動障害を示した。大動脈閉塞の11分間に曝されたラットは、完全で持続的であった大動脈閉塞の期間がより短いラットにおいて、脊髄切片における運動ニューロンはより保存された。研究者は、この脊髄虚血モデルを用いて胸部大動脈閉塞後に再現性のある後肢運動障害を達成することができる。
Introduction
対麻痺は、胸腹部大動脈瘤手術の致命的な合併症である。これは、大動脈のクロスクランプおよびアンクランプ中に起こる脊髄虚血 - 再灌流損傷に起因する。怪我の影響を受けて全身低体温症と脳脊髄ドレナージ脊髄を保護するために導入されている、2、3、4しかし、多くの患者が残っているなど、1つのいくつかの戦略。
いくつかの動物の脊髄虚血モデルがその病因を調査し、損傷に対する防御戦略を考案するために導入されている。今回の研究では、平良とマルサラの方法に基づいた脊髄虚血のラットモデルを概説する。サイズに多少の違いはあるものの5ラットにおける脊髄循環システムは、ヒトでの脊髄の血管および担保システムに非常に類似しており、ロケーション。 図6、 図7はこのように、ラットは、病因、合併症、および脊髄虚血の治療を調査する実験モデルのために利用する解剖学的に適切な動物です。さらに、この脊髄虚血モデルは、胸部大動脈の血管内バルーン閉塞を利用することにより最小限の介入で確実な大動脈閉塞を生じる。
本研究では、この脊髄虚血ラットモデルが、大動脈閉塞時間に応じて重症度が異なる後肢における再現性運動障害を誘発することを実証した。
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Protocol
このプロトコールは、ソウル大学分立病院動物実験センターの承認を受けた。動物のケアおよび実験は、実験動物のケアおよび使用のための米国国立衛生研究所のガイドラインに従って行われた。
1.外科的準備
- 手術の前に、開存性を確実にするために滅菌生理食塩水でカテーテルを洗い流す。
- 手術用テーブルに暖房用毛布を置き、無菌ドレープでテーブルを覆う。
- 雄Sprague-Dawleyラット（270-330g）を、100％酸素中3.0％〜4.0％のイソフルランを含むアクリルボックスに入れる。
- ラットの目に潤滑剤を塗布する。
- ラットを仰臥位の手術台に置き、吸入イソフルラン（1.0％〜2.5容積％）を連続的に投与したフェイシャルマスクを用いて麻酔を維持する。
- 直腸プローブを配置し、体温を37.0〜38.0℃の間で監視および維持する。
2.大腿動脈カテーテル法
- 右の鼠径部をベタディンと70％エタノールを使って静かにこすります。
- 右鼠径部のはさみを使って、2cmの水平な皮膚切開を行います。
- 開創器を使用して、手術野を露出させる。
- 周囲の静脈および神経から大腿動脈を解剖する。湾曲した鉗子と鈍い鉗子を使用して、動脈の1cmの部分を分離する。
- 4.0黒い絹の縫合糸を使用して、暴露を最大にするために、動脈の近位端および遠位端の両方に緩い結び目を置く。
- 大腿動脈をマイクロはさみで切開する。
- 2-Frを挿入します。マイクロ鉗子を用いて大腿動脈内にバルーンチップカテーテルを挿入した。近位結紮でカテーテルヘッドから約1cmのところでカテーテルを血管に固定し、遠位結紮糸を結ぶ。
3.頚動脈カテーテル法
- betadを使用して右前頸部を擦るineと70％エタノールを入れ、皮膚切開を行います。
- 開創器を使用して、手術野を露出させる。動脈の1cmの部分を分離し、暴露を最大にするために、動脈の近位端および遠位端の両方に絹の縫合糸を用いて緩く結ぶ。
- 24 Gの静脈内カテーテルを用いて頸動脈を穿刺し、カテーテルの近位1cmを心臓に向けて前進させる。
- 近位結紮でカテーテルを固定し、遠位結紮糸を結ぶ。
- 三方活栓を使用して、カテーテルの遠位端を生理食塩水で満たされたマイクロチューブおよび外部リザーバーに接続する。
4.尾部動脈カテーテル法
- ベタディンと70％エタノールを使用して尾の腹側を擦り、2cmの皮膚切開を行います。
- 周囲の構造から尾動脈を解剖し、湾曲鉗子と鈍端鉗子を用いて動脈の1cm切片を分離する。
- 4.0黒の絹の縫合糸を使用して、緩く置く暴露を最大限にするために動脈の近位端および遠位端の両方を結ぶ。
- 24 Gの静脈内カテーテルを用いて尾動脈を突き刺し、カテーテルを動脈内に進める。
- 近位の結紮具でカテーテルを血管（カテーテルヘッドから約1cm）に固定し、遠位結紮糸を結ぶ。
- カテーテルの遠位部分を動脈圧監視装置に接続する。
5.脊髄虚血の誘導
- カテーテル挿入が完了したら、2 Fr.を進める。カテーテルの先端が左鎖骨下動脈に達するように、バルーンチップカテーテルを下降する胸部大動脈に挿入する。
- 挿入部位から10 cmの深さまで挿入します。
- 100ユニット/ mLの濃度の150単位のヘパリンを頸動脈カテーテルに注入する。
- 0.05mLの生理食塩水でカテーテルバルーンを膨らませる。
- 同時に、血液を外部血液コンテナにcから排出させる近位動脈圧を80mmHgに調節するための頚動脈動脈。
- 動脈圧モニタリングシステムを3方向ストップコックの残りの管腔に接続し、動脈圧を監視して排液量を制御する。
- 突然の減少と遠位動脈圧の連続的な損失によって、大動脈閉塞の成功を確認する。
- 9、10、または11分の大動脈閉塞の後、Fogartyカテーテルバルーンを収縮させ、排出された血液を再注入する。
6.手術後のケアおよび神経学的評価
- 尾動脈を通る動脈圧を監視しながら、大腿動脈および頸動脈からカテーテルを取り出し、絹の縫合糸で創傷を閉じる。
- 動脈圧が正常範囲に回復したことを確認した後、尾動脈からカテーテルを取り出し、創傷を閉じる。
- 麻酔から回復した後、ラットをケージに戻す。
- 評価する手術後24時間で運動不足指数を用いて肢体運動機能を評価した（ 表1 ）。運動不足指数は、歩行スコアと配置/歩行反射スコアの合計として定義される。 6のモーター赤字指数は最大赤字を示します。
7.組織病理学的評価
- 神経学的評価後、ラットをマスク送達イソフルランで麻酔し、麻酔下でヘパリン処理された生理食塩水100mLで心筋灌流によりそれらを屠殺し、脊髄を抽出する。 8
- パラフィンに腰椎3-5のレベルからコードセクションを埋め込みます。
- ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で横断切片を染色する。
- 顕微鏡下での運動ニューロン損傷を観察する。 9
8.統計分析
- Social Sciencesバージョン20の統計パッケージを使用して統計分析を実行します。モータdefKruskal-Wallis検定、続いてMann-Whitney U検定を用いて、3つの群の奏功指数を比較した。 0.05未満のP値は統計的に有意であると考えられた。
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Representative Results
脊髄虚血の期間中、大動脈閉塞を9分（n = 3）、10分（n = 3）、または11分（n = 3）行った。ラットにおける運動障害指数を表2に示す。大動脈閉塞を9分間受けたラットは、後肢に軽度の可逆性運動障害を示した。 10分間の大動脈閉塞を受けたラットは、中等度の運動障害を示したが、完全な麻痺はなかった。 11分の閉塞時間を経たラットは、完全で持続的な麻痺を示した。
H＆Eで染色された脊髄切片の代表的な写真を図1に示す。脊髄切片における運動ニューロンは、大動脈閉塞の期間がより短いラットにおいてより保存された。
図1 。組織学的検査脊髄節の発生
運動ニューロンは、より短い大動脈閉塞期間（元の倍率、200倍）を受けたラットにおいてより保存された。すべての画像のスケールバー=50μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| 歩行（下肢の歩行） | 配置/ステッピング反射 |
| 0：正常（対称および協調歩行） | 0：正常 |
| 1：ウォーキング時に身体の下に平らなつま先があるが、現在の運動失調 | 1：弱い |
| 2：ナックルウォーキング | 2：ステッピングなし |
| 3：下肢の動きはしゃれて歩くことができない | |
| 4：動きなし、下肢の引きずり |
表1.歩行と踏み台/足踏み反射の評価。
| 大動脈閉塞時間 | 手術24時間後 |
| 9分（n = 3） | 2（2-3） |
| 10分（n = 3） | 4（4-4） |
| 11分（n = 3） | 5（5-6） |
表2.モータ不足指数。値は中央値（四分位範囲）として示される。
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Discussion
今回の研究では、大動脈閉塞時間に依存して後肢に様々な程度の運動障害を誘発するTaira and Marsalaの方法5に基づく脊髄虚血のラットモデルを実証した。
大動脈閉塞の長さは、運動不足の程度に影響し得る。大動脈閉塞時間が長い場合、運動障害はより深刻になる。したがって、研究者は、このモデルで大動脈閉塞時間を制御することによって、ある程度の運動障害を達成することができる。
我々のモデルは、総頸動脈と大腿動脈の結紮を含み、これらの動脈の結紮に起因する神経学的欠損の可能性が潜在的な懸念事項である。しかしながら、ラットは効率的な副次的ネットワーク系を有する。かくして、頸動脈または大腿動脈が結紮されたときには、十分な血流が広範囲の副次的ネットワークによって提供され得る。片側性頚動脈 d動脈閉塞は、脳血流にわずかな影響しかもたらさないと報告されている。 10、11、片側頸動脈閉塞はラットでストロークを生成することができますが、これは深刻な全身低酸素との組み合わせでのみ発生します。 12は、我々の実験中、全身低酸素症は発生していませんし、ラットはいずれも脳梗塞を示唆する神経学的欠損を提示しません。さらに、ラットの大腿動脈を結紮すると、側副循環によって、後肢の筋肉に十分な血流が提供される。 13この担保循環は、彼らが静止している後肢の筋肉に十分な血流を提供していますが、運動中に十分な流れを提供していません。 14
さらに、脊髄虚血時の近位動脈圧は運動障害の発症に影響する。以前の研究によると、ラット脊髄虚血モデルにおける大動脈クランプ中に40mmHgの近位動脈圧で側副血供給がほとんど消失したため、脊髄虚血モデルにおいて近位動脈圧を40mmHgに維持した脊髄の間に十分な脊髄灌流を維持するために80 mmHgの以上で平均動脈圧を維持することが推奨されているため、コード虚血。9、15、16しかし、このプロトコルでは、我々は大動脈閉塞中に80 mmHgので近位動脈圧を維持しましたヒトとげっ歯類との間の適切な近位動脈圧を構成するものに違いがあるかもしれないが、臨床的練習では虚血である17 。
脊髄血管系およびラットおよびヒトの担保制度は、6類似しており、 7 。しかし、脊髄虚血が発生する種によって結果が異なる可能性があるので、割引してはならない。
結論として、研究者はこの脊髄虚血ラットモデルを容易に採用することができ、再現性の高い知見を得ることができる。さらに、大動脈閉塞時間を変更して、生成される運動能力不足の程度を変化させることができる。したがって、このモデルは、胸腹部大動脈瘤に続く神経合併症の根底にある病態生理学を調べ、これらの合併症に対する神経保護戦略の開発を可能にするさらなる研究を容易にすることができる。
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Disclosures
著者には競合する金銭的利益はない。この研究は、韓国政府の国立研究財団からの助成金2012R1A1A3014010によって支援された。
Acknowledgments
著者には謝辞はありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fogarty Arterial Embolectomy catheter | Edward Life Sciences | 120602F | a balloon-tipped catheter inserted into the femoral artery |
| BD Insyte-N Autoguard Shielded IV catheter | BD | 381411 | 24-gauge intravenous catheter |
| 50 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 50mL | Facial mask |
| 1 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 1ml | |
| Recal probe | HARVARD APPARATUS | 50-7221F | Rectal probe for temperature monitoring |
| Micro dissecting spring scissor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-10 | Micro-scissor |
| SCISSOR (SHARP-SHARP) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-51-12-S | Scissors |
| Retractor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-74A | Retractor |
| Micro forcep | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-29 | Micro-forceps |
| MOSQUITO FORCEP (Curved) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-44-CPK | Curved forceps |
| DRESSING FORCEP | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-37-16S | Blunted forceps |
| 4/0 black silk | Woori Medical | S431 | 4.0 black silk suture |
| 3-WAY STOCK | Seonwon Medcal | D-98-01 | 3-way stopcock |
| Patient monitor | PHILIPS | MP20 | The arterial pressure monitoring device. |
| Heating blanket | Self production | Heating blanket | |
| Microtube and external reservoir | Self production | Microtube and external reservoir | |
| Heparin | JW Pharmaceutical | Heparin | |
| 0.9% NS 1000ml | JW Pharmaceutical | Normal saline | |
| Isoflurane | Hana Med | Isoflurane |
References
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