Summary
Denne studien demonstrerer teknikken for å lage en minimalt invasiv og lett reproduserbar modell for ryggmargs-iskemi hos rotter. Ulike grader av baklidsmotor-underskudd kan produseres ved å kontrollere aorta-okklusjonstiden.
Abstract
Ryggmargen iskemi er en dødelig komplikasjon etter thoracoabdominal aorta aneurysm kirurgi. Forskere kan undersøke strategiene for å forebygge og behandle denne komplikasjonen ved hjelp av eksperimentelle modeller av ryggmargs iskemi. Modellen beskrevet her demonstrerer varierende grader av paraplegi som vedrører lengden av okklusjon etter thorax aorta okklusjon i en ryggmargen-iskemimodell.
En 2-Fr. Ballong-tipped kateter ble avansert gjennom femoral arterien inn i den nedadgående thoracale aorta inntil kateterspissen ble plassert på venstre subclavian arterie i bedøvede Sprague-Dawley-hanrotter. Ryggmargs-iskemi ble indusert ved oppblåsing av kateterballongen. Etter en bestemt okklusjonsperiode (9, 10 eller 11 minutter) ble ballongen deflatert. Neurologisk vurdering ble utført ved bruk av motorunderskuddsindeksen 24 timer etter operasjonen, og ryggmargen ble høstet for histopatologisk undersøkelse.
Rottene som ble gjennomgått 9 minutter med aorta okklusjon, viste mild og reversibel motorisk svekkelse i bakre lem. Råttene utsatt for 10 min aorta okklusjon presentert med moderat, men reversibel motorisk svekkelse. Rotter utsatt for 11 min aorta okklusjon viste fullstendig og vedvarende Lammelse. Motorneuronene i ryggseksjonene ble mer bevart hos rotter utsatt for kortere varighet av aortaeklusjon.Forskere kan oppnå et reproduserbart baklidsmotortap etter thorax aorta okklusjon ved hjelp av denne ryggmargs iskemimodellen.
Introduction
Paraplegi er en dødelig komplikasjon av thoracoabdominal aorta aneurysm kirurgi. Det skyldes ryggmargsekskemi-reperfusjonsskade som oppstår under kryss-klemming og unclamping av aorta. 1 Flere strategier, inkludert systemisk hypotermi og cerebrospinal drenering, er innført for å beskytte ryggmargen, 2 , 3 , 4, men mange pasienter forblir påvirket av skaden.
Flere ryggmargs-iskemimodeller har blitt introdusert for å undersøke sin patogenese og utarbeide beskyttende strategier mot skaden. I den nåværende studien skisserer vi en rottemodell av ryggmargs-iskemi basert på Taira og Marsalas metode. 5 Ryggsirkulasjonssystemet i rotter ligner veldig på ryggmargenens vaskulære og sikkerhetssystem hos mennesker, selv om det er noen forskjeller i størrelse ogplassering. 6 , 7 Således er en rotte et anatomisk egnet dyr å benytte til en eksperimentell modell som undersøker patogenesen, komplikasjonene og behandlingen av ryggmargs-iskemi. Videre produserer denne ryggmargs-iskemimodellen pålitelig aortisk okklusjon med minimal innblanding ved å benytte en intravaskulær ballong okklusjon av thorax aorta.
I denne studien demonstrerte vi at denne rottemodellen av ryggmargs-iskemi induserer reproducerbare motoriske underskudd i bakre lemmer som varierer i alvorlighetsgrad avhengig av aortisk okklusjonstid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble godkjent av Institutt for dyrepleie og bruk av Seoul National University Bundang Hospital. Dyrpleie og eksperimenter ble utført i henhold til United States National Institutes of Health Guide for pleie og bruk av laboratoriedyr.
1. Kirurgisk preparering
- Før kirurgi, skyll katetrene med steril saltløsning for å sikre patency.
- Sett et varmeteppe på operasjonstabellen, og dekk bordet med en steril drap.
- Plasser mannlige Sprague-Dawley-rotter (270-330 g) i en akrylboks med 3,0% -4,0% isofluran i 100% oksygen.
- Påfør smøremiddel til rotte øyne.
- Plasser rotte på operasjonstabellen i den bakre posisjonen, og oppretthold anestesi ved hjelp av ansiktsmaske med kontinuerlig administrasjon av inhalert isofluran (1,0% -2,5 vol%).
- Plasser en rektal sonde for å overvåke og opprettholde kroppstemperatur mellom 37,0-38,0 ° C.
2. Femoral arteriekateterisering
- Skru forsiktig på det høyre inngangsområdet med Betadine og 70% etanol.
- Lag et 2 cm horisontalt hudinnsnitt med saks på høyre inngangsområde.
- Bruk en retractor, avslør kirurgisk felt.
- Dissect femoral artery fra den omkringliggende venen og nerven. Isoler en 1 cm-seksjon av arterien ved hjelp av buede tang og stumpe tang.
- Ved hjelp av en 4,0 sorte silke sutur, legg en løs slips på både proksimal og distal ende av arterien for å maksimere eksponeringen.
- Gjør et snitt på lårbenet ved hjelp av mikrosaks.
- Sett inn en 2-Fr. Ballong-tipped kateter i femoral arterie ved hjelp av mikro-pincet. Fest kateteret til karet ca 1 cm fra kateterhodet med den proximale ligaturen, og bind deretter den distale ligaturen.
3. Carotid Artery Catheterization
- Skru av høyre forankring med betadIne og 70% etanol, og deretter lage et snitt på huden.
- Bruk en retractor, avslør kirurgisk felt. Isoler en 1 cm-seksjon av arterien, og bind den løst med en silkesutur på både proksimal og distal ende av arterien for å maksimere eksponeringen.
- Punktere halspulsåren ved hjelp av et 24 G intravenøst kateter, og forskyv den nærmeste 1 cm av kateteret mot hjertet.
- Sikre kateteret med den proksimale ligaturen, og bind deretter den distale ligaturen.
- Ved hjelp av en 3-veis stoppeklokke, koble den distale enden av kateteret til saltvannsfylt mikrorør og eksternt reservoar.
4. Tail Artery Catheterization
- Skru av den ventrale delen av halen ved hjelp av betadin og 70% etanol, og gjør et 2 cm hudinnsnitt.
- Dissect hale arterien fra de omkringliggende strukturer og isolere en 1 cm del av arterien ved hjelp av buede pincet og knuste pincet.
- Bruk en 4,0 sølv silke sutur, legg løsBinde på både proksimal og distal ende av arterien for å maksimere eksponeringen.
- Punktere hale arterien ved hjelp av et 24 G intravenøst kateter, og før kateteret inn i arterien.
- Fest kateteret til karet (ca. 1 cm fra kateterhodet) med den proximale ligaturen og bind den distale ligaturen.
- Koble den distale delen av kateteret til arteriell trykkovervåkingsanordningen.
5. Induksjon av ryggmargsekskemi
- Etter at kateterisering er fullført, fortsett 2 Fr. Ballong-tipped kateter inn i nedstigende thorax aorta slik at tuppen av kateteret når den venstre subklave arterien.
- Sett inn i en dybde på 10 cm fra innsatsstedet.
- Injiser 150 enheter heparin i en konsentrasjon på 100 enheter / ml inn i karoten kateteret.
- Oppblåst kateterballongen med 0,05 ml saltvann.
- Tøm samtidig blodet i den eksterne blodbeholderen fra cArotidarterie for å regulere det proksimale arterialtrykk til 80 mmHg.
- Koble arteriell trykkovervåkingssystem til gjenværende lumen i 3-veis stopphane, og kontroll mengden bloddrenering ved å overvåke arterietrykket.
- Bekreft suksessen til aorta okklusjon ved en abrupt reduksjon og kontinuerlig tap av distalt arterielt trykk.
- Etter aortisk okklusjon på 9, 10 eller 11 minutter, deflater Fogarty-kateterballongen og gjenfyller det drenerte blodet.
6. Postkirurgisk behandling og neurologisk vurdering
- Mens du overvåker arterietrykket gjennom hale arterien, fjern katetrene fra lårbenet og karoten arterier og lukk sårene med silke suturer.
- Etter å ha bekreftet at arterielt trykk gjenopprettes til det normale området, fjern kateteret fra hale arterien og lukk såret.
- Etter gjenoppretting fra bedøvelsen, returner rotten til buret.
- Vurdere heiNd limmotorfunksjon 24 timer etter kirurgi ved bruk av motorunderskuddsindeksen ( tabell 1 ). Motorunderskuddsindeksen er definert som summen av ambulasjonspoeng og plasserings- / trinnreflekspoeng. En motorunderskuddsindeks på 6 indikerer maksimalt underskudd.
7. Histopatologisk vurdering
- Etter den nevrologiske vurderingen bedøves rotter med maskeavlevert isofluran, ofre dem ved transkardiell perfusjon med 100 ml heparinisert saltløsning under anestesi, og ekstraher ryggraden. 8
- Legge i leddene fra lumbale vertebrae 3-5 i paraffin.
- Vekk tverrsnitt med hematoksylin og eosin (H & E).
- Følg motorneuronskaden under et mikroskop. 9
8. Statistisk analyse
- Utfør statistisk analyse ved hjelp av Statistisk pakke for samfunnsvitenskapens versjon 20. Motoren defIcit-indeksen for de tre gruppene ble sammenlignet ved bruk av Kruskal-Wallis-testen, etterfulgt av en Mann-Whitney U- test. En P- verdi <0,05 ble vurdert statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I løpet av en periode med ryggmargsekskemi ble aortisk okklusjon utført i 9 minutter (n = 3), 10 min (n = 3) eller 11 min (n = 3). Motorunderskuddsindeksen i rotter er presentert i tabell 2. Rotter som gjennomgikk 9 min aorta okklusjon viste en mild og reversibel motorisk svekkelse i bakbenet. Rotter utsatt for 10 min aorta okklusjon fremstilt med moderat motorisk underskudd, men ikke fullstendig lammelse. Rotter som gjennomgikk 11 min okklusjonstid viste fullstendig og vedvarende lammelse.
Representative fotografier av ryggmargseksjoner farget med H & E er vist i figur 1 . Motorneuronene i ryggseksjonene ble mer bevart hos rotter utsatt for kortere varighet av aortaeklusjon.
Figur 1 . Histologisk eksamenInasjon av ryggradsseksjoner
Motorneuronene ble mer bevaret hos rotter utsatt for kortere varighet av aortaeksluksjon (original forstørrelse, 200X). Målestang i alle bilder = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Ambulation (gå med nedre ekstremiteter) | Plassering / stepping refleks |
| 0: normal (symmetrisk og koordinert ambulasjon) | 0: normal |
| 1: tær flat under kroppen når du går, men ataksi tilstede | 1: svak |
| 2: Knock-walking | 2: ingen stepping |
| 3: Bevegelse i nedre ekstremiteter, men ikke i stand til å gå rundt | |
| 4: ingen bevegelse, drar nedre ekstremiteter |
Tabell 1. Evaluering av Ambulation og Placing / Stepping Reflex.
| Aortisk okklusjonstid | 24 timer etter operasjonen |
| 9 min (n = 3) | 2 (2 - 3) |
| 10 min (n = 3) | 4 (4 - 4) |
| 11 min (n = 3) | 5 (5 - 6) |
Tabell 2. Motorunderskuddsindeks. Verdiene presenteres som median (interkvartile rekkevidde).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den nåværende studien demonstrerte vi en rottemodell av ryggmargs-iskemi basert på Taira og Marsalas metode 5 som induserer variable grader av motorisk underskudd i bakre lem avhengig av aorta-okklusjonstiden.
Lengden på aortisk okklusjon kan påvirke graden av motorunderskudd. Hvis aorta-okklusjonstiden er lengre, blir motorunderskuddet alvorligere. Dermed kan forskere oppnå en viss grad av motorisk underskudd ved å kontrollere aorta okklusjonstid i denne modellen.
Vår modell innebærer ligering av den felles carotidarterien og lårarterien, og muligheten for nevrologiske underskudd som følge av ligering av disse arteriene er en potensiell bekymring. Imidlertid har rotter effektive sikkerhetsnettverkssystemer. Således, når karoten arterien eller femorale arterien er ligert, kan tilstrekkelig blodstrøm forsynes av det omfattende sikkerhetsnettverket. Unilateral caroti D artery okklusjon er rapportert å produsere bare mindre effekter på cerebral blodstrøm. 10 , 11 Selv om unilateral carotid arterie okklusjon kan produsere slag hos rotter, oppstår dette bare i kombinasjon med alvorlig systemisk hypoksi. 12 Under vårt eksperiment oppsto ingen systemisk hypoksi, og ingen av rotterne ble presentert med nevrologiske underskudd som tyder på hjerneinfarkt. Videre, når den femorale arterien av rotter er ligert, gir sikkerhetssirkulasjonen tilstrekkelig blodstrøm til baklidsmusklene. 13 Denne sikkerhetssirkulasjonen gir tilstrekkelig blodstrøm til baklemmemuskulaturen når de er i ro, men gir ikke tilstrekkelig strøm under treningen. 14
Videre påvirker det proksimale arterialtrykket under ryggmargsekskemi utviklingen av motordefekter. Ifølge en tidligere studie,Ref "> 5 ble blodtilførselen av sikkerheten forsvunnet nesten ved det proksimale arterialtrykket på 40 mmHg under aortisk klemming i en rotte-spinalisksimodell. Følgelig opprettholdte etterfølgende studier det proximale arterieltrykk ved 40 mmHg under ryggmargs-iskemi i deres modeller av rotterespinal 9 , 15 , 16. I denne protokollen opprettholdes imidlertid det proksimale arterialtrykk ved 80 mmHg under aortisk okklusjon fordi det anbefales å opprettholde det gjennomsnittlige arterialtrykk ved 80 mmHg eller større for å bevare tilstrekkelig ryggmargenperfusjon under ryggmargen Iskemi i klinisk praksis, 17 selv om det kan være en forskjell i hva som utgjør et tilstrekkelig proksimal arterielt trykk mellom mennesker og gnagere.
Ryggmargenens vaskulatur og sikkerhetssystem for rotter og mennesker er like, 6 , 7 som gjør rotter til et passende valg for en eksperimentell ryggmargsisksimodell. Det bør imidlertid ikke utelukkes at resultatene kan være forskjellige i henhold til arten der ryggmargsekskemi oppstår.
Som konklusjon kan forskere enkelt adoptere denne rottemodellen av ryggmargsekskemi og oppnå høyt reproducerbare funn. Videre kan de endre aorta-okklusjonstiden for å variere graden av motorbortfall som produseres. Som sådan kan denne modellen legge til rette for videre studier som undersøker den underliggende patofysiologien av nevrologiske komplikasjoner etter thoracoabdominal aorta-aneurisme, og tillater utvikling av nevrobeskyttende strategier mot disse komplikasjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser. Dette arbeidet ble støttet av bevilgning 2012R1A1A3014010 fra National Research Foundation of Korean Government.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekreftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fogarty Arterial Embolectomy catheter | Edward Life Sciences | 120602F | a balloon-tipped catheter inserted into the femoral artery |
| BD Insyte-N Autoguard Shielded IV catheter | BD | 381411 | 24-gauge intravenous catheter |
| 50 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 50mL | Facial mask |
| 1 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 1ml | |
| Recal probe | HARVARD APPARATUS | 50-7221F | Rectal probe for temperature monitoring |
| Micro dissecting spring scissor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-10 | Micro-scissor |
| SCISSOR (SHARP-SHARP) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-51-12-S | Scissors |
| Retractor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-74A | Retractor |
| Micro forcep | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-29 | Micro-forceps |
| MOSQUITO FORCEP (Curved) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-44-CPK | Curved forceps |
| DRESSING FORCEP | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-37-16S | Blunted forceps |
| 4/0 black silk | Woori Medical | S431 | 4.0 black silk suture |
| 3-WAY STOCK | Seonwon Medcal | D-98-01 | 3-way stopcock |
| Patient monitor | PHILIPS | MP20 | The arterial pressure monitoring device. |
| Heating blanket | Self production | Heating blanket | |
| Microtube and external reservoir | Self production | Microtube and external reservoir | |
| Heparin | JW Pharmaceutical | Heparin | |
| 0.9% NS 1000ml | JW Pharmaceutical | Normal saline | |
| Isoflurane | Hana Med | Isoflurane |
References
- Greenberg, R. K., et al. Contemporary analysis of descending thoracic and thoracoabdominal aneurysm repair: a comparison of endovascular and open techniques. Circulation. 118 (8), 808-817 (2008).
- Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 59 (2), 79-90 (2011).
- Fleck, T. M., et al. Improved outcome in thoracoabdominal aortic aneurysm repair: the role of cerebrospinal fluid drainage. Neurocrit Care. 2 (1), 11-16 (2005).
- Kouchoukos, N. T., et al. Hypothermic bypass and circulatory arrest for operations on the descending thoracic and thoracoabdominal aorta. Ann Thorac Surg. 60 (1), 67-76 (1995).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Tveten, L. Spinal cord vascularity. III. The spinal cord arteries in man. Acta Radiol Diagn (Stockh). 17 (3), 257-273 (1976).
- Woollam, D. H., Millen, J. W. The arterial supply of the spinal cord and its significance. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 18 (2), 97-102 (1955).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Umehara, S., Goyagi, T., Nishikawa, T., Tobe, Y., Masaki, Y. Esmolol and landiolol, selective β1 adrenoreceptor antagonists, provide neuroprotection against spinal cord ischemia and reperfusion in rats. Anesth Analg. 110 (4), 1133-1137 (2010).
- De Ley, G., Nshimyumuremyi, J. B., Leusen, I. Hemispheric blood flow in the rat after unilateral common carotid occlusion: evolution with time. Stroke. 16 (1), 69-73 (1985).
- Coyle, P., Panzenbeck, M. J. Collateral development after carotid artery occlusion in Fischer 344 rats. Stroke. 21 (2), 316-321 (1990).
- Levine, S.
- Prior, B. M., et al. Time course of changes in collateral blood flow and isolated vessel size and gene expression after femoral artery occlusion in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2434-H2447 (2004).
- Yang, H. T., Feng, Y., Allen, L. A., Protter, A., Terjung, R. L. Efficacy and specificity of bFGFincreased collateral flow in experimental peripheral arterial insufficiency. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (6), H1966-H1973 (2000).
- Kakinohana, M., Fuchigami, T., Nakamura, S., Sasara, T., Kawabata, T., Sugahara, K. Intrathecal administration of morphine, but not small dose, induced spastic paraparesis after a noninjurious interval of aortic occlusion in rats. Anesth Analg. 96 (3), 769-775 (2003).
- Horiuchi, T., et al. The effects of the delta-opioid agonist SNC80 on hind-limb motor function and neuronal injury after spinal cord ischemia in rats. Anesth Analg. 99 (1), 235-240 (2004).
- Griepp, R. B., Griepp, E. B. Spinal cord perfusion and protection during descending thoracic and thoracoabdominal aortic surgery: the collateral network concept. Ann Thorac Surg. 83 (2), S865-S869 (2007).
