Summary
Diese Studie zeigt die Technik, um ein minimal-invasives und leicht reproduzierbares Modell der Rückenmark-Ischämie bei Ratten zu machen. Verschiedene Grade des Hinterbein-Motor-Defizits können durch die Kontrolle der Aorten-Okklusionszeit erzeugt werden.
Abstract
Rückenmark Ischämie ist eine tödliche Komplikation nach thorakoabdominalen Aortenaneurysma Chirurgie. Forscher können die Strategien zur Verhütung und Behandlung dieser Komplikation mit experimentellen Modellen der Rückenmark Ischämie zu untersuchen. Das hier beschriebene Modell zeigt unterschiedliche Grade der Paraplegie, die sich auf die Länge der Okklusion nach der Thorax-Aorten-Okklusion in einem Ratten-Rückenmark-Ischämie-Modell beziehen.
A 2-Fr. Ballon-Kippkatheter wurde durch die Oberschenkelarterie in die absteigende Thorax-Aorta vorgerückt, bis die Katheterspitze an der linken Subclavia-Arterie in anästhesierten männlichen Sprague-Dawley-Ratten platziert wurde. Die Rückenmarks-Ischämie wurde durch Aufblasen des Katheterballons induziert. Nach einer festgelegten Okklusion (9, 10 oder 11 min) wurde der Ballon entleert. Die neurologische Beurteilung wurde mit dem motorischen Defizitindex nach 24 Stunden nach der Operation durchgeführt und das Rückenmark wurde zur histopathologischen Untersuchung geerntet.
Jads_content "> Ratten, die 9 min Aortenklappe unterzogen wurden, zeigten eine leichte und reversible motorische Beeinträchtigung im Hinterglied. Ratten, die 10 min Aortenklappen unterworfen wurden, wurden mit moderaten, aber reversiblen motorischen Beeinträchtigungen präsentiert. Ratten, die 11 min Aortenklappen unterzogen wurden, wurden vollständig und anhaltend angezeigt Lähmung Die motorischen Neuronen in den Rückenmarksabschnitten wurden bei Ratten, die einer kürzeren Dauer der Aortenklappen ausgesetzt waren, mehr konserviert.Forscher können ein reproduzierbares Hinterbein-Motor-Defizit nach thorakalen Aorten-Okklusion mit diesem Rückenmark Ischämie-Modell zu erreichen.
Introduction
Paraplegie ist eine tödliche Komplikation der Thorakoabdominal Aortenaneurysma Chirurgie. Es ergibt sich aus einer Rückenmarks-Ischämie-Reperfusions-Verletzung, die beim Querschneiden und Entklemmen der Aorta auftritt. 1 Es wurden mehrere Strategien einschließlich systemischer Hypothermie und zerebrospinaler Drainage eingeführt, um das Rückenmark zu schützen, 2 , 3 , 4 aber viele Patienten bleiben von der Verletzung betroffen.
Es wurden mehrere Tier-Rückenmark-Ischämie-Modelle eingeführt, um ihre Pathogenese zu untersuchen und Schutzstrategien gegen die Verletzung zu entwickeln. In der aktuellen Studie skizzieren wir ein Rattenmodell der Rückenmark Ischämie auf der Grundlage von Taira und Marsala-Methode. 5 Das Wirbelsäulen-Zirkulationssystem bei Ratten ist dem Rückenmarks-Gefäß- und Kollateralsystem beim Menschen sehr ähnlich, obwohl es einige Unterschiede in der Größe undLage. 6 , 7 So ist eine Ratte ein anatomisch geeignetes Tier, das für ein experimentelles Modell verwendet wird, das die Pathogenese, Komplikationen und die Behandlung der Rückenmarksämie untersucht. Darüber hinaus produziert dieses Rückenmark-Ischämie-Modell eine zuverlässige Aorten-Okklusion mit minimalem Eingriff durch die Verwendung einer intravaskulären Ballon-Okklusion der Thorax-Aorta.
In dieser Studie haben wir gezeigt, dass dieses Rattenmodell der Rückenmarks-Ischämie reproduzierbare motorische Defizite in den Hinterbeinen induziert, die in Abhängigkeit von der Aortenklappenzeit stark variieren.
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Protocol
Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee von Seoul National University Bundang Hospital genehmigt. Tierpflege und Experimente wurden nach den United States National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.
1. Chirurgische Vorbereitung
- Vor der Operation, spülen Sie die Katheter mit steriler Kochsalzlösung, um Durchgängigkeit zu gewährleisten.
- Setzen Sie eine Heizdecke auf den Operationstisch und decken Sie den Tisch mit einer sterilen Abdeckung ab.
- Legen Sie männliche Sprague-Dawley-Ratten (270-330 g) in eine Acrylbox mit 3,0% -4,0% Isofluran in 100% Sauerstoff ein.
- Schmiermittel auf die Augen der Ratte auftragen.
- Legen Sie die Ratte auf den Operationstisch in der Rückenlage und halten Sie die Anästhesie unter Verwendung einer Gesichtsmaske mit kontinuierlicher Verabreichung von inhaliertem Isofluran (1,0% -2,5 Vol .-%).
- Legen Sie eine rektale Sonde zur Überwachung und Aufrechterhaltung der Körpertemperatur zwischen 37,0-38,0 ° C.
2. Femoralarterie-Katheterisierung
- Schütteln Sie den richtigen Leistenbereich mit Betadin und 70% Ethanol.
- Machen Sie eine 2-cm horizontale Hautinzision mit Schere auf der rechten Leiste Bereich.
- Mit einem Retraktor das chirurgische Feld aussetzen.
- Die Femoralarterie aus der umgebenden Vene und Nerven zerlegen. Isoliere einen 1-cm-Abschnitt der Arterie mit gebogener Pinzette und abgestumpfter Pinzette.
- Mit einer 4,0 schwarzen Seidennaht, legen Sie eine lose Krawatte an den proximalen und distalen Enden der Arterie, um die Belichtung zu maximieren.
- Machen Sie einen Einschnitt auf die Oberschenkelarterie mit Mikroschere.
- Ein 2-Fr. Ballon-Kipp-Katheter in die Oberschenkel-Arterie mit Mikro-Pinzette. Sichern Sie den Katheter ca. 1 cm vom Katheterkopf mit der proximalen Ligatur und befestigen Sie die distale Ligatur.
3. Carotis-Arterie-Katheterisierung
- Schrubben Sie den rechten vorderen Hals mit BetadIne und 70% Ethanol, und dann machen eine Hautinzision.
- Mit einem Retraktor das chirurgische Feld aussetzen. Isoliere einen 1-cm-Abschnitt der Arterie und binden sie lose mit einer Seidennaht an den proximalen und distalen Enden der Arterie, um die Exposition zu maximieren.
- Punktion der Carotis-Arterie mit einem 24 G intravenösen Katheter, und die proximalen 1 cm des Katheters in Richtung des Herzens voranzutreiben.
- Sichern Sie den Katheter mit der proximalen Ligatur und verbinden Sie dann die distale Ligatur.
- Mit einem 3-Wege-Hahn das distale Ende des Katheters mit dem salzgefüllten Mikrorohr und dem externen Reservoir verbinden.
4. Tail Artery Katheterisierung
- Schrubben Sie den ventralen Bereich des Schwanzes mit Betadin und 70% Ethanol, und machen Sie eine 2-cm Hautinzision.
- Dissektieren Sie die Schwanz-Arterie aus den umgebenden Strukturen und isolieren Sie einen 1 cm Abschnitt der Arterie mit gebogenen Pinzetten und abgestumpfter Pinzette.
- Mit einem 4,0 schwarzen Seiden Naht, legen Sie eine lockereBinden an den proximalen und distalen Enden der Arterie, um die Belichtung zu maximieren.
- Punktion der Schwanz-Arterie mit einem 24 G intravenösen Katheter, und voran den Katheter in die Arterie.
- Sichern Sie den Katheter mit einer proximalen Ligatur an den Gefäß (ca. 1 cm vom Katheterkopf) und binden Sie die distale Ligatur.
- Verbinden Sie den distalen Teil des Katheters mit der arteriellen Drucküberwachung.
5. Induktion der Rückenmark Ischämie
- Nachdem die Katheterisierung abgeschlossen ist, führe die 2 Fr. Ballon-Kopfkatheter in die absteigende Thorax-Aorta, so dass die Spitze des Katheters die linke Subclavia-Arterie erreicht.
- Setzen Sie eine Tiefe von 10 cm von der Einführungsstelle ein.
- Inkorporieren Sie 150 Einheiten Heparin in einer Konzentration von 100 Einheiten / ml in den Carotis-Katheter.
- Den Katheterballon mit 0,05 ml Kochsalzlösung aufblasen.
- Gleichzeitig das Blut in den äußeren Blutbehälter aus dem c abtropfen lassenArotid-Arterie, um den proximalen arteriellen Druck auf 80 mmHg zu regulieren.
- Verbinden Sie das arterielle Drucküberwachungssystem mit dem verbleibenden Lumen des 3-Wege-Absperrhahns und steuern Sie die Blutentwässerung mit der Überwachung des arteriellen Drucks.
- Bestätigen Sie den Erfolg der Aortenklappe durch eine abrupte Abnahme und kontinuierlichen Verlust des distalen arteriellen Drucks.
- Nach Aortengelenk von 9, 10 oder 11 min entleeren Sie den Fogarty-Katheterballon und reinigen das abgetrocknete Blut.
6. Post-chirurgische Versorgung und neurologische Beurteilung
- Bei der Überwachung des arteriellen Drucks durch die Schwanzarterie entfernen Sie die Katheter aus den Oberschenkel- und Carotis-Arterien und schließen die Wunden mit Seidennähten.
- Nach der Bestätigung, dass der arterielle Druck in den normalen Bereich zurückgewonnen wird, entfernen Sie den Katheter aus der Schwanz-Arterie und schließen Sie die Wunde.
- Nach der Erholung von der Anästhesie, die Ratte in den Käfig zurückgeben.
- Schätze halloNd-Gliedmaßenmotor-Funktion bei 24 h nach der Operation mit dem Motor-Defizit-Index ( Tabelle 1 ). Der Motor-Defizit-Index ist definiert als die Summe der Ambulations-Score und der Platzierungs- / Schrittreflex-Score. Ein Motor-Defizit-Index von 6 zeigt das maximale Defizit an.
7. Histopathologische Auswertung
- Nach der neurologischen Beurteilung, betäubt Ratten mit Maske-geliefertes Isofluran, opfern sie durch transkardiale Perfusion mit 100 ml heparinisierte Kochsalzlösung unter Anästhesie und extrahiere das Rückenmark. 8
- Setzen Sie die Schnurabschnitte von der Ebene der Lendenwirbel 3-5 in Paraffin ein.
- Fleckquerschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H & E).
- Beobachten Sie die Motorneuronverletzung unter einem Mikroskop. 9
8. Statistische Analyse
- Führen Sie eine statistische Analyse mit dem Statistischen Paket für die Sozialwissenschaften Version 20. Der Motor defIcit-Index der drei Gruppen wurde mit dem Kruskal-Wallis-Test verglichen, gefolgt von einem Mann-Whitney U -Test. Ein P- Wert <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
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Representative Results
Während einer Periode der Rückenmarks-Ischämie wurde eine Aorten-Okklusion für 9 min (n = 3), 10 min (n = 3) oder 11 min (n = 3) durchgeführt. Der Motor-Defizit-Index bei Ratten ist in Tabelle 2 dargestellt. Ratten, die 9 Min. Aorten-Okklusion unterzogen wurden, zeigten eine leichte und reversible motorische Beeinträchtigung im Hinterglied. Ratten, die 10 min Aortenklappen unterworfen wurden, zeigten ein moderates motorisches Defizit, aber keine vollständige Lähmung. Ratten, die 11 Min. Verschlusszeit unterzogen wurden, zeigten eine vollständige und anhaltende Lähmung.
Repräsentative Fotos von mit H & E gefärbten Rückenmarksabschnitten sind in Abbildung 1 dargestellt . Die motorischen Neuronen in den Rückenmarksabschnitten wurden bei Ratten, die einer kürzeren Aortenklappe ausgesetzt waren, mehr konserviert.
Abbildung 1 Histologische UntersuchungInsektion von Rückenmarksabschnitten
Die motorischen Neuronen wurden bei Ratten, die einer kürzeren Aortenklappe ausgesetzt waren, besser erhalten (Originalvergrößerung, 200X). Maßstab in allen Bildern = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Ambulation (Gehen mit unteren Extremitäten) | Platzierung / Schrittreflex |
| 0: normal (symmetrische und koordinierte Ambulation) | 0: normal |
| 1: Zehen flach unter Körper beim Gehen, aber Ataxie vorhanden | 1: schwach |
| 2: knuckle-walking | 2: kein Schritt |
| 3: Bewegung in den unteren Extremitäten aber nicht in der Lage, Knöchel zu gehen | |
| 4: keine Bewegung, zieht die unteren Extremitäten |
Tabelle 1. Bewertung der Ambulation und des Placing / Stepping Reflex.
| Aorten-Verschlusszeit | 24 h nach der chirurgie |
| 9 min (n = 3) | 2 (2 - 3) |
| 10 min (n = 3) | 4 (4 - 4) |
| 11 min (n = 3) | 5 (5 - 6) |
Tabelle 2. Motor Defizit Index. Die Werte werden als Median dargestellt (Interquartilbereich).
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Discussion
In der aktuellen Studie zeigten wir ein Rattenmodell der Rückenmarks-Ischämie auf der Grundlage von Taira und Marsala-Methode 5 , die in Abhängigkeit von der Aorten-Okklusionszeit variablen Grade des motorischen Defizits im Hinterglied induziert.
Die Länge der Aortenverschluss kann den Grad des motorischen Defizits beeinflussen. Wenn die Aortenverschlusszeit länger ist, wird das motorische Defizit stärker. So können Forscher ein gewisses Maß an motorischem Defizit erreichen, indem sie die Aortenverschlusszeit in diesem Modell kontrollieren.
Unser Modell beinhaltet die Ligation der Arteria carotis communis und der Oberschenkelarterie, und die Möglichkeit neurologischer Defizite, die sich aus der Ligation dieser Arterien ergeben, ist ein potentielles Anliegen. Allerdings haben Ratten effiziente Collateral Network Systeme. Wenn also die Carotis-Arterie oder die Oberschenkelarterie ligiert wird, kann ein ausreichender Blutfluss durch das umfangreiche Kollateralnetzwerk bereitgestellt werden. Einseitige caroti D Arterienverschluss wird berichtet, um nur geringe Auswirkungen auf den zerebralen Blutfluss zu produzieren. 10 , 11 Obwohl einseitige Karotis-Arterien-Okklusion einen Schlaganfall bei Ratten hervorrufen kann, tritt dies nur in Kombination mit einer schweren systemischen Hypoxie auf. 12 Während unseres Experiments trat keine systemische Hypoxie auf und keiner der Ratten zeigte sich mit neurologischen Defiziten, die auf einen zerebralen Infarkt hindeuten. Weiterhin, wenn die Oberschenkelarterie der Ratten ligiert wird, liefert die Kollateralzirkulation einen ausreichenden Blutfluss zu den Hinterbeinmuskeln. 13 Diese Kollateralzirkulation sorgt für ausreichende Blutströmung zu den Hinterbeinmuskeln, wenn sie in Ruhe sind, aber keine ausreichende Strömung während des Trainings bietet. 14
Darüber hinaus beeinflusst der proximale arterielle Druck während der Rückenmarks-Ischämie die Entwicklung von motorischen Defiziten. Nach einer früheren Studie,Ref "> 5 die Kollateralblutversorgung fast bei dem proximalen arteriellen Druck von 40 mmHg während der Aortenklemmung bei einem Ratten-Wirbelsäulen-Ischämie-Modell verschwunden war, so dass die nachfolgenden Studien den proximalen arteriellen Druck bei 40 mmHg während der Rückenmarks-Ischämie bei ihren Rattenspinalmodellen aufrechterhielten Cord Ischämie 9 , 15 , 16 In diesem Protokoll haben wir jedoch den proximalen arteriellen Druck bei 80 mmHg während der Aortenklappe aufrechterhalten, da es empfohlen wird, den mittleren arteriellen Druck bei 80 mmHg oder mehr aufrechtzuerhalten, um eine adäquate Rückenmarksperfusion während des Rückenmarks zu erhalten Ischämie in der klinischen Praxis, 17 obwohl es einen Unterschied in dem, was einen adäquaten proximalen arteriellen Druck zwischen Menschen und Nagetiere darstellt.
Das Rückenmark Vaskulatur und Sicherheiten System von Ratten und Menschen sind ähnlich, 6 , 7 , die Ratten eine geeignete Wahl für ein experimentelles Rückenmark Ischämie Modell macht. Es sollte jedoch nicht diskontiert werden, dass die Ergebnisse je nach Art, in der die Rückenmarks-Ischämie auftritt, unterschiedlich sein können.
Abschließend können die Forscher dieses Rattenmodell der Rückenmark-Ischämie leicht annehmen und hochreproduzierbare Befunde erzielen. Darüber hinaus können sie die Aortenverschlusszeit ändern, um den Grad des erzeugten Motorendefizits zu variieren. Als solches kann dieses Modell weitere Studien zur Untersuchung der zugrunde liegenden Pathophysiologie neurologischer Komplikationen nach thorakoabdominalem Aortenaneurysma erleichtern und die Entwicklung von neuroprotektiven Strategien gegen diese Komplikationen ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen. Diese Arbeit wurde durch die Gewährung von 2012R1A1A3014010 von der National Research Foundation der koreanischen Regierung unterstützt.
Acknowledgments
Die Autoren haben keine Anerkennung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fogarty Arterial Embolectomy catheter | Edward Life Sciences | 120602F | a balloon-tipped catheter inserted into the femoral artery |
| BD Insyte-N Autoguard Shielded IV catheter | BD | 381411 | 24-gauge intravenous catheter |
| 50 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 50mL | Facial mask |
| 1 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 1ml | |
| Recal probe | HARVARD APPARATUS | 50-7221F | Rectal probe for temperature monitoring |
| Micro dissecting spring scissor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-10 | Micro-scissor |
| SCISSOR (SHARP-SHARP) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-51-12-S | Scissors |
| Retractor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-74A | Retractor |
| Micro forcep | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-29 | Micro-forceps |
| MOSQUITO FORCEP (Curved) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-44-CPK | Curved forceps |
| DRESSING FORCEP | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-37-16S | Blunted forceps |
| 4/0 black silk | Woori Medical | S431 | 4.0 black silk suture |
| 3-WAY STOCK | Seonwon Medcal | D-98-01 | 3-way stopcock |
| Patient monitor | PHILIPS | MP20 | The arterial pressure monitoring device. |
| Heating blanket | Self production | Heating blanket | |
| Microtube and external reservoir | Self production | Microtube and external reservoir | |
| Heparin | JW Pharmaceutical | Heparin | |
| 0.9% NS 1000ml | JW Pharmaceutical | Normal saline | |
| Isoflurane | Hana Med | Isoflurane |
References
- Greenberg, R. K., et al. Contemporary analysis of descending thoracic and thoracoabdominal aneurysm repair: a comparison of endovascular and open techniques. Circulation. 118 (8), 808-817 (2008).
- Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 59 (2), 79-90 (2011).
- Fleck, T. M., et al. Improved outcome in thoracoabdominal aortic aneurysm repair: the role of cerebrospinal fluid drainage. Neurocrit Care. 2 (1), 11-16 (2005).
- Kouchoukos, N. T., et al. Hypothermic bypass and circulatory arrest for operations on the descending thoracic and thoracoabdominal aorta. Ann Thorac Surg. 60 (1), 67-76 (1995).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Tveten, L. Spinal cord vascularity. III. The spinal cord arteries in man. Acta Radiol Diagn (Stockh). 17 (3), 257-273 (1976).
- Woollam, D. H., Millen, J. W. The arterial supply of the spinal cord and its significance. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 18 (2), 97-102 (1955).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Umehara, S., Goyagi, T., Nishikawa, T., Tobe, Y., Masaki, Y. Esmolol and landiolol, selective β1 adrenoreceptor antagonists, provide neuroprotection against spinal cord ischemia and reperfusion in rats. Anesth Analg. 110 (4), 1133-1137 (2010).
- De Ley, G., Nshimyumuremyi, J. B., Leusen, I. Hemispheric blood flow in the rat after unilateral common carotid occlusion: evolution with time. Stroke. 16 (1), 69-73 (1985).
- Coyle, P., Panzenbeck, M. J. Collateral development after carotid artery occlusion in Fischer 344 rats. Stroke. 21 (2), 316-321 (1990).
- Levine, S.
- Prior, B. M., et al. Time course of changes in collateral blood flow and isolated vessel size and gene expression after femoral artery occlusion in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2434-H2447 (2004).
- Yang, H. T., Feng, Y., Allen, L. A., Protter, A., Terjung, R. L. Efficacy and specificity of bFGFincreased collateral flow in experimental peripheral arterial insufficiency. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (6), H1966-H1973 (2000).
- Kakinohana, M., Fuchigami, T., Nakamura, S., Sasara, T., Kawabata, T., Sugahara, K. Intrathecal administration of morphine, but not small dose, induced spastic paraparesis after a noninjurious interval of aortic occlusion in rats. Anesth Analg. 96 (3), 769-775 (2003).
- Horiuchi, T., et al. The effects of the delta-opioid agonist SNC80 on hind-limb motor function and neuronal injury after spinal cord ischemia in rats. Anesth Analg. 99 (1), 235-240 (2004).
- Griepp, R. B., Griepp, E. B. Spinal cord perfusion and protection during descending thoracic and thoracoabdominal aortic surgery: the collateral network concept. Ann Thorac Surg. 83 (2), S865-S869 (2007).
