Summary
כאן אנו מדווחים על שיטה לבידוד של אוכלוסיות תאי אב (APC) של אדיפוציטים (APC) מתוך רקמת אדיפוס (Perivascular Adipose Tissue) (PVAT) תוך שימוש במיון תאים מגנטיים המופעל (MCS). שיטה זו מאפשרת בידוד מוגבר של APC לכל גרם של רקמת השומן בהשוואה לפלואורסצנטי המופעל תא מיון (FACS).
Abstract
הרחבת רקמת אדיפוס (Perivascular Adipose Tissue) (PVAT), הרגולטור העיקרי של תפקוד כלי הדם באמצעות איתות paracrine, קשורה ישירות להתפתחות יתר לחץ דם במהלך השמנת יתר. היקף היפרטרופיה ו hyperplasia תלוי במיקום dot, מין, ואת סוג של פנויה epipocyte אב (APC) פנוטיפים הנוכחי. טכניקות המשמשות בידוד APC ו preadipocytes ב 10 השנים האחרונות שיפרו באופן דרסטי את הדיוק שבו תאים בודדים ניתן לזהות על בסיס סמנים ספציפיים משטח התא. עם זאת, בידוד של APC ו adipocytes יכול להיות אתגר בשל שבירות של התא, במיוחד אם התא שלם צריך להישמר עבור יישומי תרבות התא.
מגנטי המופעל תא מיון ( MCS) מספק שיטה של בידוד מספר גדול יותר של APC קיימא לכל יחידת משקל של רקמת השומן. APC שנקטפו על ידי MCS יכול לשמש פרוטוקולי חוץ גופית כדי להרחיב פרהDipocytes ולהבדיל אותם לתוך אדיפוציטים באמצעות שימוש בגורם גורם הגדילה המאפשר ניתוח של פוטנציאל פורה אדיפוגני שמרו על ידי התאים. ניסוי זה התמקד בתחנות ה- PVAT של אבי העורקים והמזנטרים, אשר ממלאים תפקידים מרכזיים בהתפתחות מחלות לב וכלי דם במהלך ההתפשטות. פרוטוקולים אלה מתארים שיטות לבודד, להרחיב ולהבדיל אוכלוסייה מוגדרת של APC. זה פרוטוקול MCS מאפשר בידוד לשמש בכל ניסוי שבו מיון התא נדרש עם ציוד מינימלי או הכשרה. טכניקות אלה יכולים לסייע ניסויים נוספים כדי לקבוע את הפונקציונליות של אוכלוסיות תאים ספציפיים בהתבסס על נוכחות של סמנים פני השטח התא.
Introduction
Perivascular רקמת אדיפוס (PVAT), בשל קרבתו לכלי הדם, הוא מרכיב מרכזי paracrine איתות ב תפקוד כלי הדם 1 . הרחבת רקמת השומן תלויה בפנוטיפ של תאי האב-אדפוציטים (APC) , 2 , 3 . בידוד של תאים ברקמות השומן קשה כמו adipocytes העיקרית הם שבירים, ציפה, ואת טווח בגודל. טכניקות בידוד מסוימים יכולים גם לשנות פנוטיפ התא מורפולוגיה על ידי הגדלת סינתזה חלבון דלקתיות וצמצום ביטוי הגן adipogenic 4 , המדגיש את החשיבות של פרוטוקול ששומרת על שלמות התאים.
התרבות של תאים ראשוניים subpopulations ספציפיים preadipocyte נותן גישה רדוקציוניסטית ב vivo צמיחה ושומרת המקבילה איפור גנטי התאית 5 , למרות עובד tiאותי עם תאים אלה מוגבלת בשל הידרדרות עם ההזדקנות, או ההזדקנות 6 . Preadipocytes ממחסני השומן השונים, כולל תת מחסן תת-ימורי ו omental, גם להפגין הבדלים התפשטות 7 , אשר מדגיש את החשיבות של איסוף תאים מאתרים אנטומיים ספציפיים. תאים מבשר מן הלא PVAT מחסן לבן מחסן מאופיינים במחקרים קודמים 7 , 8 , 9 , אבל פחות ידוע על פנוטיפים PVT APC.
הטכניקות המתוארות כאן מאפשרות ניתוח של אוכלוסיות ספציפיות ומוגדרות של APC, עם השפעה מזערית על המורפולוגיה שלהן, על יכולתן ועל פוטנציאלן להתרבות ולהבדיל. מגנטי המופעל תא תאים (MCS) הוא מקובל ליישומים במורד הזרם, כגון תרבות, כמו חרוזים להתמוסס מבלי לשנות את התא. MCS הוא גם חסכוני, ופעם נוגדן נוגדניםריכוזים תוקנו, הצורך מבחני cytometry זרימה היא מינימלית. מחקרים במבחנה עם מבשרי PVAT יכול גם לתת הצצה של הפוטנציאל כי תאים ראשוניים אלה עשויים להיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים המתוארים במאמר זה פעל לפי הנחיות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן. כל buffers ו medias צריך להיות מוגן מפני האור.
1. הכנת מאגרים, מדיה, ומכשירים
- הכנת קרבס רינגר Bicarbonate-buffered פתרון (KRBB): 135 מ"מ כלוריום נתרן, 5 מ"מ כלוריד אשלגן, 1 מ"מ גופרתי מגנזיום, 0.4 מ"מ אשלגן פוספט dibasic, 5.5 מ"מ גלוקוז, 1% אנטיביוטיקה / antimycotic (10,000 יחידות / מ"ל פניצילין, 10,000 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 25 מיקרוגרם / מ"ל amphotericin B), ו 10 מ"מ HEPES (pH = 7.4). פתרון זה יציב במשך 3 שבועות כאשר שמר סטרילית ב 4 ° C.
- הכן Collagenase סוג 1 פתרון: 1 מ"ג / מ"ל ב KRBB עם 4% בסרום אלבומין בסרום (BSA). פתרון זה צריך להישמר על 37 מעלות צלזיוס והוא יציב במשך 4 שעות.
- הכן פתרון תמוגה תמוגה תמוגה: 154 מ"מ אמוניום כלוריד, 10 מ"ל אשלגן ביקרבונט, ו 0.1 מ"מ EDTA. שמור על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש.
- הכנת MCS חסימת חיץ: DMEM / F12 בסיס התקשורת, 10% בסרום שור עוברית (FBS), 5% סרום חמור רגיל, 40 μL / מ"ל F (ab) שבר חמור אנטי עכברוש IgG. שמור על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש.
- הכן MCS מאגר הצפת: פוספט שנאגרו מלוחים (PBS, pH = 7.5), 0.5% BSA, ו 2 מ"מ EDTA. שמור על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש. פתרון דה גז על ידי חימום ל 37 מעלות צלזיוס במיכל זכוכית ולאחר מכן החלת ואקום for15 s. השאר שלא נעשה שימוש במאגר סגור.
- הכנת חלקיקים כלי דם של סטרומה (SVF): מדידות עורקיות של Dulbecco - DEMECCO: F12, 15% סרום עגל של 15%, אנטיביוטיקה של 1% / אנטיביוטיקה (10,000 יחידות / פניצילין מ"ל, 10,000 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 25 מיקרוגרם / ML amphotericin B), 44.05 מ"מ סודיום ביקרבונט, 100 מיקרומטר חומצה אסקורבית, ביוטין 33 מיקרומטר, pantothenate מיקרומטר 17, 2 מ"מ L- גלוטמין, ו 20 מ"מ HEPES. שמור סטרילית ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות.
- הכן APC &# 160: מדיה: מדיה בזאלית עם גורמי גדילה נוספים, כולל גורם גדילה באפידרמיס 10 ng / mL), גורם מעכב לויקמיה (10 ng / mL), גורם גדילה של טסיות (BB) (10 ng / mL) ופקטור גדילה בסיסי של fibroblast 5 ng / mL). שמור סטרילית ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות.
- הכן APC אינדוקציה מדיה: APC מדיה עם 10% FBS, 2.5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, 0.5 מ"מ 2-isobutyl-1-methylaxanthine (IBMX), 1 מיקרומטר dexamethasone, ו 200 pM T3 (הורמון בלוטת התריס triiodothyronine). שמור סטרילית ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות.
2. אדיפוציטים אבות בידוד
- להרדים חולדה על פי הנחיות מוסדיות. מניחים את החולדה בשכיבה הגב. אישור עומק הרדמה באמצעות אצבע הבוהן ואת אובדן התגובה רפלקס לגירוי זה כואב.
הערה: פרוטוקול זה משתמש 10 שבועות חולדות Sprague Dawley ו 70 מ"ג / ק"ג של pentobarbital נמסר באמצעות הזרקה intraperitoneal. - ביצוע חתך קו אנכי wIth מספריים לאורך עצם החזה באזור החזה ואת האזור העברי. גישה חלל הבטן לחשוף את העורק mesenteric מעולה, כלי ההתנגדות mesenteric קטן (mPVAT) ואת אבי העורקים החזי (aPVAT).
- לנתק את כל החיבורים כדי mesentery ו אבי העורקים ולהסיר כלי מן החי. לבודד PVAT באמצעות מיקרוסקופ לנתח צלחת פטרי מלא KRBB כדי להציג כלי לבודד PVAT.
- בניסוי זה, לאסוף גונדאל (GON) אדיפוס לייצג מחסן שאינו PVAT דיפו. מקום רפידות שומן מבודדים על קרח KRBB עם 10 מ"מ HEPES (pH = 7.4).
- ב מכסה המנוע biosafety, להעביר כ 50 מ"ג של רקמה לצינור 1.7 מ"ל עם 1 מ"ל של קולגנאז סוג אני פתרון ו לטחון עם מספריים רקמות (1 - 3 חתיכות מ"מ).
- דגימות תקציר על ידי דוגרים על 37 מעלות צלזיוס חממה rotisserie (או חממה עם שייקר מסלולית) עבור 1 ח '. בתוך מכסה המנוע biosafety, ברצף לסנן חומר מתעכל דרך 100 ו - 40 מיקרומטר תאים מסננת לתוך צינור 50 מ"ל. צנטריפוגה וכתוצאה מכך תסנין ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 300 × גרם.
הערה: כל השלבים בפרוטוקול מכאן קדימה הם להתבצע מכסה המנוע biosafety לשמור תאים סטריליים. - יוצקים את כדוריות supernatant ו resuspend המכילים את התאים SVF ב 1 מ"ל של 1X פתרון כדורית תמוגה תמוגה ולהעביר צינור 1.7 microfuge מ"ל. דגירה תאים 5 דקות ב RT מוגן מפני אור צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 300 x גרם.
- יוצקים supernatant ו resuspend תא גלולה שנותר SVF בסל מדיה. איסוף 20 תת מדגם μL לספור תאים חיים עם פתרון כחול Trypan.
הערה: מספר תאי SVF שניתן לבודד ישתנה בהתאם לאתר. מספרים ממוצעים של SVF שנקצרו לכל מ"ג של רקמות הם: aPVAT = 5.0 ± 2.0x10 3 , mPVAT = 1.04 ± 0.62x10 4 , GON = 2.4 ± 1.2x10 5 .
3. מגנטי המופעל תא מיון
_content "> הערה: בידוד APC מ SVF מבוסס על CD34 ו PDGFRα פני השטח סמנים על ידי ביצוע כל השלבים על 4 מעלות צלזיוס.- תאים ספין 5 דקות ב 300 x גרם. יוצקים את supernatant ו resuspend גלולה התא MCS חסימת חיץ ב 1 x 10 6 תאים / מ"ל ו דגירה במשך 20 דקות.
הערה: ניתן להפר את התאים המתים של 1 x 10 6 - 2 x 10 8 תאים / מ"ל באופן יעיל. - דגירה תאים עם μL 5 של FITC- מצומדות עכבר anti-CD34 (1 מיקרוגרם / 1 x 10 6 תאים) במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. תאים ספין 5 דקות ב 300 xg ו 4 ° C.
- דגירה עם 4 μL של microbeads נגד FITC ו 96 μL של חיץ MCS (נפח כולל של 100 μL) במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך כדי להפריד CD34 + ו CD34 - תאים.
- חבר את המפריד המגנטי למעמד והנח את העמודה MultiSort (MS), עם כנפי העמוד הקדמי, לתוך המפריד. מניחים 5 מ"לצינור תחת עמודה MS ב בעל הצינור העליון.
- הכן MS טור על ידי שטיפה עם פתרון הצפת MCS. החל 500 μL של חיץ MCS על גבי העמודה ולתת למאגר לרוץ דרך. מחק קולחים ולשנות צינור איסוף.
- טען נוגדנים שכותרתו ההשעיה תא על עמודה MS מוכן. איסוף זרימת דרך המכילה תאים ללא תווית.
- שטפו עמודה MS עם 500 μL של מאגר MCS degassed 3x. איסוף תאים ללא תווית העוברים דרך לשלב עם הזרימה דרך השלב הקודם.
- הסר MS טור מהמפריד המגנטי והנח אותו על צינור איסוף חדש. פיפטה 1 מ"ל של MCS הצפת על עמודה MS. מיד לשטוף את חלק עם תאים שכותרתו מגנטית על ידי בתקיפות, אבל לאט, החלת הבוכנה שסופק עם הטור כדי לא לאפשר גז עודף לתוך העמודה.
הערה: מספרי התאים המבודדים ישתנו בהתאם לאתר. מספרים ממוצעים של CD34 + APC מבודדים מאוכלוסיית SVF לכלמ"ג של רקמות הם: aPVAT = 2.6 ± 0.43x10 2 , mPVAT = 9.6 ± 1.4x10 2 , GON = 1.3 ± 0.22x10 3 . - תאים ספין 5 דקות ב 300 × גרם ו 4 ° C. דגירה את החלק CD34 + שנאספו μL 10 של פתרון 1: 200/1 x 10 6 תאים ארנב נגד PDGFRα במשך 30 דקות ב 4 ° C.
- צנטריפוגה תאים שוב 5 דקות ב 300 xg ו 4 ° C. דגירה תאים שכותרתו עם 4 μL של microbeads נגד ארנבת IgG ו 96 μL של חיץ MCS על ידי חזרה על שלבים 3.3 עד 3.7 לבודד.
הערה: מספרי התאים המבודדים ישתנו בהתאם לאתר. מספרים ממוצעים של PDGFRα + APC המבודדים מאוכלוסיית CD34 + לכל מ"ג של רקמות הם: APVAT = 2.4 ± 0.64, mPVAT = 8.4 ± 2.4, GON = 10.4 ± 1.9, המהווה 0.5 - 10% מהאוכלוסייה המבודדת בעבר.
- צנטריפוגה תאים שוב 5 דקות ב 300 xg ו 4 ° C. דגירה תאים שכותרתו עם 4 μL של microbeads נגד ארנבת IgG ו 96 μL של חיץ MCS על ידי חזרה על שלבים 3.3 עד 3.7 לבודד.
4. תרבות תאים אדיפוגנזה אינדוקציה
- התרבות SVFו APC ב 6-טוב רקמות תרבות צלחות התקשורת הבסיסית עם החלפת כל 2 ימים. לאחר 3 מעברים סדרתיים, צלחת שחור 96-טוב רקמות תרבות צלחות ב 1x10 2 תאים / גם מבחני התפשטות, אשר מוערכים ב 8, 24, 48, ו 96 שעות, ב 50,000 תאים / גם צלחות 24 גם או 10,000 תאים / גם 48-טוב רקמות תרבות צלחות עבור מבחני אדיפוגנזה, שהם איכותיים וכמותיים.
- השלמת APC התקשורת הבסיסית עבור 48 שעות לאחר confluency ו לפני אינדוקציה עם חלבון מורפוגני העצם 4 (3.3 nmol / L) כפי שצוין 10 עבור בידול. להשרות תאים לאחר 48 שעות של 100% confluency (יום 0) באמצעות APC אינדוקציה מדיה כדי לדגור את התאים.
- לאחר 48 שעות, לשנות את התקשורת כדי לשמור על תאים בתקשורת Induction APC ללא יבמ ו dexamethasone, במשך 14 ימים עם שינויים התקשורת כל 48 שעות.
- בידוד MCS מאומת על ידי FACS.
- קח 50 μL (50,000 תאים) מדגם משנה של הפרדה מגנטיתלעבר התאים ולשטוף עם פתרון FACS.
- צנטריפוגות תאים resuspend ב 100 μL של פתרון 1: 1000 של חמור נגד ארנב IgG Dylight 405 לתייג את התאים PDGFRα + . דגירה במשך 30 דקות מוגן מפני האור ב 4 ° C.
- לשטוף תאים resuspend μl 200 של פתרון פורמלדהיד 2% עד זמן לניתוח באמצעות 488 ננומטר (FITC) ו 405 ננומטר (Dylight 405) מסננים על cytometer זרימה.
הערה: הצטברות שומנים על ידי תאים בתרבית מוערך כמותית באמצעות assipogenesis lipophilic adipogenesis בקורא microplate מדידה פלואורסצנטי ושימוש preadipocytes כמו כיולים עבור הצטברות השומנים. הצטברות השומנים נמדדת גם מבחינה איכותית על ידי צביעת צבע השומנים והדמיה שבוצעה על מיקרוסקופ הפוך מצויד במצלמה, מה שהופך את אחוז התאים הכולל לעשות או לא מכילים שומנים. כל צלחת הקורא כי הוא מסוגל למדוד הקרינה עם עירור ב 485 ננומטר פליטה ב 572ננומטר מתאים לניתוח כמו גם כל מיקרוסקופ עם מצלמה המסוגלת לכידת תמונות דיגיטליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יכולת פרוליפרטיבית של preadipocytes ופוטנציאל אדיפוגני של מבשרי השומן הם מאפיינים מתוחזקים במבחנה 11 . התפשטות חוץ גופית של SVF מבודד APC מ aPVAT, mPVAT, ו GON של חולדות זכר הוערך ב 8, 24, 48, ו 96 שעות לאחר ציפוי באמצעות assay DNA כמותי. לא נמצאו הבדלים באתר בשיעור ההרחבה של SVF, בכל נקודת זמן מלבד APC מ- aPVAT, אשר היה פחות התפשטות של 96 שעות בהשוואה לתאי SVF מאותו אתר ( איור 1 ).
Conluent APC מגורה עם חלבון מורפוגני העצם 4 (BMP4) במשך 48 שעות לפני אינדוקציה סטנדרטי 12 מוצגים בידול. זה היה ברור על ידי הצטברות השומנים גדול טיפות כפי שהוערכו על ידי שני assay פלואורסצנטי ספיגת השומנים ( איור 2A ) ו שמן אדום O מכתים ( איור 2 ב ' ).
כאשר משווים את התשואה של APC, בידוד MCS הפיק מספר רב יותר של תאים מוכנים לתרבות לעומת FACS. ( איור 3 ) חשוב לציין, ההתפלגות ואת הכדאיות של אוכלוסיות APC (CD34 + ו PDGFRα + ) היה דומה בין MCS ו FACS. הכדאיות התא שנקבעה על ידי מכתים כחול טריפאן לספירת בידוד לכתוב היה דומה עבור שני הליכי בידוד (FACS = 71.57% ± 11.09, MCS = 79.25% ± 7.47). נתונים אלה מראים כי בידוד MCS של APC מניב מספר גבוה יותר של APC קיימא בהשוואה MCS.
איור 1 : בהפצה חוץ גופית של המודעהIpocyte תאים בתאים (APC) מושפעת על ידי מיקום אנטומי. Stromal Vascular Fraction (SVF) ו- APC היו מבודדים מרקמת השומן של העורקים הלבביים (mPenteric perivascular adipose) (aPVAT & mPVAT, בהתאמה) ושחרור של בלוטת הערמונית מ -10 חולדות גברים בשבוע. הפצה של תאים נמדדה על ידי assay כימות DNA ב 8, 24, 48, ו 96 שעות נקודות זמן לאחר זריעה. הנתונים באים לידי ביטוי כמו להגדיל לקפל מעל 8 שעות הבסיס ± SEM (N = 4). המשמעות מסומנת על ידי * (P <0.05). איור שונה מ Contreras et al . 2016 13 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 : תאים יליד אדיפוציטים (APC) הצג שום וריאציה ב Differentiaיכולות בין התיקים אבל צפיפות השומנים רבתי לעומת שבר כלי הדם סטרומה (SVF). תאים היו המושרה לאחר 48 שעות של confluency וחשיפה BMP4 ואחריו 48 שעות של חשיפה dexamethasone ו 3-isobutyl-1-methylxanthine ולאחר מכן מתמשכת התקשורת תחזוקה 14 ימים עם התקשורת שינויים כל 48 שעות. ( A ) ספיגה השומנים assay של APC מובחנת עם נתונים לידי ביטוי יחס של preadipocytes השוני: אדיפוציטים מובחנים (preadipocytes: אדיפוציטים) ביחידות הקרינה היחסית (RFU) ± SEM (N = 4). ( ב ) שמן אדום O (ORO) מכתים של APC ו SVF עם נתונים לידי ביטוי כאחוז של תאים עם השומנים (ORO ספיגה) ± SEM (N = 4). המשמעות מסומנת על ידי * (P <0.05). איור שונה מ Contreras et al. 2016 13 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 : תשואה בידוד של בתאים אדיפוציטים בר קיימא (APC) משופרת על ידי מיון מגנטי המופעל תא (MCS). ביטוי סמן פני השטח של CD34 + ( A ) ו- PDGFRα + ( B ) ב- SVF מבודדים מרקמות השומן perivascular (אבי העורקים = aPVAT, mesenteric = mPVAT) באמצעות MCS ו- FACS. הנתונים באים לידי ביטוי כמספר ממוצע של תאים מבודדים מ 50 מ"ג של רקמה ± S (N = 4). המשמעות מסומנת על ידי * (P <0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המוקד המרכזי של הניסוי הנוכחי הוא בידוד, הרחבה, אדיפוגני אינדוקציה של APC מן המחסנים PVAT. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של APC מבוסס על זיהוי של תאים להביע את סמנים פני השטח CD34 ו PDGFRα. אלה חלבונים פני השטח זוהו בעבר על APC עם שיעורי התפשטות גבוהה ואת הפוטנציאל להבדיל adipocytes לבן או חום שונים מחסנים 14 , 15 . על ידי בחירת תאים המבוססים על סמנים ספציפיים אלה, הצלחנו לבודד אוכלוסיות APC דומות ממחסני אדיפוס שונים התואמים את הפנוטיפ של השומן שנצפה ב- PVAT שנבחר 13 . בניסויים שלנו שיפרנו בידול APC על ידי השלמת גורם הצמיחה BMP4. בעבר, Macutea ועמיתיו הראו כי אוכלוסיות APC ספציפיות ממחסני השומן הקרביים היו פעילות BMP פחות מאלו שלתת-עוריים כאשר הם נבדלים, אלא אם כן תוסף התקשורת עם גורמי הצמיחה adipogenic BMP2 או BMP4 12 , 16 , 17 , 18 .
מאז בידוד של תאים בודדים מרקמת השומן קשה בשל שבריריות של התאים, באמצעות MCS מספק שיטה יעילה לבידוד התא במחיר קטן יותר של חומרים מתכלים, ציוד, ומשאבים הכשרה. חשוב לציין כי התשואה של APC יכולה להיות מושפעת מגילו או מגודלו של החיה ומשינויים בטמפרטורת התקשורת וכישלון בשמירה על סביבת בידוד סטרילית. תאים תרבותיים ב normoxia חשוב גם עבור התפשטות בידול 19 , ולכן תחזוקה של תנאי אוויר הדגירה היא חלק אינטגרלי לתרבות. מהירויות צנטריפוגה ניתן להגדיל ל XG 800 אם מספיק כדורי התא לא טופס במהלך tהוא תהליך בידוד. בדיקת תוקף של נוגדנים עשוי גם להיות נחוץ כמו fluorochrome FITC מצומדות יכול להשפיל לאורך זמן. שינוי המון סוג Collagenase אני עשוי גם דורשים שינויים בהליכי העיכול כמו הרבה יכול להשתנות בעוצמה. אם באמצעות מינים שונים מלבד חולדה, סרום ספציפי IgG במאגר חסימה עשוי גם להיות נחוץ אם המין המארחת של הנוגדנים שונה מאלו המשמשים כאן.
בין היתרונות של MCS על FACS הם שזה יותר ריאלי מבחינה כלכלית מאשר FACS כמו ערכות זולים וניתן לרכוש בקלות. זה גם נמנע הרכישה, תחזוקה, ואת האימון השימוש של cytometer זרימה. באמצעות MCS גם מאפשר מחייב ספציפי ללא התאמה של שערים לבחירה ורקע רקע הקרינה.
מגבלה במחקר זה היא כי הוא הסתמך על שני סמנים פני השטח preadipocyte. אחרים סמנים פני השטח של preadipocyte של מחויבות הבדלErentiation, כגון Zfp423, Sca1, ו CD24, זוהו 20 , 21 . סמנים אלה עשויים לזהות במדויק תאי גזע מחויב של פנוטיפים ספציפיים; עם זאת, סמנים פני השטח המשמשים נבחרו מאז תאים להביע סמנים אלה יש את היכולת של גרימת שני פנוטיפים חום ולבן 20 , 21 . מגבלה נוספת של מחקר זה הייתה שימוש סלקטיבי בגורמי גדילה בתרבות APC. גורמי גדילה אחרים היו יעילים באינדוקציה של אדיפוגנזה 22 . תרבות התא במחקר זה הייתה מוגבלת גם על ידי העובדה כי כל התרבות נעשתה צלחות תרבות דו מימדי. למרות זאת היא הנורמה התרבות, תאים in vivo לא להתרבות בדרך זו. תרבויות בסביבות תלת מימדיות עלולות לאפשר היפרפטרופיה נוספת והיפרפלזיה כפי שהיא משכפלת את הצורה הטבעית של הצר השומן23 .
בשל המעשיות והיעילות של השימוש MCS, פרוטוקול זה אידיאלי לבידוד של APC, כמו גם סוגי תאים אחרים PVAT. הליך זה גם מספק דרך יעילה יותר לגרום בידול תרבויות preadipocyte. עלות מינימלית, ציוד, הכשרה הנדרשת מאפשרת שיטה זו כדי לשמש בכל מעבדה המבקשים לבודד תאים על בסיס סמנים פני השטח ספציפיים. יישומים עתידיים עשויים לאפשר בידוד של אוכלוסיות תאים אחרים או שימוש בסמנים תאים ספציפיים יותר. שימוש בקוקטיילים של גורם גדילה במחויבות התא עשוי להיות שימושי בהפעלת תאי גזע
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
המעבדות Contreras ו ווטס וד"ר ויליאם רפאל. ניסויים אלה נתמכו על ידי NHLBI F31 HL128035-01 (רקמות העיכול פרוטוקול תקינה), NHLBI 5R01HL117847-02 ו 2P01HL070687-11A1 (בעלי חיים), ו NHLBI 5R01HL117847-02 (בידוד תאים ותרבות).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC-conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48-Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Stacey, G. in eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
- Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
- Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
- Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
- Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
- Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034 (2015).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
