Summary
Aqui, relatamos um método para o isolamento das populações de células progênitentes de adipócitos (APC) do tecido de tecido adiposo perivascular (PVAT) usando a classificação celular celular ativada por magnética (MCS). Este método permite um maior isolamento de APC por grama de tecido adiposo quando comparado à Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).
Abstract
A expansão do Texo Adiposo Perivascular (PVAT), um importante regulador da função vascular através da sinalização paracrina, está diretamente relacionada ao desenvolvimento da hipertensão durante a obesidade. A extensão da hipertrofia e hiperplasia depende da localização do depósito, do sexo e do tipo de fenótipos da célula progenitora de adipócitos (APC) presente. As técnicas utilizadas para APC e isolamento de pré-adipitos nos últimos 10 anos melhoraram drasticamente a precisão em que as células individuais podem ser identificadas com base em marcadores de superfície celular específicos. No entanto, o isolamento de APC e adipócitos pode ser um desafio devido à fragilidade da célula, especialmente se a célula intacta deve ser retida para aplicações de cultura de células.
A Classificação Celular ativada por magnética ( MCS) fornece um método para isolar um maior número de APC viável por unidade de peso de tecido adiposo. O APC colhido pelo MCS pode ser usado para protocolos in vitro para expandir a preaOs dipócitos e diferenciá-los em adipócitos através do uso de coquetéis de fatores de crescimento, permitindo a análise do potencial prolífico e adipogênico retido pelas células. Este experimento centrou-se nos depósitos de PVAT aórtica e mesentérica, que desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento de doenças cardiovasculares durante a expansão. Esses protocolos descrevem métodos para isolar, expandir e diferenciar uma população definida de APC. Este protocolo MCS permite que o isolamento seja usado em qualquer experiência onde a classificação celular seja necessária com equipamento ou treinamento mínimo. Essas técnicas podem auxiliar experimentos adicionais para determinar a funcionalidade de populações de células específicas com base na presença de marcadores de superfície celular.
Introduction
O Texo Adiposo Perivascular (PVAT), devido à sua proximidade com os vasos sanguíneos, é um importante componente de sinalização paracrina na função vascular 1 . A expansão deste tecido adiposo é dependente do fenótipo das células progenitoras de adipócitos (APC) presentes 2 , 3 . O isolamento de células de tecidos adiposos é difícil, pois os adipócitos primários são frágeis, flutuantes e variam em tamanho. Certas técnicas de isolamento também podem alterar o fenótipo e a morfologia celular aumentando a síntese de proteínas inflamatórias e reduzindo a expressão genética adipogênica 4 , enfatizando a importância de um protocolo que mantenha a integridade das células.
A cultura de células primárias e subpopulações específicas de pré-adipócitos dá uma abordagem reducionista ao crescimento in vivo e mantém uma composição genética celular equivalente 5 , embora funcioneEu com estas células é limitado devido a deterioração com o envelhecimento, ou senescência 6 . Os pré-adipócitos de vários depósitos adiposos, incluindo depósitos subcutâneos e omental, também demonstram diferenças na proliferação 7 , o que enfatiza a importância de coletar células de locais anatômicos específicos. As células precursoras de depósitos adiposos brancos não PVAT foram caracterizadas em estudos anteriores 7 , 8 , 9 , mas menos conhece-se sobre os fenótipos de PVAT APC.
As técnicas aqui descritas permitem a análise de populações de APC específicas e definidas com impacto mínimo na morfologia, viabilidade e potencial de proliferação e diferenciação. A classificação de células ativadas por magnética (MCS) é passível de aplicações a jusante, como a cultura, à medida que as contas se dissolvem sem alterar a célula. MCS também é econômico, e uma vez que o anticorpoAs centralizações foram padronizadas, a necessidade de ensaios de citometria de fluxo é mínima. Estudos in vitro com precursores de PVAT também podem dar um vislumbre do potencial que essas células primárias podem ter.
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Protocol
Todos os procedimentos descritos neste artigo seguem as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal (IACUC) da Michigan State University. Todos os buffers e mídias devem ser protegidos da luz.
1. Preparação de Buffers, Mídia e Instrumentos
- Preparar a solução tampão bicarbonato de Krebs Ringer (KRBB): cloreto de sódio 135 mM, cloreto de potássio 5 mM, sulfato de magnésio 1 mM, dibásico de fosfato de potássio 0,4 mM, glicose 5,5 mM, antibiótico / antimicótico a 1% (10 000 unidades / mL de penicilina, 10 000 μg / Ml de estreptomicina, 25 μg / mL de anfotericina B) e 10 mM de HEPES (pH = 7,4). Esta solução é estável durante 3 semanas quando mantida estéril e a 4 ° C.
- Preparar solução de colagenase tipo 1: 1 mg / mL em KRBB com 4% de albumina de soro bovino (BSA). Esta solução deve ser mantida a 37 ° C e é estável durante 4 h.
- Preparar solução tampão de lise de eritrócitos: cloreto de amônio 154 mM, bicarbonato de potássio 10 mME EDTA 0,1 mM. Mantenha-se a 4 ° C por até um mês.
- Preparar o tampão de bloqueio MCS: Base de mídia DMEM / F12, 10% de soro bovino fetal (FBS), 5% de soro normal de burro, 40 μL / mL de F (ab) Fragmento de Igreja anti-rato de burro. Mantenha-se a 4 ° C por até um mês.
- Preparar Solução tampão MCS: solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH = 7,5), BSA a 0,5% e EDTA 2 mM. Mantenha-se a 4 ° C por até um mês. De-gas solução por aquecimento a 37 ° C em um recipiente de vidro e, em seguida, aplicando um vácuo durante 15 s. Deixe selado selado sem uso.
- Preparar a média basal da fração vascular estromal (SVF): Meio de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM): F12, 15% de soro fetal de vitela (FCS), 1% de antibiótico / antimicótico (10 000 unidades / mL de penicilina, 10 000 μg / mL de estreptomicina, 25 μg / Ml de anfotericina B), bicarbonato de sódio a 44,05 mM, ácido ascórbico 100 uM, biotina 33 μM, pantotenato 17 μM, L-glutamina 2 mM e HEPES 20 mM. Mantenha estéril e a 4 ° C por até 2 semanas.
- Prepare APC &# 160; Mídia: meio basal com fatores de crescimento adicionais incluindo fator de crescimento epidérmico de 10 ng / mL), fator inibidor de leucemia (10 ng / mL), factor de crescimento derivado de plaquetas BB (10 ng / mL) e fator básico de crescimento de fibroblasto ( 5 ng / mL). Mantenha estéril e a 4 ° C por até 2 semanas.
- Preparar o meio de indução de APC: meio de APC com FBS a 10%, insulina de 2,5 μg / mL, 2-isobutil-1-metilaxantina 0,5 mM (IBMX), dexametasona 1 μM e T3 de 200 pM (hormônio da tiróide de triiodotironina). Mantenha estéril e a 4 ° C por até 2 semanas.
2. Isolamento de progenitores de adipócitos
- Anestesiar o rato de acordo com as diretrizes institucionais. Coloque o rato na decúbito dorsal. Confirme a profundidade da anestesia através de uma pitada de dedo do pé e a perda de resposta reflexa a este estímulo doloroso.
NOTA: Este protocolo usa ratos Sprague Dawley de 10 semanas e 70 mg / kg de pentobarbital administrado por meio de uma injeção intraperitoneal. - Faça uma incisão da linha média vertical wCom tesoura ao longo do esterno na área torácica e na área perineal. Acesse a cavidade abdominal e expõe a artéria mesentérica superior, os vasos de resistência mesentérica pequena (mPVAT) e a aorta torácica (aPVAT).
- Segure todas as conexões com o mesentério e a aorta e remova os vasos do animal. Isolar PVAT usando um microscópio de dissecação e placa de Petri preenchida com KRBB para ver os vasos e isolar PVAT.
- Neste experimento, colete gonadal (GON) adiposo para representar um depósito adiposo não-PVAT. Coloque almofadas de gordura isoladas no gelo em KRBB com HEPES 10 mM (pH = 7,4).
- Em um capô de biossegurança, transfira cerca de 50 mg de tecido para um tubo de 1,7 mL com 1 mL de solução de colagenase tipo I e mole com tesoura de tecido (peças de 1 a 3 mm).
- Digerir as amostras incubando a 37 ° C em uma incubadora de rotisserie (ou incubadora com um agitador orbital) durante 1 h. Em uma capa de segurança de biossegurança, filtra o material digerido sequencialmente através de 100 e 40 Μm células em um tubo de 50 mL. Centrifugar o filtrado resultante a 4 ° C durante 10 min a 300 × g.
NOTA: Todas as etapas no protocolo a partir daqui para a frente devem ser realizadas em um capô de biossegurança para manter as células estéreis. - Verter o sobrenadante e ressuspender os grânulos contendo as células SVF em 1 mL de solução de tampão de lise de eritrócitos 1X e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Incubar células durante 5 min à RT protegido da luz e centrifugar a 4 ° C durante 5 min a 300 x g.
- Despeje o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular restante em SVF Basal Media. Coletar uma sub-amostra de 20 μL para contar células vivas com solução Trypan Blue.
NOTA: O número de células SVF que podem ser isoladas variará de acordo com o site. Os números médios de SVF colhidos por mg de tecido são: aPVAT = 5,0 ± 2,0x10 3 , mPVAT = 1,04 ± 0,62x10 4 , GON = 2,4 ± 1,2x10 5 .
3. Classificação de células activadas por magnéticas
_content "> NOTA: isole APC de SVF com base em marcadores de superfície de células CD34 e PDGFRα executando todos os passos a 4 ° C.- Células de rotação durante 5 min a 300 x g. Verter o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular no tampão de bloqueio MCS a 1 x 10 6 células / mL e incubar durante 20 min.
NOTA: As suspensões de células de 1 x 10 6 - 2 x 10 8 células / mL podem ser separadas de forma eficaz. - Incubar células com 5 μL de FITC-conjugated Mouse anti-CD34 (1 μg / 1 x 10 6 células) durante 30 minutos a 4 ° C. Células de rotação durante 5 min a 300 xg e 4 ° C.
- Incube com 4 μL de microbejas anti-FITC e 96 μL de tampão MCS (volume total de 100 μL) durante 5 min a 4 ° C no escuro para separar células CD34 + e CD34.
- Anexe o separador magnético ao suporte e coloque a coluna MultiSort (MS), com as asas da coluna para a frente, no separador. Coloque um 5 mLTubo de recolhimento sob a coluna MS no suporte do tubo superior.
- Prepare a coluna MS por enxágüe com a solução tampão MCS. Aplique 500 μL de MCS Buffer em cima da coluna e deixe o buffer passar. Descarte o efluente e mude o tubo de recolha.
- Carregue a suspensão celular marcada com anticorpo na coluna de MS preparada. Recolher fluxo através de células não marcadas.
- Lavar a coluna MS com 500 μL de tampão MCS desgaseificado 3x. Recolher células não marcadas que passam e combinam com o fluxo através do passo anterior.
- Remova MS Column do separador magnético e coloque-o sobre um novo tubo de coleta. Pipetar 1 mL de tampão MCS na coluna MS. Inflame imediatamente a fração com as células marcadas magnéticamente com firmeza, mas lentamente, aplicando o êmbolo fornecido com a coluna para não permitir o excesso de gás na coluna.
NOTA: números de células isolados variam de acordo com o site. Números médios de CD34 + APC isolados da população SVF porMg de tecido são: aPVAT = 2,6 ± 0,43x10 2 , mPVAT = 9,6 ± 1,4x10 2 , GON = 1,3 ± 0,22x10 3 . - Células de rotação durante 5 min a 300 × g e 4 ° C. Incubar a fração CD34 + coletada em 10 μL de uma solução 1: 200/1 x 10 6 células Coelho anti-PDGFRa durante 30 min a 4 ° C.
- Centrifugue as células novamente durante 5 min a 300 xg e 4 ° C. Incubar células marcadas com 4 μL de microbipas IgG anti-coelho e 96 μL de tampão MCS repetindo os passos 3.3 a 3.7 para isolar.
NOTA: números de células isolados variam de acordo com o site. Os números médios de PDGFRα + APC isolados da população CD34 + por mg de tecido são: aPVAT = 2,4 ± 0,64, mPVAT = 8,4 ± 2,4, GON = 10,4 ± 1,9, o que é de 0,5 a 10% da população previamente isolada.
- Centrifugue as células novamente durante 5 min a 300 xg e 4 ° C. Incubar células marcadas com 4 μL de microbipas IgG anti-coelho e 96 μL de tampão MCS repetindo os passos 3.3 a 3.7 para isolar.
4. Cultura celular e adipogênese Indução
- Cultura do SVFE APC em placas de cultura de tecidos de 6 poços em meio basal com substituição a cada 2 dias. Após 3 passagens em série, placa em placas de cultura de tecido preta de 96 poços a 1x10 2 células / poço para ensaios de proliferação, que são avaliados a 8, 24, 48 e 96 h, e a 50 000 células / poço em placas de 24 poços ou 10 000 células / poço em placas de cultura de tecidos de 48 poços para ensaios de adipogênese, que são qualitativos e quantitativos.
- Suplementar a mídia basal APC por 48 h pós-confluência e antes da indução com a proteína morfogênica óssea 4 (3,3 nmol / L) conforme indicado 10 para a diferenciação. Induzir células após 48 h de confluência 100% (dia 0) usando o meio de indução APC para incubar as células.
- Após 48 h, mude de mídia para manter as células na mídia de indução APC sem IBMX e dexametasona, durante 14 dias com mudanças de mídia a cada 48 h.
- Isolamento MCS validado pela FACS.
- Pegue uma sub-amostra de 50 μL (50.000 células) de separação magnéticaCélulas e lavar com solução FACS.
- Centrifugar as células e ressuspender em 100 μL de uma solução 1: 1000 de IgG Dylight 405 anti-coelho de burro para marcar as células PDGFRα + . Incubar durante 30 minutos protegido da luz e a 4 ° C.
- Lavar as células e ressuspender em 200 μL de solução de formaldeído a 2% até o tempo para análise usando filtros de 488 nm (FITC) e 405 nm (Dylight 405) em um citómetro de fluxo.
NOTA: A acumulação de lipídios por células cultivadas é avaliada quantitativamente usando um ensaio de fluorescência de adipogênese lipofílica em um leitor de microplacas que mede a fluorescência e usando pré-adipócitos como calibradores para o acúmulo de lipídios. O acúmulo de lípidos também é medido qualitativamente pela coloração e imagem de corante lipídico realizada em um microscópio invertido equipado com uma câmera, tornando a percentagem de células totais que contêm ou não contêm lipídios observáveis. Qualquer leitor de placas capaz de medir a fluorescência com excitação a 485 nm e a emissão em 572Nm é adequado para análise, bem como qualquer microscópio com uma câmera capaz de capturar imagens digitais.
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Representative Results
A capacidade proliferativa de pré-adipócitos eo potencial adipogênico de precursores de adipócitos são características que são mantidas in vitro 11 . A proliferação in vitro de SVF isolada e APC de aPVAT, mPVAT e GON de ratos machos foi avaliada em 8, 24, 48 e 96 h após o revestimento usando um ensaio quantitativo de DNA. Não foram observadas diferenças de local na taxa de expansão de SVF em qualquer ponto do tempo, exceto para o APC de aPVAT, que teve menos proliferação por 96 h em comparação com células de SVF do mesmo site ( Figura 1 ).
A APC confluente estimulada com Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) durante 48 h antes da indução padrão 12 apresentou diferenciação. Isto foi evidente pela maior acumulação de lípidos nas gotículas avaliadas por ambos os ensaios de absorção de lípidos fluorescentes ( Figura 2A ) e coloração Óleo Vermelho O ( Figura 2 B ).
Ao comparar o rendimento da APC, o isolamento MCS produziu um maior número de células prontas para cultura em comparação com FACS. ( Figura 3 ) Importante, a distribuição e viabilidade das populações de APC (CD34 + e PDGFRα + ) foi semelhante entre MCS e FACS. A viabilidade celular determinada pela coloração de Trypan Blue para o isolamento do tempo de contagem foi semelhante para ambos os procedimentos de isolamento (FACS = 71,57% ± 11,09; MCS = 79,25% ± 7,47). Esses dados demonstram que o isolamento MCS da APC produz um maior número de APC viáveis em comparação com MCS.
Figura 1 : Proliferação in Vitro do anúncioAs células progenitoras de ipócitos (APC) são afetadas pela localização anatômica. A fração vascular estromal (SVF) e APC foram isoladas do tecido adiposo perivascular aórtico e mesentérico (aPVAT e mPVAT, respectivamente) e adiposa gonadal de ratos machos de 10 semanas de idade. A proliferação de células foi medida por um ensaio de quantificação de DNA a 8, 24, 48 e 96 horas após a semeadura. Os dados são expressos como aumento da dobra em 8 horas de linha base ± SEM (N = 4). A significância é indicada por * (P <0,05). Figura modificada de Contreras et al . 2016 13 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 2 : células progenitoras de adipócitos (APC) não apresentam variação em diferentiaCapacidades de conversão entre depósitos, mas maior acumulação de lípidos em comparação com a fração vascular estromal (SVF). As células foram induzidas após 48 h de confluência e exposição a BMP4, seguidas de 48 h de exposição a dexametasona e 3-isobutil-1-metilxantina e depois mantidas em meios de manutenção 14 dias com alterações de mídia a cada 48 h. ( A ) Ensaio de absorção lipídica de APC diferenciado com dados expressos como proporção de pré-adipócitos indiferenciados: adipócitos diferenciados (pré-adipócitos: adipócitos) em unidades de fluorescência relativa (RFU) ± SEM (N = 4). ( B ) Coloração Óleo Vermelho O (ORO) de APC e SVF com dados expressos em porcentagem de células com lipídios (absorção de ORO) ± SEM (N = 4). A significância é indicada por * (P <0,05). Figura modificada de Contreras et al. 2016 13 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 3 : O rendimento de isolamento de células progenitoras de adipócitos viáveis (APC) é melhorado pela classificação de células ativadas por magneto (MCS). Expressão do marcador de superfície de CD34 + ( A ) e PDGFRα + ( B ) em SVF isolada de tecidos adiposos perivasculares (aórtica = aPVAT; mesentérica = mPVAT) usando MCS e FACS. Os dados são expressos como número médio de células isoladas a partir de 50 mg de tecido ± SEM (N = 4). A significância é indicada por * (P <0,05). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
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Discussion
O foco central do presente experimento é o isolamento, expansão e adição adipogênica de APC de depósitos de PVAT. Aqui apresentamos um protocolo para o isolamento de APC com base na identificação de células que expressam os marcadores de superfície CD34 e PDGFRα. Estas proteínas de superfície foram previamente identificadas em APC com altas taxas de proliferação e o potencial para se diferenciar em adipócitos brancos ou marrons em vários depósitos adiposos 14 , 15 . Ao selecionar células com base nesses marcadores específicos, conseguimos isolar populações APC semelhantes de vários depósitos adiposos que combinam o fenótipo adipócito que é observado no PVAT selecionado 13 . Em nossas experiências, melhoramos a diferenciação de APC, complementando o fator de crescimento BMP4. Anteriormente, Macotela e colegas demonstraram que as populações APC específicas dos depósitos adiposos viscerais tinham menos atividade de BMP do que as deDepósitos subcutâneos quando diferenciados a menos que o meio de cultura foi suplementado com os fatores de crescimento adipogênicos BMP2 ou BMP4 12 , 16 , 17 , 18 .
Uma vez que o isolamento de células individuais do tecido adiposo é difícil devido à fragilidade das células, o uso de MCS fornece um método eficiente para isolamento de células a um custo menor de consumíveis, equipamentos e recursos de treinamento. É importante notar que o rendimento de APC pode ser afetado pela idade ou tamanho do animal e por mudanças na temperatura da mídia e falta de manutenção de um ambiente de isolamento estéril. As células de cultivo na normoxia também são importantes para a proliferação e diferenciação 19 , portanto, a manutenção das condições do ar de incubação é parte integrante da prática cultural. As velocidades de centrifugação podem ser aumentadas para 800 xg se não forem formadas pastilhas celulares suficientes durante tO processo de isolamento. Verificando a expiração dos anticorpos também pode ser necessário à medida que o fluorocromo FITC conjugado pode se degradar ao longo do tempo. Alterar muitos tipos de colagenase tipo I também podem exigir alterações nos procedimentos de digestão, pois os lotes podem variar em potência. Se estiver usando uma espécie diferente do rato, o soro específico e IgG no tampão de bloqueio também podem ser necessários se as espécies hospedeiras dos anticorpos forem diferentes das usadas aqui.
Entre as vantagens da MCS sobre FACS, é que é mais economicamente viável do que FACS, pois os kits são baratos e podem ser facilmente comprados. Isso também evita a compra, manutenção e treinamento de uso de um citómetro de fluxo. O uso de MCS também permite a ligação específica sem ajuste de portões para seleção e envolvimento de fluorescência em segundo plano.
Uma limitação a este estudo é que se baseou em dois marcadores de superfície pré-adipócitos. Outros marcadores de superfície pré-adipócitos de compromisso e diferençaA erentiação, como Zfp423, Sca1 e CD24, foram identificadas 20 , 21 . Esses marcadores podem identificar com precisão células progenitoras adipócitas comprometidas de fenótipos específicos; No entanto, os marcadores de superfície utilizados aqui foram selecionados uma vez que as células que expressam esses marcadores têm a capacidade de induzir fenótipos marrom e branco 20 , 21 . Outra limitação deste estudo foi o uso seletivo de fatores de crescimento na cultura APC. Outros cofres de fatores de crescimento foram eficazes na indução da adipogênese 22 . A cultura celular neste estudo também foi limitada pelo fato de que toda a cultura foi feita em placas de cultura bidimensionais. Embora esta seja a norma da cultura, as células in vivo não proliferam dessa maneira. A cultura em ambientes tridimensionais pode permitir uma maior hipertrofia e hiperplasia, uma vez que replica a forma natural da fase adiposaRucture 23 .
Devido à praticidade e eficiência do uso do MCS, este protocolo é ideal para o isolamento da APC, bem como outros tipos de células em PVAT. Este procedimento também fornece uma maneira mais efetiva de induzir a diferenciação em culturas pré-adipócitos. O custo, o equipamento e o treinamento mínimos exigidos permitem que este método seja usado em qualquer laboratório que deseje isolar células com base em marcadores de superfície específicos. Futuras aplicações podem permitir o isolamento de outras populações celulares ou o uso de marcadores celulares mais específicos. O uso de coquetéis de fatores de crescimento no comprometimento celular pode ser útil na ativação de células-tronco
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os laboratórios Contreras e Watts e o Dr. William Raphael. Essas experiências foram suportadas por NHLBI F31 HL128035-01 (padronização do protocolo de digestão tecidual), NHLBI 5R01HL117847-02 e 2P01HL070687-11A1 (animais) e NHLBI 5R01HL117847-02 (isolamento e cultura de células).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC-conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48-Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
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