Summary
هنا نحن تقرير طريقة لعزل الخلايا خلية خلية خلية (أبك) من الأنسجة الدهنية حول الأوعية (بفات) باستخدام المغناطيسي تنشيط الخلايا فرز (مكس). هذا الأسلوب يسمح لزيادة عزل أبك لكل غرام من الأنسجة الدهنية بالمقارنة مع مضان تنشيط الخلايا الفرز (فاكس).
Abstract
توسع الأنسجة الدهنية حول الأوعية (بفات)، وهو منظم رئيسي لوظيفة الأوعية الدموية من خلال الإشارات باراكرين، يرتبط ارتباطا مباشرا بتطور ارتفاع ضغط الدم أثناء السمنة. مدى تضخم وتضخم يعتمد على موقع مستودع، والجنس، ونوع من الخلايا السليفة خلية خلية (أبك) الظواهر الحالية. التقنيات المستخدمة ل أبك و برياديبوسيتس العزلة في السنوات ال 10 الماضية قد تحسنت بشكل كبير في دقة الخلايا الفردية التي يمكن تحديدها على أساس محدد علامات سطح الخلية. ومع ذلك، فإن عزل أبك والشحميات يمكن أن يكون تحديا بسبب هشاشة الخلية، وخاصة إذا كان يجب الاحتفاظ الخلية سليمة لتطبيقات زراعة الخلايا.
يوفر تنشيط الخلايا المغناطيسي ( مكس) طريقة لعزل عدد أكبر من أبك قابلة للحياة في وحدة الوزن من الأنسجة الدهنية. أبك تحصدها مكس يمكن استخدامها لبروتوكولات في المختبر لتوسيع برياديبوسيتس والتفريق بينها في الخلايا الشحمية من خلال استخدام الكوكتيلات عامل النمو مما يسمح لتحليل إمكانات غزير و أديبوجينيك الاحتفاظ بها من قبل الخلايا. وركزت هذه التجربة على المستودعات الباطنية المساريقية الأبهرية، والتي تلعب أدوارا رئيسية في تطوير أمراض القلب والأوعية الدموية أثناء التوسع. تصف هذه البروتوكولات طرق لعزل، توسيع، وتمييز مجموعة محددة من أبك. هذا البروتوكول مكس يسمح العزلة لاستخدامها في أي تجربة حيث الفرز الخلية هو مطلوب مع الحد الأدنى من المعدات أو التدريب. هذه التقنيات يمكن أن تساعد المزيد من التجارب لتحديد وظائف السكان خلية محددة على أساس وجود علامات سطح الخلية.
Introduction
الأنسجة الدهنية حول الأوعية (بفات)، نظرا لقربها من الأوعية الدموية، هو عنصر باراكرين إشارة رئيسية في وظيفة الأوعية الدموية 1 . التوسع في هذا النسيج الدهني يعتمد على النمط الظاهري للخلايا خلية الخلايا الشحمية (أبك) الحاضر 2 ، 3 . عزل الخلايا من الأنسجة الدهنية أمر صعب كما الخلايا الشحمية الأولية هشة، مزدهرة، ومدى في الحجم. بعض تقنيات العزلة يمكن أيضا تغيير النمط الظاهري الخلية والمورفولوجيا عن طريق زيادة تخليق البروتين الالتهابي والحد من التعبير الجيني أديبوجينيك 4 ، مؤكدا على أهمية بروتوكول يحافظ على سلامة الخلايا.
ثقافة الخلايا الأولية والقطاعات الفرعية برياديبوسيت محددة يعطي نهج الاختزال في نمو الجسم الحي ويحافظ على ما يعادل التركيب الخلوي الخلوي 5 ، على الرغم من أن العمل تيلي مع هذه الخلايا محدودة بسبب تدهور مع الشيخوخة، أو الشيخوخة 6 . وتظهر الخلايا المسبقة من المستودعات الدهنية المختلفة، بما في ذلك المستودعات تحت الجلد والمستودعات، اختلافات في الانتشار 7 ، مما يؤكد أهمية جمع الخلايا من مواقع تشريحية محددة. وقد اتسمت الخلايا السلائف من غير بفات مستودعات الدهنية البيضاء في الدراسات السابقة 7 ، 8 ، 9 ، ولكن أقل هو معروف عن المظاهر بفات أبك.
التقنيات الموصوفة هنا تسمح لتحليل السكان محددة ومحددة أبك مع تأثير ضئيل على مورفولوجيا، وقابلية البقاء، وإمكانية التكاثر والتمييز. تصنيف الخلايا المغناطيسية تنشيط (مكس) هو قابل للتطبيقات المصب، مثل الثقافة، وحبات تذوب دون تغيير الخلية. مكس هو أيضا اقتصادية، وبمجرد أن يخدع الأجسام المضادةوقد تم توحيد الترآيزات، والحاجة إلى المقايسات التدفق الخلوي هو الحد الأدنى. في الدراسات المختبرية مع السلائف بفات يمكن أيضا إعطاء لمحة عن احتمال أن هذه الخلايا الأولية قد يكون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات الموضحة في هذه الورقة تتبع المبادئ التوجيهية التي وضعتها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إاكوك) من جامعة ولاية ميشيغان. وينبغي حماية جميع المخازن المؤقتة ووسائل الإعلام من الضوء.
1. إعداد المخازن المؤقتة، وسائل الإعلام، والأدوات
- إعداد كريبس قارع الأجراس بيكربونات-مخزنة الحل (كرب): 135 ملي كلوريد الصوديوم، 5 ملي كلوريد البوتاسيوم، 1 ملم كبريتات المغنيسيوم، 0.4 ملي فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة، 5.5 ملي الجلوكوز، 1٪ المضادات الحيوية / أنتيميكوتيك (10،000 وحدة / مل البنسلين، 10000 ميكروغرام / مل ستربتوميسين، 25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B)، و 10 ملي هيبيس (الرقم الهيدروجيني = 7.4). هذا الحل هو مستقر لمدة 3 أسابيع عندما تبقى معقمة وعند 4 درجات مئوية.
- إعداد كولاجيناز نوع 1 الحل: 1 ملغ / مل في كرب مع 4٪ مصل البقري المصل (بسا). وينبغي أن يبقى هذا الحل عند 37 درجة مئوية ومستقر لمدة 4 ساعات.
- إعداد كريات الدم الحمراء تحلل العازلة الحل: 154 ملي كلوريد الأمونيوم، 10 ملي بيكربونات البوتاسيوم، و 0.1 ملي إدتا. إبقاء في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- إعداد مكس حظر العازلة: دمم / F12 قاعدة وسائل الإعلام، 10٪ مصل بقري الجنين (فبس)، 5٪ مصل حمار العادي، 40 ميكرولتر / مل F (أب) جزء حمار مكافحة الجرذ مفتش. إبقاء في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- إعداد مكس العازلة الحل: الفوسفات مخزنة المالحة (بس، الرقم الهيدروجيني = 7.5)، 0.5٪ بسا، و 2 ملي إدتا. إبقاء في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. حل دي الغاز عن طريق التسخين إلى 37 درجة مئوية في وعاء زجاجي ثم تطبيق فراغ for15 ق. ترك غير المستخدمة مخزنة مختومة.
- (سفف) باسال ميديا: Dulbecco's-تعديل النسور المتوسطة (دمم): F12، 15٪ مصل عجل الجنين (فس)، 1٪ المضادات الحيوية / أنتيميكوتيك (10،000 وحدة / مل البنسلين، 10000 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B)، 44.05 ملي بيكربونات الصوديوم، و 100 ميكرومتر حمض الاسكوربيك، 33 ميكرومتر البيوتين، 17 ميكرومتر بانتوثينات، 2 ملي L- الجلوتامين، و 20 ملي هيبيس. الحفاظ على العقيمة و 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
- إعداد أبك &# 160؛ وسائل الإعلام: وسائل الإعلام القاعدية مع عوامل نمو إضافية بما في ذلك عامل نمو البشرة 10 نانوغرام / مل)، عامل تثبيط اللوكيميا (10 نانوغرام / مل)، عامل النمو المشتقة من الصفيحات بب (10 نانوغرام / مل)، وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية 5 نانوغرام / مل). الحفاظ على العقيمة و 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
- إعداد وسائل الإعلام أبك التعريفي: أبك وسائل الإعلام مع 10٪ فبس، 2.5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 0.5 ملي 2-ايزوبيوتيل-1-ميثيلاكسانثين (عبكس)، 1 ميكرومتر ديكساميثازون، و 200 P3 T3 (هرمون الغدة الدرقية تريودوثيرونين). الحفاظ على العقيمة و 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
2. أديبوسيت الأسلاف العزلة
- تخدير الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. وضع الفئران في الاستلقاء الظهري. تأكيد عمق التخدير عن طريق اصبع القدم قرصة وفقدان رد الفعل لا ارادي لهذا التحفيز المؤلم.
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول 10 عاما سبراغ داولي الفئران و 70 ملغ / كغ من بينتوباربيتال تسليمها عن طريق الحقن داخل الصفاق. - جعل شق خط الوسط الرأسي ثإيث مقص على طول القص في المنطقة الصدرية ومنطقة العجان. الوصول إلى تجويف البطن وفضح الشريان المساريقي العلوي، وأوعية المقاومة المساريقي الصغيرة (مبفات) والشريان الأورطي الصدري (آبفات).
- قطع جميع الاتصالات إلى المساريقي والشريان الأورطي وإزالة السفن من الحيوان. عزل بفات باستخدام المجهر تشريح وطبق بتري مليئة كرب لعرض السفن وعزل بفات.
- في هذه التجربة، وجمع غونادال (غون) الدهنية لتمثيل مستودع الدهنية غير بفات. وضع منصات الدهون معزولة على الجليد في كرب مع 10 ملي هيبيس (الرقم الهيدروجيني = 7.4).
- في غطاء السلامة الأحيائية، ونقل حوالي 50 ملغ من الأنسجة إلى أنبوب 1.7 مل مع 1 مل من حل كولاجيناز نوع I واللحم المفروم مع مقص الأنسجة (1 - 3 ملم قطعة).
- هضم العينات عن طريق احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة المشواة (أو حاضنة مع شاكر المداري) لمدة 1 ساعة. في غطاء السلامة الأحيائية، مرشح بالتسلسل هضم المواد من خلال 100 و 40 مصافي الخلية ميكرون في أنبوب 50 مل. الطرد المركزي الناتج الترشيح في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة في 300 × ز.
ملاحظة: جميع الخطوات في البروتوكول من هنا إلى الأمام هي التي يتعين القيام بها في غطاء السلامة الحيوية للحفاظ على الخلايا العقيمة. - صب قبالة طاف و ريسوسبيند الكريات التي تحتوي على الخلايا سفف في 1 مل من 1X كريات الدم الحمراء تحلل العازلة الحل ونقل إلى أنبوب ميكروفوج 1.7 مل. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في رت محمية من الضوء وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
- صب قبالة طاف و ريسوسبيند المتبقية بيليه الخلية في سفف بسال وسائل الإعلام. جمع 20 ميكرولتر عينة فرعية لحساب الخلايا الحية مع تريبان الحل الأزرق.
ملاحظة: عدد الخلايا سفف التي يمكن عزلها تختلف حسب الموقع. متوسط عدد سفف تحصد في ملغ من الأنسجة هي: أبفات = 5.0 ± 2.0x10 3 ، مبفات = 1.04 ± 0.62x10 4 ، غون = 2.4 ± 1.2x10 5 .
3. المغناطيسي تنشيط الخلايا الفرز
_content "> ملاحظة: عزل أبك من سفف على أساس CD34 و PDGFRα علامات سطح الخلية عن طريق تنفيذ جميع الخطوات في 4 درجات مئوية.- تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 × ز. صب قبالة طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في مكس حظر العازلة في 1 × 10 6 خلايا / مل واحتضان لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: تعليق خلية من 1 × 10 6 - 2 × 10 8 خلايا / مل يمكن فصلها على نحو فعال. - احتضان الخلايا مع 5 ميكرولتر من فيتس مترافق ماوس مكافحة CD34 (1 ميكروغرام / 1 × 10 6 خلايا) لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 x ج و 4 درجة مئوية.
- احتضان مع 4 ميكرولتر من ميكروبلات مكافحة فيتس و 96 ميكرولتر من العازلة مكس (إجمالي حجم 100 ميكرولتر) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في الظلام لفصل CD34 + و CD34 - الخلايا.
- إرفاق فاصل المغناطيسي إلى موقف ووضع عمود مولتيسورت (مس)، مع أجنحة العمود إلى الأمام، في فاصل. وضع 5 ملأنبوب جمع تحت عمود مس في حامل أنبوب العلوي.
- إعداد مس العمود عن طريق الشطف مع مكس العازلة الحل. تطبيق 500 ميكرولتر من مكس العازلة على رأس العمود والسماح تشغيل العازلة من خلال. تجاهل النفايات السائلة وتغيير أنبوب جمع.
- تحميل الأجسام المضادة تعليق تعليق الخلية على مس إعداد العمود. جمع تدفق من خلال تحتوي على الخلايا غير المسماة.
- غسل مس عمود مع 500 ميكرولتر من مكس التفريغ العازلة 3X. جمع الخلايا غير المسماة التي تمر من خلال والجمع مع تدفق من خلال من الخطوة السابقة.
- إزالة مس العمود من فاصل المغناطيسي ووضعه على أنبوب جمع جديد. ماصة 1 مل من مكس المخزن المؤقت على عمود مس. على الفور مسح جزء مع الخلايا المسمى مغناطيسيا بحزم، ولكن ببطء، وتطبيق المكبس الموردة مع العمود لعدم السماح الغاز الزائد في العمود.
ملاحظة: سوف تختلف أرقام الخلايا المعزولة حسب الموقع. متوسط عدد CD34 + أبك معزولة عن السكان سفف لكلملغ من الأنسجة هي: أبفات = 2.6 ± 0.43x10 2 ، مبفات = 9.6 ± 1.4x10 2 ، غون = 1.3 ± 0.22x10 3 . - تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 × ز و 4 درجة مئوية. احتضان CD34 + جزء جمعها في 10 ميكرولتر من 1: 200 حل / 1 × 10 6 خلايا الأرنب المضادة PDGFRα لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- خلايا الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 300 x ج و 4 درجة مئوية. احتضان الخلايا المسمى مع 4 ميكرولتر من ميكروبلات المضادة للأرنب مفرق و 96 ميكرولتر من العازلة مكس بتكرار الخطوات من 3.3 إلى 3.7 لعزل.
ملاحظة: سوف تختلف أرقام الخلايا المعزولة حسب الموقع. متوسط عدد PDGFRα + أبك المعزول من السكان CD34 + لكل ملغ من الأنسجة هي: أبفات = 2.4 ± 0.64، مبفات = 8.4 ± 2.4، غون = 10.4 ± 1.9، وهو 0.5 - 10٪ من السكان المعزولين سابقا.
- خلايا الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 300 x ج و 4 درجة مئوية. احتضان الخلايا المسمى مع 4 ميكرولتر من ميكروبلات المضادة للأرنب مفرق و 96 ميكرولتر من العازلة مكس بتكرار الخطوات من 3.3 إلى 3.7 لعزل.
4. خلية الثقافة و أديبوجينيسيس التعريفي
- ثقافة سففو أبك في 6-حسنا لوحات زراعة الأنسجة في وسائل الإعلام القاعدية مع استبدال كل يومين. بعد 3 المقاطع التسلسلية، لوحة في الأسود 96-جيدا لوحات زراعة الأنسجة في 1x10 2 خلايا / جيدا لفحوصات الانتشار، والتي يتم تقييمها في 8، 24، 48، و 96 ساعة، وفي 50،000 خلية / جيدا في لوحات 24 جيدا أو 10000 خلية / جيدا في 48-جيدا لوحات زراعة الأنسجة لمقايسات أديبوجينيسيس، والتي هي النوعية والكمية.
- الملحق أبك وسائل الاعلام القاعدية لمدة 48 ساعة بعد كونفلنسي وقبل الاستقراء مع بروتين العظام المورفوجني 4 (3.3 نانومول / لتر) كما هو مبين 10 للتمايز. إغناء الخلايا بعد 48 ساعة من 100٪ كونفلنسي (يوم 0) باستخدام وسائل الإعلام التعريفي أبك لاحتضان الخلايا.
- بعد 48 ساعة، تغيير وسائل الإعلام للحفاظ على الخلايا في وسائل الإعلام أبك التعريفي دون عبكس و ديكساميثازون، لمدة 14 يوما مع تغيرات وسائل الإعلام كل 48 ساعة.
- مكس التحقق من صحة نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- خذ 50 ميكرولتر (50،000 خلية) عينة فرعية من فصل مغناطيسياوتغسل مع حل فاكس.
- خلايا الطرد المركزي و ريسوسبيند في 100 ميكرولتر من حل 1: 1000 من حمار المضادة للأرنب مفتش ديليت 405 لتسمية PDGFRα + الخلايا. احتضان لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء وعند 4 درجات مئوية.
- غسل الخلايا و ريسوسبيند في 200 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد 2٪ حتى الوقت للتحليل باستخدام 488 نانومتر (فيتس) و 405 نانومتر (ديليت 405) مرشحات على مقياس التدفق الخلوي.
ملاحظة: يتم تقييم تراكم الدهون بواسطة الخلايا المستزرعة كميا باستخدام مقايسة مضان للدهون أديبوجينيسيس في قارئ ميكروبلات قياس مضان واستخدام برياديبوسيتس كما معايرة لتراكم الدهون. ويقاس تراكم الدهون أيضا نوعيا من قبل تلطيخ صبغ الدهون والتصوير أجريت على المجهر مقلوب مجهزة الكاميرا، مما يجعل نسبة من الخلايا الكلية التي تفعل أو لا تحتوي على الدهون يمكن ملاحظتها. أي قارئ لوحة قادرة على قياس مضان مع الإثارة في 485 نانومتر والانبعاثات في 572نانومتر هو مناسبة للتحليل وكذلك أي المجهر مع كاميرا قادرة على التقاط الصور الرقمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
القدرة التكاثري لل برياديبوسيتس وإمكانات أديبوجينيك السلائف خلية شحمية هي الخصائص التي يتم الاحتفاظ بها في المختبر 11 . تم تقييم انتشار المختبر من سفف معزولة و أبك من أبفات، مبفات، وحكومة نيبال من الفئران الذكور في 8، 24، 48، و 96 ساعة بعد الطلاء باستخدام فحص الحمض النووي الكمي. لم يلاحظ أي اختلافات في الموقع في معدل التوسع سفف في أي نقطة زمنية باستثناء أبك من أبفات، التي كان أقل انتشارا 96 ساعة بالمقارنة مع الخلايا سفف من نفس الموقع ( الشكل 1 ).
متجانس أبك حفز مع بروتين العظام مورفوجينيك 4 (BMP4) لمدة 48 ساعة قبل الحث القياسية 12 عرضت التمايز. وكان هذا واضحا من خلال تراكم الدهون أكبر في قطرات كما يقيمها كل من الفلورسنت فحص امتصاص الدهون ( الشكل 2A ) والنفط الأحمر O تلطيخ ( الشكل 2 B ).
عند مقارنة العائد من أبك، أسفرت العزلة مكس أكبر عدد من الخلايا جاهزة للثقافة مقارنة فاكس. ( الشكل 3 ) والأهم من ذلك، كان توزيع وبقاء السكان أبك (CD34 + و PDGFRα + ) مماثلة بين مكس و فاكس. كانت قابلية الخلية التي يحددها تلطيخ تريبان الأزرق لحساب عد العزلة مشابهة لكل من إجراءات العزل (فاكس = 71.57٪ ± 11.09؛ مكس = 79.25٪ ± 7.47). وتظهر هذه البيانات أن عزل مكس من أبك يعطي عددا أكبر من أبك قابلة للحياة بالمقارنة مع مكس.
الشكل 1 : في انتشار المختبر من الإعلانالخلايا المتأثرة خلية (أبك) يتأثر الموقع التشريحي. تم عزل جزء من الأوعية الدموية اللحمية (سفف) و أبك من الأنسجة الدهنية الأوعية المحيطة بالأوعية الدموية و المساريقي (أبفات و مبفات، على التوالي) والأدوية الغدد التناسلية من الفئران الذكور من العمر 10 أسبوع. تم قياس انتشار الخلايا عن طريق الفحص الكمي الحمض النووي في 8، 24، 48، و 96 ساعة نقاط بعد البذر. وتعبر البيانات عن زيادة أضعاف أكثر من 8 ساعات خط الأساس ± سيم (N = 4). يشار إلى الأهمية ب * (P <0.05). الشكل المعدل من كونتريراس إت آل . 2016 13 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : الخلايا المؤلفة خلية شحمية (أبك) تظهر أي اختلاف في ديفيرنتياتيشنولوغي بين المستودعات ولكن تراكم الدهون الأكبر مقارنة مع سترومال الجزء الوعائي (سفف). تم تحريض الخلايا بعد 48 ساعة من كونفلنسي والتعرض ل BMP4 تليها 48 ساعة من التعرض ل ديكساميثازون و 3-أيزوبيوتيل-1-ميثيلكسانثين وثم استمر في وسائل الصيانة 14 يوما مع تغير وسائل الإعلام كل 48 ساعة. ( A ) فحص امتصاص الدهون من أبك متباينة مع البيانات عن نسبة برياديبوسيتس غير متمايزة: الخلايا الشحمية متباينة (برياديبوسيتس: أديبوسيتس) في وحدات مضان النسبية (رفو) ± سيم (N = 4). ( B ) النفط الأحمر O (أورو) تلطيخ أبك و سفف مع البيانات المعبر عنها كنسبة مئوية من الخلايا مع الدهون (أورو امتصاص) ± سيم (N = 4). يشار إلى الأهمية ب * (P <0.05). الشكل المعدل من كونتريراس إت آل. 2016 13 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : يتم تحسين عائد العزلة من الخلايا السلفية خلية صالحة للحياة (أبك) بواسطة المغناطيسي تنشيط الخلايا فرز (مكس). تعبير علامة سطحية من CD34 + ( A ) و PDGFRα + ( B ) في سفف معزولة من الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية (الأبهر = أبفات؛ المساريقي = مبفات) باستخدام مكس و فاكس. وتعبر البيانات عن متوسط عدد الخلايا المعزولة من 50 ملغ من الأنسجة ± سيم (N = 4). يشار إلى الأهمية ب * (P <0.05). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التركيز الرئيسي من التجربة الحالية هو العزلة، والتوسع، وتحريض أديبوجينيك من أبك من مستودعات بفات. هنا نقدم بروتوكول لعزل أبك على أساس تحديد الخلايا معربا عن علامات سطح CD34 و PDGFRα. تم تحديد هذه البروتينات السطحية سابقا على أبك مع معدلات انتشار عالية وإمكانية التفريق إلى الخلايا الشحمية البيضاء أو البني في مختلف المستودعات الدهنية 14 ، 15 . عن طريق اختيار الخلايا على أساس هذه علامات محددة، كنا قادرين على عزل السكان أبك مماثلة من مستودعات الدهنية متعددة التي تتطابق مع النمط الظاهري خلية شحمية التي لوحظت في بفات اختيار 13 . في تجاربنا قمنا بتحسين التمايز أبك عن طريق استكمال عامل النمو BMP4. في السابق، أظهرت ماكوتيلا وزملاؤه أن السكان أبك محددة من المستودعات الدهنية الحشوية كان أقل نشاط بمب من تلك منوالمستودعات تحت الجلد عندما متباينة ما لم تستكمل وسائل الإعلام الثقافة مع عوامل النمو أديبوجينيك BMP2 أو BMP4 12 ، 16 ، 17 ، 18 .
منذ عزل الخلايا الفردية من الأنسجة الدهنية أمر صعب بسبب هشاشة الخلايا، وذلك باستخدام مكس يوفر طريقة فعالة لعزل الخلية بتكلفة أقل من المواد الاستهلاكية والمعدات والموارد التدريب. من المهم أن نلاحظ أن العائد أبك يمكن أن تتأثر عمر الحيوان أو حجم والتغيرات في درجة حرارة وسائل الإعلام والفشل في الحفاظ على بيئة عزل العقيمة. خلايا التسمم في نورموكسيا مهم أيضا للانتشار والتمايز 19 ، وبالتالي الحفاظ على ظروف الهواء الحضانة هو جزء لا يتجزأ من ممارسة الثقافة. ويمكن زيادة سرعات الطرد المركزي إلى 800 x ج إذا الكريات خلية كافية لا تشكل خلال رانه عملية العزل. قد يكون التحقق من انتهاء الأجسام المضادة ضروريا أيضا حيث أن متلازمة فيتس المتزامنة يمكن أن تتحلل بمرور الوقت. تغيير الكثير من كولاجيناز نوع I قد تتطلب أيضا تعديلات على إجراءات الهضم كما الكثير يمكن أن تختلف في قوة. إذا كان استخدام أنواع مختلفة أخرى من الفئران، مصل معين ومفتش في العازلة حظر قد تكون ضرورية أيضا إذا الأنواع المضيف من الأجسام المضادة مختلفة عن تلك المستخدمة هنا.
ومن بين مزايا نظام الرصد والتحقق والإشراف على نظام مراقبة الأصول الميدانية أنه أكثر قابلية من الناحية الاقتصادية من نظام مراقبة الأصول الميدانية حيث أن المجموعات غير مكلفة ويمكن شراؤها بسهولة. هذا أيضا يتجنب شراء، صيانة، واستخدام التدريب من التدفق الخلوي. باستخدام مكس يسمح أيضا ملزمة محددة دون تعديل بوابات للاختيار والخلفية مضان المشاركة.
الحد من هذه الدراسة هو أنه اعتمد على اثنين من علامات سطح برياديبوسيت. علامات سطح بريادبوسيت أخرى من الالتزام و ديفتم التعرف على التماثل، مثل Zfp423، Sca1، و CD24، 20 ، 21 . قد تحدد هذه العلامات بدقة الخلايا السلفيات الشحمية الملتزمة من المظاهر المحددة. ومع ذلك، تم اختيار علامات السطح المستخدمة هنا منذ الخلايا معربا عن هذه العلامات لديها القدرة على إحداث كل من الظواهر البني والأبيض 20 ، 21 . وثمة قيد آخر لهذه الدراسة هو الاستخدام الانتقائي لعوامل النمو في ثقافة أبك. وكانت الكوكتيلات عامل النمو الأخرى فعالة في تحريض أديبوجينيسيس 22 . وكانت ثقافة الخلية في هذه الدراسة محدودة أيضا من حقيقة أن جميع الثقافة تم في لوحات ثقافة ثنائية الأبعاد. على الرغم من أن هذا هو المعيار الثقافة، والخلايا في الجسم الحي لا تتكاثر بهذه الطريقة. قد يسمح التعدد في البيئات ثلاثية الأبعاد بزيادة تضخم وتضخم حيث أنه يكرر الشكل الطبيعي للشكل الدهنيروتور 23 .
نظرا لفعالية وكفاءة استخدام مكس، هذا البروتوكول هو المثالي لعزل أبك وكذلك أنواع الخلايا الأخرى في بفات. ويوفر هذا الإجراء أيضا وسيلة أكثر فعالية للحث على التمايز في الثقافات بريادبوسيت. تكلفة الحد الأدنى، والمعدات، والتدريب المطلوبة يسمح هذا الأسلوب لاستخدامها في أي مختبر يرغب في عزل الخلايا على أساس علامات سطح محددة. التطبيقات المستقبلية قد تسمح لعزل السكان الخلية الأخرى أو استخدام علامات الخلية أكثر تحديدا. استخدام الكوكتيلات عامل النمو في التزام الخلية قد تكون مفيدة في تنشيط الخلايا الجذعية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
و كونتريراس و واتس المختبرات والدكتور ويليام رفائيل. وقد دعمت هذه التجارب من قبل نهلبي F31 HL128035-01 (الأنسجة بروتوكول الهضم التوحيد)، نهلبي 5R01HL117847-02 و 2 P01HL070687-11A1 (الحيوانات)، و نهلبي 5R01HL117847-02 (عزل الخلية والثقافة).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC-conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48-Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Stacey, G. in eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
- Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
- Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
- Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
- Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
- Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034 (2015).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
