Summary
Her rapporteres en metode til isolering af Adipocyte Progenitor Cell (APC) populationer fra Perivascular Adipose Tissue (PVAT) ved hjælp af magnetisk aktiveret cellesortering (MCS). Denne metode muliggør en øget isolering af APC pr. Gram fedtvæv i sammenligning med fluorescensaktiveret cellesortering (FACS).
Abstract
Udvidelse af perivaskulær adiposevæv (PVAT), en vigtig regulator af vaskulær funktion gennem parakrin signalering, er direkte relateret til udviklingen af hypertension under fedme. Omfanget af hypertrofi og hyperplasi afhænger af depotplacering, køn og typen af adipocytprogenitorcelle (APC) -fænotyper til stede. Teknikker anvendt til APC og præadipocytter isolation i de sidste 10 år har drastisk forbedret nøjagtigheden, hvormed enkelte celler kan identificeres baseret på specifikke celleoverflademarkører. Imidlertid kan isolering af APC og adipocytter være en udfordring på grund af cellens skrøbelighed, især hvis den intakte celle beholdes for cellekulturapplikationer.
Magnetisk aktiveret cellesortering ( MCS) tilvejebringer en fremgangsmåde til isolering af større antal levedygtige APC pr. Vægt enhed af fedtvæv. APC høstet af MCS kan anvendes til in vitro protokoller for at udvide præaDipocytter og differentiere dem i adipocytter ved anvendelse af vækstfaktor-cocktails, der muliggør analyse af det produktive og adipogene potentiale, der tilbageholdes af cellerne. Dette forsøg fokuserede på de aorta og mesenteriske PVAT depots, som spiller centrale roller i udviklingen af hjerte-kar-sygdomme under ekspansion. Disse protokoller beskriver metoder til at isolere, udvide og differentiere en defineret population af APC. Denne MCS-protokol gør det muligt at anvende isolering i ethvert eksperiment, hvor celle sortering er nødvendig med minimal udstyr eller træning. Disse teknikker kan hjælpe yderligere forsøg til at bestemme funktionaliteten af specifikke cellepopulationer baseret på tilstedeværelsen af celleoverflademarkører.
Introduction
Perivaskulær Adipose Tissue (PVAT), på grund af dens nærhed til blodkar, er en vigtig parakrin signalering komponent i vaskulatur funktion 1 . Udvidelse af dette fedtvæv afhænger af fænotypen af adipocytprogenitorcellerne (APC) til stede 2 , 3 . Isolering af celler fra fedtvæv er vanskelig, da primære adipocytter er skrøbelige, flydende og varierende i størrelse. Visse isolationsteknikker kan også ændre cellefænotype og morfologi ved at øge inflammatorisk proteinsyntese og reducere adipogen genekspression 4 , idet man understreger vigtigheden af en protokol, som opretholder cellernes integritet.
Kultur af primære celler og specifikke preadipocyt subpopulationer giver en reduktionistisk tilgang til in vivo vækst og opretholder ækvivalent cellulær genetisk makeup 5 , selvom man arbejder tiMig med disse celler er begrænset på grund af forringelse med aldring eller senescence 6 . Preadipocytter fra forskellige fedtdepoter, herunder subkutane og omentale depoter, viser også forskelle i proliferation 7 , hvilket understreger vigtigheden af at samle celler fra specifikke anatomiske steder. Prækursorceller fra ikke-PVAT hvide fedtdepoter er blevet karakteriseret i tidligere undersøgelser 7 , 8 , 9 , men mindre er kendt om PVAT APC-fænotyper.
De her beskrevne teknikker muliggør analyse af specifikke og definerede APC-populationer med minimal indvirkning på deres morfologi, levedygtighed og potentiale til proliferation og differentiering. Magnetisk aktiveret cellesortering (MCS) er tilgængelig for downstream-applikationer, såsom kultur, da perlerne opløses uden at ændre cellen. MCS er også økonomisk, og når antistoffet conCentrationer er standardiseret, er behovet for flowcytometrianalyser minimal. In vitro- undersøgelser med PVAT-precursorer kan også give et glimt af det potentiale, som disse primære celler kan have.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer beskrevet i dette papir følger retningslinjer fastlagt af Institutt for Dyrepleje og Brugskomité (IACUC) fra Michigan State University. Alle buffere og medier skal beskyttes mod lys.
1. Fremstilling af buffere, medier og instrumenter
- Forbered Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered Solution (KRBB): 135 mM natriumchlorid, 5 mM kaliumchlorid, 1 mM magnesiumsulfat, 0,4 mM kaliumphosphatdibasisk, 5,5 mM glucose, 1% antibiotisk / antimykotisk (10.000 enheder / ml penicillin, 10.000 μg / Ml streptomycin, 25 μg / ml amphotericin B) og 10 mM HEPES (pH = 7,4). Denne opløsning er stabil i 3 uger, når den holdes steril og ved 4 ° C.
- Forbered kollagenase type 1 opløsning: 1 mg / ml i KRBB med 4% bovint serumalbumin (BSA). Denne opløsning skal opbevares ved 37 ° C og er stabil i 4 timer.
- Forbered Erythrocyt Lysis Buffer Solution: 154 mM ammoniumchlorid, 10 mM kaliumbicarbonat, Og 0,1 mM EDTA. Opbevares ved 4 ° C i op til en måned.
- Klargør MCS-blokeringsbuffer: DMEM / F12 mediebase, 10% føtalt bovint serum (FBS), 5% normalt æseleserum, 40 μl / ml F (ab) Fragment Æsel Anti-Rat IgG. Opbevares ved 4 ° C i op til en måned.
- Forbered MCS Buffer Solution: Fosfatbuffet saltvand (PBS, pH = 7,5), 0,5% BSA og 2 mM EDTA. Opbevares ved 4 ° C i op til en måned. De-gasopløsning ved opvarmning til 37 ° C i en glasbeholder og derefter påføring af et vakuum i 15 s. Forlad ubrugt, bukket forseglet.
- Dulbecco's-Modified Eagles Medium (DMEM): F12, 15% Fetal Calf Serum (FCS), 1% antibiotikum / antimykotisk (10.000 enheder / ml penicillin, 10.000 μg / mL streptomycin, 25 μg / Ml amphotericin B), 44,05 mM natriumbicarbonat, 100 μM ascorbinsyre, 33 μM biotin, 17 μM pantothenat, 2 mM L-glutamin og 20 mM HEPES. Opbevares sterilt og ved 4 ° C i op til 2 uger.
- Forbered APC &Medier: Basalmedier med yderligere vækstfaktorer, herunder epidermal vækstfaktor 10 ng / ml), leukæmiinhiberende faktor (10 ng / mL), blodpladeafledt vækstfaktor BB (10 ng / mL) og basisk fibroblastvækstfaktor 5 ng / ml). Opbevares sterilt og ved 4 ° C i op til 2 uger.
- Forbered APC-induktionsmedier: APC-medier med 10% FBS, 2,5 μg / ml insulin, 0,5 mM 2-isobutyl-1-methylaxanthin (IBMX), 1 μM dexamethason og 200 pM T3 (triiodothyronin thyroidhormon). Opbevares sterilt og ved 4 ° C i op til 2 uger.
2. Adipocyt Progenitors Isolation
- Bedøve rotte i henhold til institutionelle retningslinjer. Placer rotten i dorsal recumbency. Bekræft dybde af anæstesi via en tåhinde og tab af refleksrespons på denne smertefulde stimulus.
BEMÆRK: Denne protokol anvender 10 uger gamle Sprague Dawley rotter og 70 mg / kg pentobarbital leveret via en intraperitoneal injektion. - Lav en lodret midterskæring wMed en saks langs brystbenet i brystområdet og til perinealområdet. Få adgang til bukhulen og udsætte den overordnede mesenteriske arterie, de små mesenteriske resistensbeholdere (mPVAT) og thoracale aorta (aPVAT).
- Afbryd alle forbindelser til mesenteri og aorta og fjern skibe fra dyr. Isolér PVAT ved hjælp af et dissekeringsmikroskop og petriskål fyldt med KRBB for at se skibe og isolere PVAT.
- I dette forsøg indsamler gonadal (GON) adipose til at repræsentere et non-PVAT fedt depot. Anbring isolerede fedtpuder på is i KRBB med 10 mM HEPES (pH = 7,4).
- I en biosikkerhedshætte overføres ca. 50 mg væv til et 1,7 ml rør med 1 ml kollagenase type I opløsning og hakket med vævssaks (1 - 3 mm stykker).
- Fordel prøver ved at inkubere ved 37 ° C i en rotisserie-inkubator (eller inkubator med en orbital shaker) i 1 time. I en biosafety hætte, sekventielt filter fordøjes materiale gennem 100 og 40 Μm celle-strainer i et 50 ml rør. Centrifuge resulterende filtrat ved 4 ° C i 10 minutter ved 300 x g.
BEMÆRK: Alle trin i protokollen herfra skal udføres i en biosafety-hætte for at holde cellerne sterile. - Hæld supernatant og resuspender pellets indeholdende SVF-cellerne i 1 ml 1X Erythrocyte Lysis Buffer Solution og overfør til et 1,7 ml mikrofugerør. Inkuber celler i 5 minutter ved RT beskyttet mod lys og centrifuge ved 4 ° C i 5 minutter ved 300 x g.
- Hæld supernatant og resuspender resterende cellepiller i SVF Basal Media. Indsaml en 20 μL delprøve for at tælle levende celler med Trypan Blue Solution.
BEMÆRK: Antallet af SVF-celler, der kan isoleres, varierer fra sted til sted. Gennemsnitligt antal SVF høstet pr. Mg væv er: aPVAT = 5,0 ± 2,0x10 3 , mPVAT = 1,04 ± 0,62x10 4 , GON = 2,4 ± 1,2x10 5 .
3. Magnetisk aktiveret cellesortering
_content "> BEMÆRK: Isolér APC fra SVF baseret på CD34 og PDGFRα celleoverflademarkører ved at udføre alle trin ved 4 ° C.- Spinceller i 5 minutter ved 300 x g. Hæld supernatanten op og resuspender cellepellet i MCS-blokeringsbuffer ved 1 x 106 celler / ml og inkuber i 20 minutter.
BEMÆRK: Cellesuspensioner på 1 x 10 6 - 2 x 108 celler / ml kan adskilles effektivt. - Inkuber celler med 5 μl FITC-konjugeret Mouse anti-CD34 (1 μg / 1 x 106 celler) i 30 minutter ved 4 ° C. Spinceller i 5 minutter ved 300 xg og 4 ° C.
- Inkuber med 4 μl anti-FITC mikroperler og 96 μl MCS buffer (total volumen på 100 μl) i 5 minutter ved 4 ° C i mørket for at adskille CD34 + og CD34 - celler.
- Fastgør magnetisk separator til stativet, og sæt MultiSort (MS) -kolonnen med søjlevingerne på forsiden ind i separatoren. Anbring en 5 mlOpsamlingsrør under MS-kolonnen i den øvre rørholder.
- Forbered MS kolonne ved skylning med MCS Buffer Solution. Påfør 500 μL MCS Buffer oven på søjlen og lad bufferen løbe igennem. Kassér udløb og skift opsamlingsrør.
- Indlæs antistofmærket cellesuspension på den fremstillede MS Column. Indsamle gennemstrømning indeholdende umærkede celler.
- Vask MS-kolonne med 500 μl afgasset MCS-buffer 3x. Indsamle umærkede celler, der passerer igennem og kombinere med strømmen gennem fra foregående trin.
- Fjern MS-kolonnen fra den magnetiske separator og læg den på et nyt opsamlingsrør. Pipetter 1 ml MCS buffer på MS kolonnen. Spul straks fraktionen med de magnetisk mærkede celler fast, men langsomt, og påfør stempelet, som følger med kolonnen, for ikke at tillade overskydende gas i søjlen.
BEMÆRK: Isolerede celleantal vil variere fra sted til sted. Gennemsnitligt antal CD34 + APC isoleret fra SVF-populationen prMg væv er: aPVAT = 2,6 ± 0,43x10 2 , mPVAT = 9,6 ± 1,4x10 2 , GON = 1,3 ± 0,22x10 3 . - Spinceller i 5 minutter ved 300 x g og 4 ° C. Inkuber CD34 + fraktionen opsamlet i 10 μl af en 1: 200 opløsning / 1 x 106 celler Kanin anti-PDGFRa i 30 minutter ved 4 ° C.
- Centrifuger cellerne igen i 5 minutter ved 300 xg og 4 ° C. Inkubér mærket celler med 4 μl anti-kanin-IgG-mikroperler og 96 μl MCS-buffer ved at gentage trin 3.3 til 3.7 for at isolere.
BEMÆRK: Isolerede celleantal vil variere fra sted til sted. Gennemsnitligt antal PDGFRα + APC isoleret fra CD34 + populationen pr. Mg væv er: aPVAT = 2,4 ± 0,64, mPVAT = 8,4 ± 2,4, GON = 10,4 ± 1,9, hvilket er 0,5-10% af den tidligere isolerede population.
- Centrifuger cellerne igen i 5 minutter ved 300 xg og 4 ° C. Inkubér mærket celler med 4 μl anti-kanin-IgG-mikroperler og 96 μl MCS-buffer ved at gentage trin 3.3 til 3.7 for at isolere.
4. Cellekultur og adipogeneseinduktion
- Kultur SVFOg APC i 6-brønds vævskulturplader i basale medier med udskiftning hver anden dag. Efter 3 serielle passager, plade i sorte 96-Brøndvævskulturplader ved 1 x 10 2 celler / brønd til proliferationsassays, som evalueres ved 8, 24, 48 og 96 timer og ved 50.000 celler / brønd i plader med 24 brønde eller 10.000 celler / brønd i 48-brøndvævskulturplader til adipogenese-analyser, som er kvalitative og kvantitative.
- Suppler APC basale medier i 48 timer efter konfluens og før induktion med knoglemorfogen protein 4 (3,3 nmol / L) som angivet 10 for differentiering. Inducer celler efter 48 timer 100% konfluens (dag 0) ved hjælp af APC-induktionsmediet til inkubation af cellerne.
- Efter 48 timer skal du udskifte medier for at bevare cellerne i APC Induktionsmedier uden IBMX og dexamethason, i 14 dage med udskiftning af medier hver 48 time.
- MCS isolation valideret af FACS.
- Tag en 50 μl (50.000 celle) delprøve af magnetisk separAtede celler og vask med FACS-opløsning.
- Centrifuger cellerne og resuspenderes i 100 μl af en 1: 1.000 opløsning af æsel-anti-kanin-IgG Dylight 405 til mærkning af PDGFRa + -cellerne. Inkubér i 30 minutter beskyttet mod lys og ved 4 ° C.
- Vask celler og resuspender i 200 μl 2% formaldehydopløsning indtil tiden til analyse ved anvendelse af 488 nm (FITC) og 405 nm (Dylight 405) filtre på et flowcytometer.
BEMÆRK: Lipidakkumulering af dyrkede celler vurderes kvantitativt ved anvendelse af en lipofil adipogenese-fluorescensanalyse i en mikropladelæser, der måler fluorescens og ved anvendelse af preadipocytter som kalibratorer til lipidakkumulering. Lipidakkumulering måles også kvalitativt ved hjælp af lipidfarvestoffarvning og billeddannelse udført på et inverteret mikroskop udstyret med et kamera, hvilket gør procentdelen af de samlede celler, der gør eller ikke indeholder lipid observerbare. Enhver pladelæser, der er i stand til at måle fluorescens med excitation ved 485 nm og emission ved 572Nm er egnet til analyse såvel som ethvert mikroskop med et kamera, der er i stand til at fange digitale billeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proliferativ kapacitet af preadipocytter og adipogen potentiale af adipocytprecursorer er karakteristika, som opretholdes in vitro 11 . In vitro proliferation af isoleret SVF og APC fra aPVAT, mPVAT og GON fra hanrotter blev evalueret ved 8, 24, 48 og 96 timer efter plating ved anvendelse af et kvantitativt DNA-assay. Der blev ikke observeret nogen stedforskelle i SVF-ekspansionshastighed på ethvert tidspunkt, undtagen APC fra aPVAT, som havde mindre proliferation i 96 timer sammenlignet med SVF-celler fra samme sted ( Figur 1 ).
Konfluent APC stimuleret med benmorfogenprotein 4 (BMP4) i 48 timer forud for standardinduktion 12 udviste differentiering. Dette var tydeligt ved større lipidakkumulering i dråber som evalueret ved både fluorescerende lipidoptagelsesassay ( figur 2A ) og Olie Rød O farvning ( Figur 2 B ).
Ved sammenligning af udbyttet af APC producerede MCS-isolering et større antal celler klar til dyrkning sammenlignet med FACS. ( Figur 3 ) Det var vigtigt, at fordelingen og levedygtigheden af APC-populationer (CD34 + og PDGFRα + ) var ens mellem MCS og FACS. Celle-levedygtighed bestemt ved Trypan Blue-farvning til tælling efter isolering var ens i begge isolationsprocedurer (FACS = 71,57% ± 11,09; MCS = 79,25% ± 7,47). Disse data viser, at MCS-isolationen af APC giver et højere antal levedygtige APC sammenlignet med MCS.
Figur 1 : In vitro- spredning af adIpocyt progenitorceller (APC) påvirkes af anatomisk placering. Stromal vaskulær fraktion (SVF) og APC blev isoleret fra henholdsvis aorta- og mesenterisk perivaskulært adiposevæv (henholdsvis aPVAT & mPVAT) og gonadal adipose fra 10 ugers gamle hanrotter. Proliferation af celler blev målt ved hjælp af et DNA-kvantificeringsassay ved 8, 24, 48 og 96 timer tidspunkter efter podning. Data er udtrykt som foldestigning over 8 h baseline ± SEM (N = 4). Betydningen er angivet med * (P <0,05). Figur modificeret fra Contreras et al . 2016 13 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Adipocyt Progenitor Cells (APC) Vis ingen Variation i DifferentiaEvner mellem depots, men større lipidakkumulering sammenlignet med stromal vaskulær fraktion (SVF). Celler blev induceret efter 48 timers konfluens og eksponering for BMP4 efterfulgt af 48 timers eksponering for dexamethason og 3-isobutyl-1-methylxanthin og derefter opretholdt i vedligeholdelsesmedier 14 dage med medieændringer hver 48 timer. ( A ) Lipidoptagelsesassay af differentieret APC med data udtrykt som forholdet mellem udifferentierede preadipocytter: differentierede adipocytter (preadipocytter: adipocytter) i relative fluorescensenheder (RFU) ± SEM (N = 4). ( B ) Olie Rød O (ORO) farvning af APC og SVF med data udtrykt som procent af celler med lipid (ORO Uptake) ± SEM (N = 4). Betydningen er angivet med * (P <0,05). Figur modificeret fra Contreras et al. 2016 13 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 : Isolationsudbytte af levedygtige adipocytprogenitorceller (APC) er forbedret ved magnetisk aktiveret cellesortering (MCS). Overflademarkørekspression af CD34 + ( A ) og PDGFRα + ( B ) i SVF isoleret fra perivaskulære adipose væv (aorta = aPVAT; mesenterisk = mPVAT) ved anvendelse af MCS og FACS. Data udtrykkes som gennemsnitligt antal celler isoleret fra 50 mg væv ± SEM (N = 4). Betydningen er angivet med * (P <0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det centrale fokus i det foreliggende eksperiment er isoleringen, ekspansion og adipogen induktion af APC fra PVAT depot. Her præsenterer vi en protokol til isolering af APC baseret på identifikationen af celler, der udtrykker overflademarkørerne CD34 og PDGFRα. Disse overfladeproteiner blev tidligere identificeret på APC med høje proliferationshastigheder og potentialet til at differentiere i hvide eller brune adipocytter i forskellige adipose depots 14 , 15 . Ved at vælge celler baseret på disse specifikke markører, var vi i stand til at isolere lignende APC populationer fra adipocytfænotyper, der matcher adipocytfænotypen, der observeres i den valgte PVAT 13 . I vores forsøg forbedrede vi APC-differentiering ved at supplere vækstfaktoren BMP4. Tidligere viste Macotela og kolleger, at specifikke APC-populationer fra viscerale adipose depoter havde mindre BMP-aktivitet end dem fraSubkutane depoter, når de differentieres, medmindre kulturmedier blev suppleret med de adipogene vækstfaktorer BMP2 eller BMP4 12 , 16 , 17 , 18 .
Da isolering af individuelle celler fra fedtvæv er vanskelig på grund af cellernes skrøbelighed, giver MCS en effektiv metode til celleisolering til en mindre omkostning for forbrugsstoffer, udstyr og træningsressourcer. Det er vigtigt at bemærke, at APC-udbytte kan påvirkes af dyrets alder eller størrelse og ved ændringer i medietemperaturen og manglende opretholdelse af et sterilt isoleringsmiljø. Kultiveringsceller i normoxi er også vigtige for proliferation og differentiering 19 , således at vedligeholdelse af inkubationsluftbetingelser er integreret i kulturpraksis. Centrifugeringshastigheder kan forøges til 800 xg, hvis der ikke dannes tilstrækkelige cellepellets under tHan isoleringsproces. Kontrol af udløb af antistofferne kan også være nødvendigt, da det konjugerede FITC fluorochrom kan nedbrydes over tid. Ændring af masser af collagenase type I kan også kræve ændringer i fordøjelsesprocedurer, da mange kan variere i styrke. Hvis der anvendes en anden art end rotter, kan specifikt serum og IgG i blokeringsbufferen også være nødvendigt, hvis antistoffernes værtsart er forskellig fra dem, der anvendes her.
Blandt fordelene ved MCS over FACS er, at det er mere økonomisk muligt end FACS, da sæt er billige og let kan købes. Dette undgår også køb, vedligeholdelse og brugstræning af et flowcytometer. Brug af MCS tillader også specifik binding uden justering af porte til udvælgelse og baggrundsfluorescensinddragelse.
En begrænsning af denne undersøgelse er, at den var afhængig af to preadipocyt overflademarkører. Andre præadipocyt overflademarkører af engagement og diffErentiering, såsom Zfp423, Sca1 og CD24, er blevet identificeret 20 , 21 . Disse markører kan nøjagtigt identificere engagerede adipocyt-progenitorceller af specifikke fænotyper; De her anvendte overflademarkører blev imidlertid valgt, da celler, der udtrykker disse markører, har evnen til at inducere til både brune og hvide fænotyper 20 , 21 . En anden begrænsning af denne undersøgelse var den selektive anvendelse af vækstfaktorer i APC-kultur. Andre vækstfaktor-cocktails har været effektive i induktionen af adipogenese 22 . Cellekultur i denne undersøgelse blev også begrænset af, at al kultur blev udført i todimensionelle kulturplader. Selvom dette er kulturnormen, prolifererer cellerne ikke in vivo på denne måde. Kultivering i tredimensionelle omgivelser kan muliggøre yderligere hypertrofi og hyperplasi, da den replikerer den naturlige form af fedtstammenRukture 23 .
På grund af praktiske og effektivitet ved at bruge MCS er denne protokol ideel til isolering af APC såvel som andre celletyper i PVAT. Denne procedure tilvejebringer også en mere effektiv måde at fremkalde differentiering i preadipocytkulturer. Den krævede minimal omkostninger, udstyr og uddannelse gør det muligt at anvende denne metode i ethvert laboratorium, der ønsker at isolere celler baseret på specifikke overflademarkører. Fremtidige applikationer kan muliggøre isolering af andre cellepopulationer eller anvendelse af mere specifikke cellemarkører. Anvendelse af vækstfaktor-cocktails i celleforpligtelse kan være nyttig ved stamcelleaktivering
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Contreras og Watts Laboratories og Dr. William Raphael. Disse eksperimenter blev understøttet af NHLBI F31 HL128035-01 (vævsfordøjelsesprotokol standardisering), NHLBI 5R01HL117847-02 og 2P01HL070687-11A1 (dyr) og NHLBI 5R01HL117847-02 (celleisolering og kultur).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC-conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48-Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Stacey, G. in eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
- Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
- Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
- Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
- Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
- Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034 (2015).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
