Summary
Nous rapportons ici une méthode pour l'isolement des populations de cellules progénitrices d'adipocytes (APC) à partir du tissu adipeux périvasculaire (PVAT) en utilisant le triage cellulaire activé par magnétisation (MCS). Cette méthode permet une augmentation de l'isolement de l'APC par gramme de tissu adipeux par rapport au tri de cellules activées par fluorescence (FACS).
Abstract
L'expansion du tissu adipeux périvasculaire (PVAT), un régulateur majeur de la fonction vasculaire par la signalisation paracrine, est directement liée au développement de l'hypertension pendant l'obésité. L'étendue de l'hypertrophie et de l'hyperplasie dépend de la localisation du dépôt, du sexe et du type de phénotypes cellulaires progéniteurs adipocytaires (APC) présents. Les techniques utilisées pour l'APC et l'isolement des préadipocytes au cours des 10 dernières années ont considérablement amélioré la précision à laquelle les cellules individuelles peuvent être identifiées en fonction de marqueurs de surface cellulaire spécifiques. Cependant, l'isolement de l'APC et des adipocytes peut être un défi en raison de la fragilité de la cellule, surtout si la cellule intacte doit être retenue pour les applications de culture cellulaire.
Le tri cellulaire activé par magnétisation ( MCS) fournit une méthode pour isoler un plus grand nombre d'APC viables par unité de poids de tissu adipeux. L'APC récolté par MCS peut être utilisé pour des protocoles in vitro pour développer les préLes dipocytes et les différencier en adipocytes par l'utilisation de cocktails à facteur de croissance permettant d'analyser le potentiel proliférateur et adipogène retenu par les cellules. Cette expérience a porté sur les dépôts PVAT aortiques et mésentériques, qui jouent un rôle clé dans le développement des maladies cardiovasculaires lors de l'expansion. Ces protocoles décrivent des méthodes pour isoler, développer et différencier une population définie d'APC. Ce protocole MCS permet d'utiliser l'isolation dans toute expérience où le tri cellulaire est nécessaire avec un équipement ou une formation minimale. Ces techniques peuvent aider d'autres expériences pour déterminer la fonctionnalité de populations cellulaires spécifiques en fonction de la présence de marqueurs de surface cellulaire.
Introduction
Le tissu adipeux périvasculaire (PVAT), en raison de sa proximité avec les vaisseaux sanguins, est un composant de signalisation paracrine majeur dans la fonction vasculaire 1 . L'expansion de ce tissu adipeux dépend du phénotype des cellules progénitrices d'adipocytes (APC) présentées 2 , 3 . L'isolement des cellules à partir de tissus adipeux est difficile car les adipocytes primaires sont fragiles, dynamiques et de taille. Certaines techniques d'isolement peuvent également modifier le phénotype et la morphologie cellulaire en augmentant la synthèse des protéines inflammatoires et en réduisant l'expression génétique adipogène 4 , en soulignant l'importance d'un protocole qui maintient l'intégrité des cellules.
La culture des cellules primaires et des sous-populations spécifiques de préadipocytes donne une approche réductionniste de la croissance in vivo et maintient un maquillage génétique cellulaire équivalent 5 , bien que le travailMoi avec ces cellules est limité en raison de la détérioration avec le vieillissement, ou la sénescence 6 . Les préadipocytes provenant de divers dépôts adipeux, y compris les dépôts sous-cutanés et omental, démontrent également des différences dans la prolifération 7 , ce qui met l'accent sur l'importance de la collecte de cellules à partir de sites anatomiques spécifiques. Les cellules précurseurs des dépôts adipeux blancs non PVAT ont été caractérisées dans les études précédentes 7 , 8 , 9 , mais on sait moins sur les phénotypes APAT de PVAT.
Les techniques décrites ici permettent l'analyse de populations APC spécifiques et définies ayant un impact minimal sur leur morphologie, leur viabilité et leur potentiel de prolifération et de différenciation. Le tri de cellules activé par magnétisation (MCS) est susceptible d'être utilisé dans les applications en aval, telles que la culture, car les grains se dissolvent sans altérer la cellule. MCS est également économique, et une fois que l'anticorps est conLes centrations ont été normalisées, le besoin de tests de cytométrie de flux est minime. Des études in vitro avec des précurseurs de PVAT peuvent également donner un aperçu du potentiel que ces cellules primaires peuvent avoir.
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Protocol
Toutes les procédures décrites dans cet article suivent les lignes directrices établies par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université d'État du Michigan. Tous les tampons et les médias doivent être protégés de la lumière.
1. Préparation des tampons, des supports et des instruments
- Préparer la solution tampon Bicarbonate de Krebs Ringer (KRBB): chlorure de sodium 135 mM, chlorure de potassium 5 mM, sulfate de magnésium 1 mM, phosphate de potassium 0,4 mM, 5,5 mM de glucose, 1% d'antibiotique / antimycotique (10 000 unités / mL de pénicilline, 10 000 μg / Ml de streptomycine, 25 μg / ml d'amphotéricine B) et 10 mM d'HEPES (pH = 7,4). Cette solution est stable pendant 3 semaines lorsqu'elle est maintenue stérile et à 4 ° C.
- Préparer la solution de collagénase de type 1: 1 mg / mL dans du KRBB avec de l'albumine de sérum bovin à 4% (BSA). Cette solution doit être maintenue à 37 ° C et stable pendant 4 h.
- Préparer une solution tampon de lyse d'érythrocytes: chlorure d'ammonium 154 mM, bicarbonate de potassium 10 mM, Et 0,1 mM d'EDTA. Conserver à 4 ° C pendant un maximum d'un mois.
- Préparer le tampon de blocage MCS: base de support DMEM / F12, 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 5% de sérum d'âne normal, 40 μL / mL de F (ab) Fragment Donkey Anti-Rat IgG. Conserver à 4 ° C pendant un maximum d'un mois.
- Préparer une solution tampon MCS: solution salée tamponnée au phosphate (PBS, pH = 7,5), 0,5% de BSA et 2 mM d'EDTA. Conserver à 4 ° C pendant un maximum d'un mois. Solution de gaspillage en chauffant à 37 ° C dans un récipient en verre puis en appliquant un vide pendant 15 s. Laisser le tampon non utilisé tamponné.
- Préparation de la fraction vasculaire Stromal (SVF) Médias basaux: milieu d'aigles modifiés de Dulbecco (DMEM): F12, 15% de sérum de veau fœtal (FCS), 1% d'antibiotique / antimycotique (10 000 unités / mL de pénicilline, 10 000 μg / ml de streptomycine, 25 μg / ML d'amphotéricine B), 44,05 mM de bicarbonate de sodium, 100 uM d'acide ascorbique, 33 uM de biotine, 17 uM de pantothénate, 2 mM de L-glutamine et 20 mM de HEPES. Restez stérile et à 4 ° C jusqu'à 2 semaines.
- Préparez APC &# 160; Médias: Méthodes basales avec des facteurs de croissance supplémentaires, y compris facteur de croissance épidermique de 10 ng / mL), facteur inhibiteur de leucémie (10 ng / mL), facteur de croissance dérivé des plaquettes BB (10 ng / mL) et facteur de croissance de fibroblastes basique ( 5 ng / mL). Restez stérile et à 4 ° C jusqu'à 2 semaines.
- Préparer le milieu d'induction APC: milieu APC avec 10% de FBS, 2,5 μg / mL d'insuline, 0,5 mM de 2-isobutyl-1-méthylaxanthine (IBMX), 1 μM de dexaméthasone et 200 pM de T3 (hormone thyroïdienne de triiodothyronine). Restez stérile et à 4 ° C jusqu'à 2 semaines.
2. Isolation des progéniteurs d'adipocytes
- Anesthésier le rat selon les directives institutionnelles. Placez le rat en accalmie dorsale. Confirmez la profondeur de l'anesthésie par un pincement et la perte de réponse réflexe à ce stimulus douloureux.
NOTE: Ce protocole utilise des rats Sprague Dawley de 10 semaines et 70 mg / kg de pentobarbital administré par injection intraperitoneale. - Faire une incision verticale de la ligne médiane wAvec des ciseaux le long du sternum dans la zone thoracique et dans la zone périnéale. Accédez à la cavité abdominale et exposez l'artère mésentérique supérieure, les petits vaisseaux de résistance mésentérique (mPVAT) et l'aorte thoracique (aPVAT).
- Séchez toutes les connexions au mésentère et à l'aorte et enlevez les vaisseaux des animaux. Isoler le PVAT en utilisant un microscope à dissection et une boîte de Petri remplie de KRBB pour voir les vaisseaux et isoler le PVAT.
- Dans cette expérience, collectez les adipeux gonadiques (GON) pour représenter un dépôt adipeux non PVAT. Placez des tampons gras isolés sur de la glace dans du KRBB avec HEPES 10 mM (pH = 7,4).
- Dans un capot de prévention de la biosécurité, transférez environ 50 mg de tissu dans un tube de 1,7 ml avec 1 ml de solution de collagénase de type I et piquez avec des ciseaux en tissu (morceaux de 1 à 3 mm).
- Déterminer les échantillons en incubant à 37 ° C dans un incubateur de rôtissoire (ou incubateur avec un agitateur orbital) pendant 1 h. Dans un capot de sécurité biologique, filtre séquentiellement le matériau digéré à travers 100 et 40 Μm dans un tube de 50 ml. Centrifuger le filtrat résultant à 4 ° C pendant 10 min à 300 x g.
REMARQUE: Toutes les étapes du protocole à partir d'ici doivent être effectuées dans un capot de sécurité biologique pour maintenir les cellules stériles. - Verser le surnageant et resuspendre les pastilles contenant les cellules de SVF dans 1 ml de solution de tampon de lyse Erythrocyte 1X et transférer à un tube de microcentrifugeuse de 1,7 mL. Incuber les cellules pendant 5 min à la RT protégée contre la lumière et centrifuger à 4 ° C pendant 5 min à 300 x g.
- Verser le surnageant et ré-endiguer le culot cellulaire restant dans le support basal SVF. Collectez un sous-échantillon de 20 μL pour compter les cellules vivantes avec Trypan Blue Solution.
NOTE: Le nombre de cellules SVF pouvant être isolées varie selon le site. Les nombres moyens de SVF récoltés par mg de tissu sont: aPVAT = 5,0 ± 2,0x10 3 , mPVAT = 1,04 ± 0,62x10 4 , GON = 2,4 ± 1,2x10 5 .
3. Tri des cellules magnétiquement activé
_content "> REMARQUE: Isoler APC de SVF en fonction des marqueurs de surface de cellules CD34 et PDGFRα en effectuant toutes les étapes à 4 ° C.- Cellules centrifugées pendant 5 min à 300 x g. Verser le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans un tampon de blocage MCS à 1 x 10 6 cellules / ml et incuber pendant 20 minutes.
REMARQUE: Les suspensions cellulaires de 1 x 10 6 - 2 x 10 8 cellules / ml peuvent être séparées efficacement. - Incuber des cellules avec 5 μL de souris anti-CD34 conjuguées à FITC (1 μg / 1 x 10 6 cellules) pendant 30 minutes à 4 ° C. Cellules centrifuges pendant 5 min à 300 xg et 4 ° C.
- Incuber avec 4 μL de microbilles anti-FITC et 96 μL de tampon MCS (volume total de 100 μL) pendant 5 min à 4 ° C dans l'obscurité pour séparer les cellules CD34 + et CD34.
- Fixez le séparateur magnétique sur le support et placez la colonne MultiSort (MS), avec les ailes de la colonne vers l'avant, dans le séparateur. Placer 5 mLTube de collecte sous la colonne MS dans le support de tube supérieur.
- Préparez la colonne MS en rinçant avec MCS Buffer Solution. Appliquer 500 μL de MCS Buffer sur le dessus de la colonne et laisser passer le tampon. Jeter les effluents et changer le tube de collecte.
- Chargez la suspension cellulaire marquée par un anticorps sur la colonne de MS préparée. Collecter le flux contenant des cellules non étiquetées.
- Wash MS Column avec 500 μL de tampon MCS dégazé 3x. Recueillir des cellules non marquées qui traversent et se combiner avec le flux à travers l'étape précédente.
- Retirez MS Column du séparateur magnétique et placez-le sur un nouveau tube de collecte. Pipeter 1 mL de tampon MCS sur la colonne MS. Éloignez immédiatement la fraction avec les cellules étiquetées magnétiquement par une pression ferme, mais lentement, en appliquant le piston fourni avec la colonne afin de ne pas laisser excès de gaz dans la colonne.
REMARQUE: Les nombres de cellules isolés varieront selon le site. Nombre moyen d'APC CD34 + isolés de la population SVF parMg de tissu sont: aPVAT = 2,6 ± 0,43x10 2 , mPVAT = 9,6 ± 1,4x10 2 , GON = 1,3 ± 0,22x10 3 . - Cellules de spin pendant 5 minutes à 300 × g et 4 ° C. Incuber la fraction CD34 + recueillie dans 10 μL d'une solution 1: 200/1 x 10 6 cellules Rabbit anti-PDGFRa pendant 30 min à 4 ° C.
- Centrifuger les cellules à nouveau pendant 5 min à 300 xg et 4 ° C. Incuber les cellules marquées avec 4 μL de microbilles IgG anti-lapin et 96 μL de tampon MCS en répétant les étapes 3.3 à 3.7 pour isoler.
REMARQUE: Les nombres de cellules isolés varieront selon le site. Les nombres moyens de PDGFRα + APC isolés de la population CD34 + par mg de tissu sont: aPVAT = 2,4 ± 0,64, mPVAT = 8,4 ± 2,4, GON = 10,4 ± 1,9, soit 0,5 à 10% de la population précédemment isolée.
- Centrifuger les cellules à nouveau pendant 5 min à 300 xg et 4 ° C. Incuber les cellules marquées avec 4 μL de microbilles IgG anti-lapin et 96 μL de tampon MCS en répétant les étapes 3.3 à 3.7 pour isoler.
4. Culture cellulaire et adipogénèse Induction
- Culture le SVFEt APC dans des plaques de culture tissulaire de 6 puits en milieu basal avec remplacement tous les 2 jours. Après 3 passages en série, plaque dans des plaques de culture de tissus noires de 96 puits à 1x10 2 cellules / puits pour les essais de prolifération, qui sont évalués à 8, 24, 48 et 96 h, et à 50 000 cellules / puits dans des plaques de 24 puits ou 10 000 cellules / puits dans des plaques de culture tissulaire de 48 puits pour les essais d'adipogénèse, qui sont qualitatifs et quantitatifs.
- Complétez les médias basiques APC pendant 48 h après la confluence et avant l'induction avec la protéine morphogène osseuse 4 (3,3 nmol / L) comme indiqué 10 pour la différenciation. Induire les cellules après 48 h de confluence à 100% (jour 0) en utilisant le support d'induction APC pour incuber les cellules.
- Après 48 h, changez de support pour maintenir les cellules dans les médias d'induction APC sans IBMX et dexaméthasone, pendant 14 jours avec les changements de média toutes les 48 h.
- Isolation MCS validée par FACS.
- Prendre un sous échantillon de 50 μL (50 000 cellules) séparé magnétiquementEt lave avec une solution FACS.
- Centrifuger les cellules et resuspendre dans 100 μl d'une solution 1: 1000 d'IgG Dylight 405 anti-lapin d'âne pour étiqueter les cellules PDGFRα + . Incuber pendant 30 minutes protégé de la lumière et à 4 ° C.
- Lavez les cellules et résidez dans 200 μL de solution de formaldéhyde à 2% jusqu'à l'analyse des fuites à 488 nm (FITC) et 405 nm (Dylight 405) sur un cytomètre de flux.
NOTE: L'accumulation de lipides par les cellules cultivées est évaluée quantitativement en utilisant un dosage lipophile de la fluorescence de l'adipogénèse dans un lecteur de microplaque mesurant la fluorescence et en utilisant des préadipocytes comme étalons pour l'accumulation de lipides. L'accumulation de lipide est également mesurée qualitativement par la coloration des colorants lipidiques et l'imagerie effectuée sur un microscope inversé équipé d'une caméra, ce qui fait que le pourcentage de cellules totales contenant ou non des lipides est observable. Tout lecteur de plaques capable de mesurer la fluorescence avec excitation à 485 nm et l'émission à 572Nm est adapté pour l'analyse ainsi que tout microscope avec une caméra capable de capturer des images numériques.
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Representative Results
La capacité proliférative des préadipocytes et le potentiel adipogène des précurseurs d'adipocytes sont des caractéristiques qui sont maintenues in vitro 11 . La prolifération in vitro de SVF isolé et d'APC à partir d'aPVAT, de mPVAT et de GON de rats mâles a été évaluée à 8, 24, 48 et 96 h après le placage en utilisant un dosage d'ADN quantitatif. Aucune différence de site dans le taux d'expansion SVF n'a été observée à aucun moment, à l'exception de l'APC d'aPVAT, qui avait moins de prolifération de 96 h par rapport aux cellules de SVF du même site ( figure 1 ).
L'APC confluent stimulée avec la protéine Morphogène osseuse 4 (BMP4) pendant 48 h avant l'induction standard 12 a montré une différenciation. Ceci était évident par une plus grande accumulation de lipides dans les gouttelettes, tel qu'évalué par l'essai d'absorption de lipides fluorescents ( figure 2A ) et la coloration Oil Red O ( Figure 2 B ).
Lors de la comparaison du rendement de l'APC, l'isolement MCS a produit un plus grand nombre de cellules prêtes pour la culture par rapport aux FACS. ( Figure 3 ) Fait important, la répartition et la viabilité des populations d'APC (CD34 + et PDGFRα + ) étaient similaires entre MCS et FACS. La viabilité cellulaire déterminée par la coloration au bleu de Trypan pour l'isolement du comptage était similaire pour les deux procédures d'isolement (FACS = 71,57% ± 11,09, MCS = 79,25% ± 7,47). Ces données démontrent que l'isolement MCS de l'APC donne un nombre plus élevé d'APC viable par rapport à MCS.
Figure 1 : Prolifération in vitro de l'annonceLes cellules progénitrices des ipocytes (APC) sont affectées par un lieu anatomique. La fraction vasculaire Stromal (SVF) et l'APC ont été isolés du tissu adipeux périvasculaire aortique et mésentérique (aPVAT et mPVAT, respectivement) et adipeux gonadique chez des rats mâles de 10 semaines. La prolifération des cellules a été mesurée par un dosage de quantification d'ADN à 8, 24, 48 et 96 h après le semis. Les données sont exprimées en augmentation de pli sur une base de 8 h ± SEM (N = 4). La signification est indiquée par * (P <0,05). Figure modifiée par Contreras et al . 2016 13 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Cellules progénitrices d'adipocytes (APC) ne montrent aucune variation dans DifferentiaCapacités de partage entre les dépôts, mais accumulation de lipides supérieurs par rapport à la fraction vasculaire Stromal (SVF). Les cellules ont été induites après 48 h de confluence et exposition à BMP4, suivies de 48 h d'exposition à la dexaméthasone et de la 3-isobutyl-1-méthylxanthine, puis maintenues dans des milieux de maintien 14 jours avec des changements de média toutes les 48 h. ( A ) Essai d'absorption de lipides d'APC différenciée avec des données exprimées en proportion de préadipocytes indifférenciés: adipocytes différenciés (préadipocytes: adipocytes) dans des unités de fluorescence relative (RFU) ± SEM (N = 4). ( B ) Coloration au pétrole rouge O (ORO) d'APC et de SVF avec des données exprimées en pourcentage de cellules avec des lipides (absorption ORO) ± SEM (N = 4). La signification est indiquée par * (P <0,05). Figure modifiée par Contreras et al. 2016 13 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Le rendement d'isolement des cellules progénitrices d'adipocytes viables (APC) est amélioré par le triage cellulaire activé par magnétisation (MCS). Expérience de marqueur de surface de CD34 + ( A ) et de PDGFRα + ( B ) en SVF isolé à partir de tissus adipeux périvasculaires (aortique = aPVAT, mésentérique = mPVAT) en utilisant MCS et FACS. Les données sont exprimées en nombre moyen de cellules isolées à partir de 50 mg de tissu ± SEM (N = 4). La signification est indiquée par * (P <0,05). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'objectif central de l'expérience actuelle est l'isolement, l'expansion et l'induction adipogène d'APC des dépôts PVAT. Nous présentons ici un protocole pour l'isolement de l'APC basé sur l'identification des cellules exprimant les marqueurs de surface CD34 et PDGFRα. Ces protéines de surface ont été précédemment identifiées sur APC avec des taux de prolifération élevés et le potentiel de se différencier en adipocytes blancs ou marron dans différents dépôts adipeux 14 , 15 . En sélectionnant des cellules en fonction de ces marqueurs spécifiques, nous avons pu isoler des populations APC similaires à partir de plusieurs dépôts adipeux qui correspondent au phénotype adipocytaire observé dans le PVAT sélectionné 13 . Dans nos expériences, nous avons amélioré la différenciation APC en complétant le facteur de croissance BMP4. Auparavant, Macotela et ses collègues ont démontré que les populations d'APC spécifiques des dépôts adipeux viscéraux avaient moins d'activité de BMP que celles deLes dépôts sous-cutanés lorsqu'ils ont été différenciés à moins que les milieux de culture aient été complétés par les facteurs de croissance adipogènes BMP2 ou BMP4 12 , 16 , 17 , 18 .
Comme l'isolement des cellules individuelles du tissu adipeux est difficile en raison de la fragilité des cellules, l'utilisation de MCS fournit une méthode efficace pour l'isolement cellulaire à un coût plus faible des consommables, des équipements et des ressources d'entraînement. Il est important de noter que le rendement de l'APC peut être affecté par l'âge ou la taille de l'animal et par des changements dans la température des médias et l'absence de maintien d'un environnement d'isolement stérile. La culture des cellules dans la normoxie est également importante pour la prolifération et la différenciation 19 , donc la maintenance des conditions d'incubation de l'air fait partie intégrante de la pratique de la culture. Les vitesses de centrifugation peuvent être augmentées à 800 xg si des pastilles de cellule ne se forment pas pendant tLe processus d'isolement. Vérifier l'expiration des anticorps peut également être nécessaire car le fluorochrome FITC conjugué peut se dégrader avec le temps. Changer beaucoup de collagénase type I peut également nécessiter des modifications des procédures de digestion car beaucoup peuvent varier en fonction. Si vous utilisez une autre espèce autre que le rat, un sérum spécifique et une IgG dans le tampon de blocage peuvent également être nécessaires si l'espèce hôte des anticorps est différente de celle utilisée ici.
Parmi les avantages de MCS sur FACS, il est plus économiquement possible que FACS, car les kits sont peu coûteux et peuvent être facilement achetés. Cela évite également l'achat, la maintenance et la formation d'utilisation d'un cytomètre de flux. L'utilisation de MCS permet également une liaison spécifique sans ajustement des portes pour la sélection et l'implication de fluorescence de fond.
Une limitation à cette étude est qu'il reposait sur deux marqueurs de surface préadipocytaire. Autres marqueurs de surface préadipocytaire d'engagement et diffComme Zfp423, Sca1 et CD24, ont été identifiés 20 , 21 . Ces marqueurs peuvent identifier avec précision les cellules progénitrices adipocytes engagées de phénotypes spécifiques; Cependant, les marqueurs de surface utilisés ici ont été sélectionnés car les cellules exprimant ces marqueurs ont la capacité d'induire à la fois des phénotypes bruns et blancs 20 , 21 . Une autre limitation de cette étude était l'utilisation sélective des facteurs de croissance dans la culture APC. D'autres cocktails de facteurs de croissance ont été efficaces dans l'induction de l'adipogenèse 22 . La culture cellulaire dans cette étude était également limitée par le fait que toute culture était réalisée dans des plaques de culture bidimensionnelles. Bien que ce soit la norme de culture, les cellules in vivo ne prolifèrent pas de cette façon. La culture dans des environnements tridimensionnels peut permettre une hypertrophie et une hyperplasie supplémentaires car elle réplique la forme naturelle de la st adipeuseRucture 23 .
En raison de la fonctionnalité et de l'efficacité de l'utilisation de MCS, ce protocole est idéal pour l'isolement d'APC ainsi que d'autres types de cellules dans PVAT. Cette procédure fournit également un moyen plus efficace d'induire une différenciation dans les cultures de preadipocytes. Le coût minimal, l'équipement et la formation nécessaires permettent d'utiliser cette méthode dans tout laboratoire souhaitant isoler les cellules en fonction de marqueurs de surface spécifiques. Les applications futures peuvent permettre l'isolement d'autres populations cellulaires ou l'utilisation de marqueurs cellulaires plus spécifiques. L'utilisation de cocktails à facteur de croissance dans l'engagement cellulaire peut être utile dans l'activation des cellules souches
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les Laboratoires Contreras et Watts et le Dr William Raphael. Ces expériences ont été supportées par NHLBI F31 HL128035-01 (standardisation du protocole de digestion des tissus), NHLBI 5R01HL117847-02 et 2P01HL070687-11A1 (animaux) et NHLBI 5R01HL117847-02 (isolement et culture cellulaire).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC-conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48-Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
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