Summary
Hier worden een methode beschreven voor het isoleren van Adipocyte Progenitor Cell (APC) populaties uit Perivascular Adipose Tissue (PVAT) met behulp van Magnetisch-geactiveerde Cell Sorting (MCS). Deze methode zorgt voor een verhoogde isolatie van APC per gram vetweefsel in vergelijking met Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS).
Abstract
Uitbreiding van Perivasculaire Adipose Tissue (PVAT), een belangrijke regulator van vasculaire functie door paracrine signalering, is direct gerelateerd aan de ontwikkeling van hypertensie tijdens obesitas. De omvang van hypertrofie en hyperplasie hangt af van de plaats van de depot, het geslacht, en het type van adipocyte progenitorcel (APC) fenotypes aanwezig. Technieken die zijn gebruikt voor APC en preadipocytenisolatie in de afgelopen 10 jaar, hebben de nauwkeurigheid verbeterd waardoor individuele cellen kunnen worden geïdentificeerd op basis van specifieke celoppervlakmarkers. Isolatie van APC en adipocyten kan echter een uitdaging zijn als gevolg van de fragiliteit van de cel, vooral als de intacte cel moet worden behouden voor celcultuurtoepassingen.
Magnetisch geactiveerde Cell Sorting ( MCS) verschaft een methode om een groter aantal levensvatbare APC per gewicht eenheid van vetweefsel te isoleren. APC geoogst door MCS kan worden gebruikt voor in vitro protocollen om prea uit te breidenDipocyten en onderscheiden ze in adipocyten door gebruik te maken van groeifactorcocktails die het mogelijk maken om te analyseren van het prolifische en adipogene potentieel dat door de cellen wordt bewaard. Dit experiment was gericht op de aorta en mesenterische PVAT depots, die een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van hart- en vaatziekten tijdens de expansie. Deze protocollen beschrijven methoden om een gedefinieerde populatie APC te isoleren, uit te breiden en te differentiëren. Dit MCS-protocol maakt het mogelijk om isolatie te gebruiken in elk experiment waarbij celsortering nodig is met minimale apparatuur of training. Deze technieken kunnen verdere experimenten helpen om de functionaliteit van specifieke celpopulaties te bepalen op basis van de aanwezigheid van celoppervlakmarkers.
Introduction
Perivasculaire Adipose Tissue (PVAT), vanwege de nabijheid van bloedvaten, is een belangrijke paracrine signalering component in vasculature functie 1 . Uitbreiding van dit vetweefsel is afhankelijk van het fenotype van de aanwezige 2 , 3 Adipocyte Progenitor Cells (APC). Isolatie van cellen uit vetweefsels is moeilijk aangezien primaire adipocyten fragiel, vloeibaar en omvangrijk zijn. Bepaalde isolatietechnieken kunnen ook het celfenotype en de morfologie veranderen door de inflammatoire eiwitsynthese te verhogen en de adipogene genuitdrukking 4 te verminderen , waarbij het belang van een protocol dat de integriteit van de cellen handhaaft, benadrukt.
Cultuur van primaire cellen en specifieke preadipocyt subpopulaties geeft een reductieve aanpak van in vivo groei en handhaaft equivalente cellulaire genetische make-up 5 , hoewel werkende tiIk met deze cellen is beperkt vanwege verslechtering met veroudering of senescentie 6 . Preadipocyten uit verschillende adipose depots, waaronder subcutane en omale depots, tonen ook verschillen in proliferatie 7 , die het belang benadrukken van het verzamelen van cellen uit specifieke anatomische plaatsen. Voorlopercellen van non-PVAT white adipose depots zijn gekenmerkt in eerdere studies 7 , 8 , 9 , maar minder is bekend over PVAT APC fenotypen.
De hier beschreven technieken maken het mogelijk om specifieke en gedefinieerde APC populaties te analyseren met een minimale impact op hun morfologie, levensvatbaarheid en potentieel om te prolifereren en te differentiëren. Magnetisch geactiveerde Cell Sorting (MCS) is vatbaar voor downstream toepassingen, zoals cultuur, als de kralen oplossen zonder de cel te veranderen. MCS is ook economisch, en zodra het antilichaam conCentraties zijn gestandaardiseerd, de behoefte aan flow cytometrie assays is minimaal. In vitro studies met PVAT precursoren kunnen ook een beeld geven van het potentieel dat deze primaire cellen kunnen hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die in dit artikel worden beschreven, volgen de richtlijnen die zijn vastgesteld door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) van de Michigan State University. Alle buffers en media moeten beschermd zijn tegen licht.
1. Bereiding van buffers, media en instrumenten
- Bereid Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered oplossing (KRBB): 135 mM natriumchloride, 5 mM kaliumchloride, 1 mM magnesiumsulfaat, 0,4 mM kaliumfosfaat dibasisch, 5,5 mM glucose, 1% antibiotica / antimycotisch (10.000 eenheden / ml penicilline, 10.000 μg / ML streptomycine, 25 μg / ml amphotericin B) en 10 mM HEPES (pH = 7,4). Deze oplossing is stabiel gedurende 3 weken wanneer het steriel wordt gehouden en bij 4 ° C.
- Bereid Collagenase Type 1 Oplossing: 1 mg / ml in KRBB met 4% Bovine Serum Albumin (BSA). Deze oplossing moet bij 37 ° C gehouden worden en is stabiel gedurende 4 uur.
- Bereid Erythrocyt Lysis Buffer Oplossing: 154 mM ammoniumchloride, 10 mM kaliumbicarbonaat, En 0,1 mM EDTA. Houd bij maximaal een maand bij 4 ° C.
- Bereid MCS Blocking Buffer: DMEM / F12 Media Base, 10% Fetaal Bovine Serum (FBS), 5% Normaal Donkere Serum, 40 μL / mL F (ab) Fragment Ezel Anti-Rat IgG. Houd bij maximaal een maand bij 4 ° C.
- Bereid MCS Buffer Oplossing: Fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS, pH = 7,5), 0,5% BSA en 2 mM EDTA. Houd bij maximaal een maand bij 4 ° C. De-gasoplossing door verwarmen tot 37 ° C in een glazen houder en daarna een vacuüm gedurende 15 s aanbrengen. Laat ongebruikt gebufferd verzegeld.
- Bereid Stromale Vasculaire Fractie (SVF) Basal Media: Dulbecco's-Modified Eagles Medium (DMEM): F12, 15% Fetaal Kalf Serum (FCS), 1% Antibiotica / Antimycotische (10.000 Eenheden / ml Penicilline, 10.000 μg / mL Streptomycine, 25 μg / Ml amphotericin B), 44,05 mM natriumbicarbonaat, 100 μM ascorbinezuur, 33 μM biotine, 17 μM pantothenaat, 2 mM L-glutamine en 20 mM HEPES. Blijf steriel en bij maximaal 2 weken bij 4 ° C.
- Bereid APC &# 160; Media: Basaalmedia met extra groeifactoren inclusief epidermale groeifactor 10 ng / ml), leukemie-remmende factor (10 ng / ml), bloedplaatjes afgeleide groeifactor BB (10 ng / ml) en basale fibroblastgroeifactor 5 ng / ml). Blijf steriel en bij maximaal 2 weken bij 4 ° C.
- APC-inductiemedium voorbereiden: APC-medium met 10% FBS, 2,5 μg / ml insuline, 0,5 mM 2-isobutyl-1-methylaxanthine (IBMX), 1 μM dexamethason en 200 pM T3 (triiodothyronine schildklierhormoon). Blijf steriel en bij maximaal 2 weken bij 4 ° C.
2. Adipocyten Progenitors Isolatie
- Anesthetiseer de rat volgens de institutionele richtlijnen. Plaats de rat in dorsale recumbency. Bevestig diepte van de verdoving via een teenknijp en het verlies van de reflexrespons op deze pijnlijke stimulus.
OPMERKING: Dit protocol gebruikt 10 weken oude Sprague Dawley ratten en 70 mg / kg pentobarbital, afgeleverd via een intraperitoneale injectie. - Maak een verticale middenlijn incisie wMet een schaar langs de sternum in het thoraxgebied en naar het perinealgebied. Toegang tot de buikholte en blootstelling aan de superieure mesenterische slagader, de kleine mesenterische weerstandsvaten (mPVAT) en de thoracale aorta (aPVAT).
- Verbind alle verbindingen met de mesenterie en aorta en verwijder vaten van dieren. Isoleer PVAT door gebruik te maken van een dissectiemicroscoop en Petri schaal gevuld met KRBB om vaten te bekijken en PVAT te isoleren.
- In dit experiment, verzamelen gonadale (GON) adipose om een non-PVAT adipose depot te vertegenwoordigen. Plaats geïsoleerde vetpadsjes op ijs in KRBB met 10 mM HEPES (pH = 7,4).
- Plaats in een biosafety-kap ongeveer 50 mg weefsel op een 1,7 ml buis met 1 ml collageenase type I-oplossing en maalvlees met weefselschaar (1 - 3 mm stuks).
- Digest monsters door incubatie bij 37 ° C in een rotisserie incubator (of incubator met een orbitale shaker) gedurende 1 uur. In een biosafety kap, sequentief filter verteerde materiaal door 100 en 40 Μm celspijpers in een 50 ml buis. Centrifuge resulterend filtraat bij 4 ° C gedurende 10 min bij 300 x g.
OPMERKING: Alle stappen in het protocol vanaf hier naar voren moeten in een biosafety-kap worden uitgevoerd om de cellen steriel te houden. - Haal supernatant af en pellets resuspenderen die de SVF-cellen bevatten in 1 ml EXHROCYTE Lysis Buffer Oplossing en overbrengen naar een 1,7 ml microfuge buis. Incubeer cellen gedurende 5 minuten bij RT, beschermd tegen licht en centrifuge bij 4 ° C gedurende 5 minuten bij 300 x g.
- Haal supernatant af en verwijder de resterende celpellet in SVF Basal Media. Verzamel een 20 μL submonster om levende cellen met Trypan Blue Solution te tellen.
OPMERKING: het aantal afzonderlijke SVF-cellen kan per site verschillen. Gemiddeld aantal SVF geoogst per mg weefsel zijn: aPVAT = 5,0 ± 2,0x10 3 , mPVAT = 1,04 ± 0,62x10 4 , GON = 2,4 ± 1,2x10 5 .
3. Magnetisch geactiveerde celsortering
_content "> OPMERKING: APC isoleren van SVF op basis van CD34- en PDGFRα-celoppervlakmarkeringen door alle stappen bij 4 ° C uit te voeren.- Spincellen gedurende 5 minuten bij 300 x g. Haal supernatant af en verwijder de celpelletjes in MCS Blocking Buffer bij 1 x 106 cellen / ml en incubeer gedurende 20 minuten.
OPMERKING: Cell suspensies van 1 x 10 6 - 2 x 10 8 cellen / ml kunnen effectief gescheiden worden. - Incubeer cellen met 5 μl FITC-geconjugeerde Muis anti-CD34 (1 μg / 1 x 106 cellen) gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Spincellen gedurende 5 minuten bij 300 xg en 4 ° C.
- Incubeer met 4 μl anti-FITC microbeads en 96 μl MCS buffer (totaal volume van 100 μl) gedurende 5 min bij 4 ° C in het donker om CD34 + en CD34 - cellen te scheiden.
- Bevestig de magnetische scheider op de stand en plaats de MultiSort (MS) kolom, met de kolomvleugels naar voren, in de scheider. Plaats een 5 mlCollectiebuis onder de MS-kolom in de bovenbuishouder.
- MS Column voorbereiden door te spoelen met MCS Buffer Solution. Breng 500 μL MCS Buffer boven op de kolom en laat de buffer doorlopen. Verwijder afvalwater en vervang de collectiebuis.
- Laad antilichaam gemerkt celsuspensie op de bereide MS Column. Verzamel doorstroming met ongemerkte cellen.
- MS-kolom wassen met 500 μl afgegasde MCS-buffer 3x. Verzamel ongemerkte cellen die doorgaan en combineren met de doorstroming van de vorige stap.
- Verwijder MS Column uit de magnetische scheider en plaats deze op een nieuwe collectiebuis. Pipetteer 1 ml MCS buffer op de MS Column. Spoel de fractie met de magnetisch gelabelde cellen onmiddellijk stevig af, maar langzaam, met behulp van de zuiger die bij de kolom wordt geleverd, om niet overmaat gas in de kolom toe te laten.
OPMERKING: geïsoleerde cijfers zullen per site verschillen. Gemiddelde cijfers CD34 + APC geïsoleerd uit de SVF populatie perMg weefsel zijn: aPVAT = 2,6 ± 0,43x10 2 , mPVAT = 9,6 ± 1,4x10 2 , GON = 1,3 ± 0,22x10 3 . - Spincellen gedurende 5 minuten bij 300 × g en 4 ° C. Incubeer de CD34 + fractie verzameld in 10 μl van een 1: 200 oplossing / 1 x 106 cellen Konijn anti-PDGFRa gedurende 30 min bij 4 ° C.
- Centrifugeer cellen opnieuw gedurende 5 minuten bij 300 xg en 4 ° C. Incubate gemerkte cellen met 4 μl anti-konijn IgG microbeads en 96 μl MCS buffer door stappen 3.3 tot 3.7 te herhalen om te isoleren.
OPMERKING: geïsoleerde cijfers zullen per site verschillen. Gemiddelde aantallen PDGFRα + APC geïsoleerd uit de CD34 + populatie per mg weefsel zijn: aPVAT = 2,4 ± 0,64, mPVAT = 8,4 ± 2,4, GON = 10,4 ± 1,9, dat is 0,5 - 10% van de eerder geïsoleerde populatie.
- Centrifugeer cellen opnieuw gedurende 5 minuten bij 300 xg en 4 ° C. Incubate gemerkte cellen met 4 μl anti-konijn IgG microbeads en 96 μl MCS buffer door stappen 3.3 tot 3.7 te herhalen om te isoleren.
4. Celcultuur en Adipogenese Inductie
- Cultuur de SVFEn APC in 6-Well weefselkweekplaten in basale media met vervanging elke 2 dagen. Na 3 seriële passages, plaat in zwarte 96-Well weefselkweekplaten bij 1x10 2 cellen / putjes voor proliferatiebepalingen, die geëvalueerd worden op 8, 24, 48 en 96 uur en bij 50.000 cellen / put in platen met 24 putjes of 10.000 cellen / put in 48-Weefselkweekplaten voor adipogenese-assays, die kwalitatief en kwantitatief zijn.
- Supplement APC basale media gedurende 48 uur na confluentie en voorafgaand aan inductie met botmorfogen eiwit 4 (3,3 nmol / L) zoals aangegeven 10 voor differentiatie. Induceer cellen na 48 uur 100% confluency (dag 0) met behulp van de APC Inductie Media om de cellen te incuberen.
- Na 48 uur, verander de media om cellen in APC Inductiemedia zonder IBMX en dexamethason te behouden, gedurende 14 dagen met mediawijzigingen om de 48 uur.
- MCS isolatie gevalideerd door FACS.
- Neem een 50 μl (50.000 cel) submonster van magnetisch scheidenAted cellen en wassen met FACS oplossing.
- Centrifuge cellen en resuspenderen in 100 μl van een 1: 1.000 oplossing van ezel anti-konijn IgG Dylight 405 om de PDGFRα + cellen te labelen. Incubeer gedurende 30 minuten beschermd tegen licht en bij 4 ° C.
- Wascellen en resuspenderen in 200 μl 2% formaldehyde oplossing tot de tijd voor analyse met behulp van 488 nm (FITC) en 405 nm (Dylight 405) filters op een flow cytometer.
OPMERKING: Lipide accumulatie door gekweekte cellen wordt kwantitatief beoordeeld met behulp van een lipofiele adipogenese fluorescentie test in een microplate reader die fluorescentie meet en preadipocyten gebruiken als kalibratoren voor lipide accumulatie. Lipide accumulatie wordt ook kwalitatief gemeten door lipide kleurstofverf en beeldvorming uitgevoerd op een omgekeerde microscoop uitgerust met een camera, waardoor het percentage van de totale cellen die lipide waarneembaar of niet bevat, bevat. Elke plaatlezer die fluorescentie met excitatie bij 485 nm en emissie bij 572 kan metenNm is geschikt voor analyse, evenals elke microscoop met een camera die digitale beelden kan vastleggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proliferatieve capaciteit van preadipocyten en adipogeen potentieel van adipocytprecursoren zijn kenmerken die in vitro worden gehandhaafd 11 . In vitro proliferatie van geïsoleerde SVF en APC uit aPVAT, mPVAT en GON van mannelijke ratten werd geëvalueerd op 8, 24, 48 en 96 uur na plating onder toepassing van een kwantitatieve DNA-analyse. Er werden geen plaatsverschillen in SVF-expansiesnelheid op elk moment waargenomen, behalve de APC van aPVAT, die 96 uur minder proliferatie vergeleken had met SVF-cellen van dezelfde plaats ( Figuur 1 ).
Confluent APC gestimuleerd met botmorfogeen eiwit 4 (BMP4) gedurende 48 uur voorafgaand aan standaardinductie 12 vertoonde differentiatie. Dit bleek door grotere lipide accumulatie in druppels zoals geëvalueerd door zowel fluorescerende lipide opname assay ( Figuur 2A ) en Olie Rode O-kleuring ( Figuur 2 B ).
Bij het vergelijken van de opbrengst van APC produceerde MCS-isolatie een groter aantal cellen die klaar waren voor cultuur in vergelijking met FACS. ( Figuur 3 ) Het is belangrijk dat de verdeling en levensvatbaarheid van APC populaties (CD34 + en PDGFRα + ) vergelijkbaar zijn tussen MCS en FACS. Cel levensvatbaarheid bepaald door Trypan Blue staining voor het tellen na isolatie was vergelijkbaar voor beide isolatieprocedures (FACS = 71,57% ± 11,09; MCS = 79,25% ± 7,47). Deze gegevens tonen aan dat het MCS-isolatie van APC een hoger aantal levensvatbare APC's geeft in vergelijking met MCS.
Figuur 1 : In vitro proliferatie van adIpocyte Progenitor Cells (APC) is beïnvloed door anatomische locatie. Stromale Vasculaire Fractie (SVF) en APC werden geïsoleerd uit aorta en mesenterisch perivasculaire vetweefsel (respectievelijk aPVAT & mPVAT) en gonadale adipose uit 10 weken oude mannelijke ratten. Proliferatie van cellen werd gemeten door een DNA-kwantificatietest bij 8, 24, 48 en 96 uur tijdspunten na het zaaien. Gegevens worden uitgedrukt als vouwverhoging over 8 uur basislijn ± SEM (N = 4). Betekenis is aangegeven met * (P <0,05). Figuur gewijzigd van Contreras et al . 2016 13 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 : Adipocyt Progenitor Cells (APC) Toon geen variatie in DifferentiaBehandelingsmogelijkheden tussen Depots, maar grotere lipideaccumulatie in vergelijking met Stromale Vasculaire Fractie (SVF). Cellen werden geïnduceerd na 48 uur confluentie en blootstelling aan BMP4 gevolgd door 48 uur blootstelling aan dexamethason en 3-isobutyl-1-methylxanthine en vervolgens in onderhoudsmiddelen 14 dagen bijgehouden, waarbij de media elke 48 uur veranderd werden. ( A ) Lipid opname assay van gedifferentieerde APC met data uitgedrukt als verhouding van ongedifferentieerde preadipocyten: gedifferentieerde adipocyten (preadipocyten: adipocyten) in relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) ± SEM (N = 4). ( B ) Olie Rode O (ORO) kleuring van APC en SVF met gegevens uitgedrukt als percentage cellen met lipide (ORO Opname) ± SEM (N = 4). Betekenis is aangegeven met * (P <0,05). Figuur gewijzigd van Contreras et al. 2016 13 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 : Isolatieopbrengst van levensvatbare adipocytprogenitorcellen (APC) is verbeterd door magnetisch geactiveerde celsortering (MCS). Oppervlakte markering expressie van CD34 + ( A ) en PDGFRα + ( B ) in SVF geïsoleerd uit perivasculaire vetweefsels (aorta = aPVAT; mesenteric = mPVAT) met behulp van MCS en FACS. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddeld aantal cellen geïsoleerd uit 50 mg weefsel ± SEM (N = 4). Betekenis is aangegeven met * (P <0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De centrale focus van het onderhavige experiment is de isolatie, expansie en adipogene inductie van APC van PVAT depots. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van APC op basis van de identificatie van cellen die de oppervlakte markers CD34 en PDGFRα uitdrukken. Deze oppervlakte-eiwitten werden eerder geïdentificeerd op APC met hoge proliferatiecijfers en het potentieel om te onderscheiden in witte of bruine adipocyten in verschillende adipose depots 14 , 15 . Door cellen op basis van deze specifieke markers te selecteren, waren we in staat om soortgelijke APC populaties te isoleren uit meerdere adipose depots die overeenkomen met het adipocyt fenotype dat waargenomen wordt in de PVAT geselecteerde 13 . In onze experimenten hebben we APC-differentiatie verbeterd door de groeifactor BMP4 aan te vullen. Eerder hebben Macotela en collega's aangetoond dat specifieke APC populaties uit viscerale adipose depots minder BMP activiteit hadden dan die vanSubcutane depots wanneer gedifferentieerd, tenzij cultuurmedia werd aangevuld met de adipogene groeifactoren BMP2 of BMP4 12 , 16 , 17 , 18 .
Aangezien de isolatie van individuele cellen uit vetweefsel moeilijk is door de fragiliteit van de cellen, biedt MCS een efficiënte methode voor celisolatie tegen een kleinere kosten van verbruiksartikelen, apparatuur en opleidingsbronnen. Het is belangrijk om op te merken dat de APC-opbrengst kan worden beïnvloed door de leeftijd of de grootte van het dier en door veranderingen in de temperatuur van de media en het niet in stand houden van een steriele isolatieomgeving. Cultiverende cellen in normoxia is ook belangrijk voor proliferatie en differentiatie 19 , waardoor het onderhoud van incubatieluchtomstandigheden integraal is bij de cultuurpraktijk. Centrifugatiesnelheden kunnen worden verhoogd tot 800 xg indien er voldoende celpellets tijdens t worden gevormdHij isolatie proces. Het controleren van het verstrijken van de antilichamen kan ook nodig zijn, aangezien het geconjugeerde FITC fluorochroom in de loop der tijd kan afbreken. Door veel Collagenase Type I te veranderen, kunnen ook veranderingen in de spijsverteringsprocedures nodig zijn, aangezien veel in potentie kunnen variëren. Bij gebruik van een andere soort dan ratten kan specifiek serum en IgG in de blokkerende buffer ook nodig zijn als de gastersoorten van de antilichamen verschillen van die welke hier gebruikt worden.
Onder de voordelen van MCS over FACS zijn dat het economischer haalbaar is dan FACS, omdat kits goedkoop zijn en gemakkelijk kunnen worden gekocht. Dit vermijdt ook de aankoop, onderhoud en gebruikstraining van een flow cytometer. Met behulp van MCS staat ook specifieke binding toe zonder aanpassing van poorten voor selectie en achtergrond fluorescentie betrokkenheid.
Een beperking op deze studie is dat het vertrouwde op twee preadipocyt oppervlak markers. Andere preadipocyt oppervlak markers van inzet en diffErentatie, zoals Zfp423, Sca1 en CD24, zijn geïdentificeerd 20 , 21 . Deze markers kunnen nauwkeurig geïdentificeerde gepaste adipocyt-stamcellen van specifieke fenotypen identificeren; De hier gebruikte markeringsmarkeringen werden echter geselecteerd aangezien cellen die deze markers uitdrukken, het vermogen hebben om zowel bruine als witte fenotypes 20 , 21 te induceren. Een andere beperking van deze studie was het selectieve gebruik van groeifactoren in de APC-cultuur. Andere groeifactor cocktails zijn effectief bij de inductie van adipogenese 22 . Celcultuur in deze studie werd ook beperkt door het feit dat alle cultuur in tweedimensionale cultuurplaten werd gedaan. Hoewel dit de culturele norm is, vermenigvuldigen cellen in vivo op deze manier niet. Culturen in driedimensionale omgevingen kunnen extra hypertrofie en hyperplasie mogelijk maken aangezien het de natuurlijke vorm van de adipose stRucture 23 .
Vanwege de praktische en efficiëntie van het gebruik van MCS is dit protocol ideaal voor de isolatie van APC en andere celtypes in PVAT. Deze procedure biedt ook een effectievere manier om differentiatie in preadipocytculturen in te leiden. De minimale kosten, apparatuur en training vereisen, laat deze methode toe in elk lab dat cellen op basis van specifieke oppervlakmarkeringen wilt isoleren. Toekomstige toepassingen kunnen de isolatie van andere celpopulaties of het gebruik van meer specifieke celmarkers toestaan. Gebruik van groeifactorcocktails in celverbintenis kan nuttig zijn bij het stimuleren van stamcellen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De Contreras en Watts Laboratories en Dr. William Raphael. Deze experimenten werden ondersteund door NHLBI F31 HL128035-01 (weefselvertering protocol standaardisatie), NHLBI 5R01HL117847-02 en 2P01HL070687-11A1 (dieren) en NHLBI 5R01HL117847-02 (celisolatie en cultuur).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC-conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48-Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Stacey, G. in eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
- Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
- Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
- Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
- Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
- Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034 (2015).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
