Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Жить клеточной измерение одоранта рецептор активации с помощью реального времени лагеря Assay

Published: October 2, 2017 doi: 10.3791/55831
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 1,4
1Department of Pathophysiology, Key Laboratory of Cell Differentiation and Apoptosis of National Ministry of Education, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 3Department of Neurobiology, Duke Institute for Brain Sciences, Duke University Medical Center, 4Institute of Health Science, Chinese Academy of Science/Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Характеризующие функцию одоранта рецепторов служит неотъемлемым элементом в процессе deorphanization. Мы описываем метод измерения активацию рецепторов одоранта в режиме реального времени, используя лагеря пробирного.

Abstract

Огромные размеры млекопитающих одоранта рецептор (OR) семей нынешних трудностей найти их родственных лигандам среди многочисленных летучих химических веществ. Чтобы эффективно и точно deorphanize ПРС, мы совмещаем использование гетерологичных клеточной линии выразить млекопитающих СПР и плазмида генетически модифицированных биосенсора для измерения лагеря производства или активации в режиме реального времени. Этот assay может использоваться для экрана отдушки против СПР и наоборот. Позитивные одоранта рецептор взаимодействия с экранов могут быть впоследствии подтверждены тестирование против различных концентрациях запах, генерации концентрация реакция кривых. Здесь мы использовали этот метод для выполнения высокопроизводительного скрининга пахучие соединения против человека или библиотека выражена в Hana3A клетках и подтвердил, что положительно отвечать рецептор родственных рецептор для соединения интереса. Мы нашли этот метод обнаружения высокой пропускной способностью, чтобы быть эффективной и надежной оценки или активации и наши данные представляют собой пример ее возможного использования в или функциональные исследования.

Introduction

Обоняние играет важную роль в выживании животных как они полагаются на их обонятельные способности получить пищу, избежать хищников и опасности, различать виды и выберите мат1,2. Реализация этих функций зависит от рецепторов одоранта (СПР), которые выражаются в отдельности на поверхности цилиарной обонятельной сенсорных нейронов (OSNs) расположен в обонятельного эпителия (OE). СПР составляют крупнейший семейство рецепторов (GPCR) надсемейства G-белка в сочетании с приблизительно 400 и 1200 различных или генов человека и мыши, соответственно3,4,5. СПР, активированную отдушки ведут к повышению внутриклеточного уровня лагеря через последовательное активации обонятельных G-белка (ФООG) и тип III adenylyl циклазы (ACIII). Результате повышенный уровень внутриклеточного лагерь может функционировать как второй messenger, который открывает нуклеотида закрытый канал на поверхности клеток, вызывая приток катионов включая Ca2 + и потенциалы действия и в конечном итоге инициирование Нейро потенциал передачи и обонятельные восприятия. Процесс обнаружения и дискриминацию большое количество отдушки, ORs рассматривается в качестве первого шага обонятельных восприятие6,7.

Поскольку первый бак и Аксель8 успешно клонирован одоранта рецепторов и выяснены механизм восприятия обоняния, инициированных ORs, deorphanization или семьи стал одним из горячих точек в этой области. Различные методы в vivo, ex vivo и in vitro для измерения или активации были сообщил9,10,,1112. Традиционный метод, который используется Ca2 + изображения следуют одной ячейки ПЦР-на OSNs включено выявление различных ORs алифатических отдушки13,14,15. Совсем недавно с появлением крупномасштабных транскриптом анализ способствовал развитию более высокой пропускной способностью в vivo методов. Кентукки пробирного определены ORs эвгенол и отзывчивым Мускон мыши с использованием S100a5-tauGFP репортер мыши деформации и microarray анализ9. Основываясь на снижение уровня мРНК или после экспозиции одорант, мечта технология используется транскриптомики подход, чтобы определить или активации профили в обоих видов позвоночных и не позвоночных16. Аналогичным образом учитывая фосфорилирование S6 в нейрональных активаций, Мацунами группы виртуализированного мРНК из фосфорилированных рибосома immunoprecipitations для идентификации реагировать ORs12. Наконец группе Файнштейн сообщил супер снифер мышей, которые могли бы служить в качестве платформы для изучения запах кодирования в естественных условиях, известный как MouSensor технология17.

В realm в пробирке проблема культивирования OSNs делает гетерологичных выражение системы, которая имитирует или функциональных выражение в vivo идеальное решение для проведения крупномасштабных скрининг пахучих химических веществ для ОРС. Тем не менее поскольку искусственный клеточных линий не обонятельных происхождения отличаются от родной OSNs или белки сохраняются в эндоплазматический ретикулум и не в состоянии движения к плазматической мембраны, что приводит к или деградации и потери функции рецепторов18 , 19. для решения этой проблемы, обширные работы были сделаны для репликации или функциональных выражение на клеточной мембране в гетерологичных клеточных линий. Krautwurst et al. сначала придает первые 20 аминокислот родопсина (Ро тег) N-стержня или белка, и это способствовало клетк поверхности выражение некоторых ОРС в клетки человеческого эмбриона почек (ГЭС)20. Путем проведения последовательного анализа ген выражение (SAGE) библиотека анализа от одного OSNs, Сайто и др. Первые клонированные транспортировки рецептор белков (RTP) членов семьи, RTP1 и RTP2 и рецепторы трансферина выражение усилитель 1 (REEP1), или людьми с клеточной мембраны и повысило одоранта опосредованной ответы ORs в HEK293T клетках 21. Основываясь на этих выводах, Мацунами группа успешно создана линия клеток Hana3A, стабильно transfected сФОО RTP1, RTP2, REEP1 и Gα в HEK293T и временно transfected с меткой Ро СПР, для эффективного или функциональных выражение. Последующие исследования показали 1) короче форма RTP1, RTP1S, могли бы более энергично содействовать или работать чем оригинальный RTP1 белка и 2 тип 3 мускариновых ацетилхолиновый рецептор (M3R), которые могли бы укрепить деятельность или через ингибитирование β-arrestin-2 вербовка, оба из которых были введены к системе гетерологичных выражение для оптимизации экспериментальный выход22,23.

Некоторые методы обнаружения были использованы для количественной оценки активации рецептора в гетерологичных систем. Assay секретируемые плацентарной щелочной фосфатазы (СЕАП) работает с репортером фермента транскрипционно регулируется лагеря ответ элементов (КРЕС), что делает его привлекательным вариантом для оценки или активации. Флюоресценция легко обнаруживается в выборке из питательной среды после инкубации с СЕАП обнаружения реагент24. С помощью этого метода, функции СПР, а также среднего класса влагалище рецепторов, выраженная в OE-трассировки, которые Амин связанные рецепторы (TAARs) были охарактеризованы25,,2627. Другой общий метод, Люцифераза assay, использует Светлячок Люцифераза Репортер ген под контролем лагеря ответ элемента (КРР). Измерения люминесценции, порожденных Люцифераза производства обеспечивает эффективные и надежные средства количественного или активации10,11,28.

Реальном времени лагеря анализов также широко используется в динамически мониторинг функции гетерологичных или эндогенных GPCR. Одним из примеров таких передовых анализов использует генетически закодированный биосенсор вариант, который обладает сплавили мутантные формы Люцифераза домен лагерь привязки. Когда лагерь связывает, конформационные изменения приводит к активации Люцифераза, люминесценции, из которого затем может быть измерена с хемилюминесценции читателя29,30. Реального времени лагеря технологии было сообщено подходит для исключения из сирот человека одоранта рецепторы в клетках 108CC15 HEK293 и NxGпопка = «внешней» > 31,,3233, как хорошо, как и HEK293T-производные Hana3A клетки34,35. Krautwurst группа также подробно описано в реальном времени лагеря технологии пригодны для двунаправленного крупномасштабных или отбора подходы32,33.

Здесь мы описываем протокол для измерения или активации с помощью реального времени пробирного лагеря в Hana3A клетках. В этом протоколе люминесценция предварительно уравновешенной живых клеток измеряется кинетически 30 мин после лечения с конкретными летучих соединений, представляющих более эффективный и точный анализ или активации, которые менее чувствительны к артефакты, возникающие в клеточной среды с длительное время и запах индуцированной клеток токсичности. Это измерение в реальном времени позволяет для крупномасштабных скрининг СПР и лигандами, а также характеристика конкретных пар или лиганд интерес. С помощью этого метода, мы успешно определили OR5AN1 как рецептор для составных Мускон мускус, выполняя скрининг против 379 людские ORs и впоследствии подтверждающий результат положительный скрининга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Culturing и обслуживание клетки Hana3A

  1. сохранить клетки в 10 мл минимальных основных средних (MEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 100 мкг/мл пенициллин стрептомицином и 1,25 амфотерицин B мкг/мл в 100-мм клетки культуры блюдо в инкубатор культуры клеток 37 ° C с 5% CO 2. С каждой другой проход, добавить 1 мкг/мл puromycin для поддержания стабильной трансфекции плазмид (см. Введение).
    Примечание: Все действия с участием культуры клеток в классе II биологической безопасности кабинета для обеспечения стерильную среду.
  2. Субкультуры в соотношении 10-20% в 100-мм блюда каждые 2-3 дня.

2. Покрытие для Transfection клетки

  1. наблюдать Hana3A клетки под микроскопом фазово контрастной обеспечить жизнеспособность клеток и оценить слияния.
  2. Аспирационная всех средних из клетки культуры блюдо.
  3. Мыть ячейки, добавив 10 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS) на пластину, закрученной блюдо и аспирационных PBS.
  4. Добавить 3 мл 0,05% трипсина этилена диамин tetraacetic кислоты (ЭДТА) на пластину. Mix 1 мин, или до тех пор, пока все ячейки на плаву.
    Примечание: Наблюдать прогресс клеток, отсоединение от нижней части пластины под микроскопом необходимости.
  5. Неактивным трипсина, добавив 5 мл MEM с 10% FBS и пипетки вверх и вниз, чтобы разорвать куски ячейки Массачусетс
    Примечание: Для покрытия до трансфекции, средство, используемое не должен содержать антибиотики. Помимо антибиотиков может снизить эффективность трансфекции.
  6. Передавать 15 млл трубки в зависимости от количество пластин, котор нужно transfected соответствующее количество клеток. Для каждой 96-луночных пластины, пластины 2 x 10 6 клеток или примерно 1/5 блюдо вырожденная 100 мм 100% давая клеток, количество 2 х 10 4 клетки на колодец или плотность примерно 15-30% слияния за хорошо. Центрифуга трубы на 200 x g 5 мин и аспирационная супернатант не нарушая ячейки Пелле.
    Примечание: Рассчитать правильное количество клеток с покрытием на 96-луночных пластины, чтобы избежать зарастания или undergrowing клетки до стимуляции.
  7. Добавить соответствующее количество MEM с 10% FBS в 15 мл трубки и Пипетка вверх и вниз разорвать куски ячейки массы. Для каждой пластины 96-луночных Ресуспензируйте клетки с 6 мл MEM с 10% FBS.
    Примечание: Будьте осторожны, чтобы не создавать пузырьков воздуха в трубке.
  8. Добавить подвесной клетки в водохранилище. С помощью многоканальных дозаторов, Пипетка 50 мкл клеток на каждой скважине 96-луночных плиты. Инкубируйте на ночь при 37 ° C с 5% CO 2.

3. Трансфекция плазмид

  1. до трансфекции, наблюдать за покрытием клетки для обеспечения надлежащего впадения примерно 30-50% в колодец под микроскопом фазово контрастной и вернуться в инкубатор.
  2. Подготовка заранее Ро тегами или построить 11 , 21 , 22 , 28, аксессуар фактор конструирует (RTP1S 22 , 36 и M3R 23), и вариант биосенсор алкалический построить 29 , 30. Количественную оценку концентрации ДНК, спектрофотометр и отрегулируйте плазмида ДНК концентрации (например, до 100 нг/мкл) с дистиллированной водой в случае необходимости.
  3. Приготовления смесей Transfection
    1. приготовить смесь трансфекции плазмида в 500 мкл MEM для каждой пластины 96-луночных согласно таблице 1.
      Примечание: При различных ORs тестируются на пластину 96-Ну же, объем смеси transfection и количество плазмидной ДНК добавил должны быть адаптированы в зависимости от числа transfected скважин с помощью заданного или.
    2. Подготовьте смесь трансфекции в трубку с 18 мкл Реагента липидов опосредованной трансфекции в 500 мкл катализатор
  4. Перемешать смесь плазмида с трансфекции смеси, закупорить вверх и вниз. Инкубации при комнатной температуре 15 мин
  5. Остановка реакции, добавив 5 мл MEM с 10% FBS.
  6. Раскинулся толстый слой Стерильные салфетки в капюшоне культуры клеток. Возьмите тарелку 96-луночных с ячейками из инкубатора. Нежно и неоднократно нажмите пластину вверх вниз на кучу бумажной салфеткой так, что носитель полностью поглощается бумажное полотенце.
    Примечание: Не насильственно или внезапно кран пластину как одно может потерять клеток.
  7. Передачи 50 мкл комбинированных трансфекции смеси для каждой скважины 96-луночных пластины и инкубировать на ночь 18-24 ч при 37 ° C с 5% CO 2.
    Примечание: Время управляемых transfection и стимуляции расписание должно предшествовать измерения, когда более чем одна пластина 96-луночных тестируются в одном эксперименте для того чтобы иметь все пластины, измеренная после же трансфекции время и время воздействия стимула.

4. Стимуляция и измерения или деятельности с использованием реального времени лагерь Assay

  1. наблюдать transfected клеток под микроскопом фазово контрастной для обеспечения надлежащего слияния 50-80% в колодец и вернуться в инкубатор.
  2. Подготовить средство стимуляции, добавив 5 мм и 10 мм гидроксиэтилкрахмала piperazineethanesulfonic кислоты (HEPES) глюкозы в Хэнк ' s сбалансированный соли раствора (HBSS).
  3. Оттепель аликвоты реагента в реальном времени лагеря пробирного субстрата на льду. Хранить субстрата реагент-80 ° c на 55 мкл на трубу в пробирках, ПЦР. Использовать 1 тюбик на пластину.
  4. Приготовляют путем смешивания 55 мкл Реагента субстрата и 2750 мкл HBSS/HEPES/глюкозы раствор 2% раствор уравновешивания.
  5. Раскинулся толстым слоем бумажных полотенец на скамейке. Нежно и неоднократно нажмите пластину вверх вниз на бумажное полотенце, так что средний трансфекции полностью поглощается бумажным полотенцем.
  6. Мыть клетки путем дозирования 50 мкл раствора HBSS/HEPES/глюкозы в каждой скважине.
  7. Нежно и неоднократно вытряхнуть HBSS/HEPES/глюкозы раствор от пластины 96-луночных.
  8. Пипетка 25 мкл уравновешивания 2% раствора в каждую Ну и инкубации при комнатной температуре в темноте за 2 ч.
  9. Подготовить акций решения одоранта в ДМСО и хранить при температуре-20 ° C до тех пор, пока используется заранее 1 М.
  10. До их конца время инкубации, разбавить одоранта фондовых решения рабочей концентрации в среде стимуляции HBSS/HEPES/глюкозы.
    Примечание: Концентрации одоранта разведений, подготовленный на этом шаге следует удвоить приносить правильный окончательный концентрации в каждой скважине.
  11. С помощью хемилюминесценции пластины читателя и до одоранта сложения, измерения уровня базальной люминесценции пластины 2 раза подряд в размере 1000 мс за хорошо 34.
  12. Быстро удалить пластину из пластины читателя и добавить 25 мкл одоранта разведений в каждой скважине и немедленно начать измерение непрерывного свечения всех скважин для 20 циклов в течение 30 мин
    Примечание: Пипетки тщательно, чтобы избежать заражения соседних скважин при использовании различных отдушки и/или разные концентрации одорантов же в пластину же.

5. Анализ данных

  1. экспортировать данные из программного обеспечения читателя пластины хемилюминесценции.
  2. Расчет нормированный или ответ для каждой точки время, используя формулу
    (люминесценции N – люминесценции базальной) / (свечением высшей – люминесценции базальной)
    где N = люминесценции значение определенного хорошо; базальной = средняя люминесценции значение двух базальная люминесценция значения; самый высокий = максимальное значение люминесценции плиты или набор пластин.
    Примечание: В зависимости от цели эксперимента, могут быть приняты альтернативные графические представления. Например, для отбора проб (см. Рисунок 1) и для генерации концентрация реакция кривых, люминесценция значение некоторых хорошо в нужный момент во время Кинетические измерения, такие как максимальное значение или может использоваться окончательное значение, а.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мускон является основным компонентом ароматических из естественных мускус. Недавние исследования выявленных OR5AN1 как человеческого рецептора для Мускон и других макроциклических соединений мускус, основанный на гомологии мыши или, MOR215-1, клонированные из Мускон отзывчивым клубочков в себя мышей37,38. Путем проведения скрининга человека или репертуар, наша группа и группа Touhara также определили OR5AN1 как основных рецептор для двух макроциклических соединений мускус, cyclopentadecanone и Мускон, соответственно, используя Люцифераза пробирного системы38,39 .

Скрининг с использованием реального времени лагеря assay описано здесь, мы человека или репертуар против 30 мкм Мускон (рис. 1). Среди 379 людские ORs экранированный OR5AN1 появились с выдающийся ответ на Мускон, в то время как другие СПР и негативный контроль (без-запахов и пустой вектор управления) не показывают значительное ответ. Положительный контроль тестируются 30 мкм мускус tibetene, лигандом для OR5AN1 OR5AN1 (неопубликованные данные) и был использован для нормализации ORs ответ Мускон. Для графического представления этого набора данных мы выбрали момент времени, когда был достигнут максимальный люминесценции чтения для OR5AN1 против 30 мкм мускус tibetene.

Мы далее рассмотрел взаимосвязь концентрация реакция запаха-пара или с 3 различных концентраций Мускон. Для каждой концентрации Мускон испытания, в течение первых 20 мин после добавления Мускон реакция OR5AN1 постепенно увеличивалась и затем перестала расти в последние 10 минут (рис. 2A), оставив след для без запах дополнение контроля (0 мкм Мускон) относительно плоской. Более высокие концентрации Мускон вызывали сильнее или ответы чем низших, которые различимы на протяжении всего измерения. Использование точки последнего времени от Кинетические измерения, мы создается кривая концентрация реакция и концентрация для 50% максимального эффекта (50EC) значения кривой оценивается 20.82 мкм (рис. 2B).

Figure 1
Рисунок 1: Скрининг на людские ORs Мускон.
379 уникальных людские ORs были экранированы против 30 мкм Мускон с помощью реального времени лагеря assay. Цветные блоки вдоль x-оси указывают разные человека или семьи. Каждый столбец на x-ось представляет один тип или за исключением последних трех столбцов, которые являются реакцией OR5AN1 до 30 мкм мускус tibetene (положительный контроль), ответ OR5AN1 HBSS/HEPES/глюкозы раствор (без запах отрицательный контроль), и ответ Ро pCI до 30 мкм Мускон (пустой вектор отрицательный контроль), слева направо. y-ось представляет нормализованных люминесценции в 30 мин после добавления одоранта, когда ответ достиг максимума для позитивного управления (N = 3). Все ответы нормализуются позитивный элемент управления. Планки погрешностей представляют стандартная ошибка среднего (SEM). Для ясности отображаются только положительные погрешностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Кинетические измерения реакции OR5AN1 в Мускон.
(A) в реальном времени измерения OR5AN1 активации Мускон различной концентрации и без запах отрицательного контроля были выполнены в течение 30 мин одоранта сложения. Стрелка указывает точку времени одоранта сложения. (B) концентрация реакция кривая OR5AN1 против Мускон на 30 мин после добавления одоранта. y-оси представляют собой нормализованное люминесценции (N = 3). Все ответы нормализуются к высоким ответ на 100 мкм Мускон. Планки погрешностей представляют SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Плазмиды Сумма за 96-луночных пластины (мкг)
Ро- или 5
RTP1S 1
M3R 0.5
Лагерь биосенсор вариант 1

Таблица 1: Компоненты трансфекции смеси.
За количество 96-луночных пластины Ро-OR, RTP1S, M3R и в реальном времени лагеря биосенсор вариант плазмид.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Точного измерения или активации под воздействием определенных одоранта является первым шагом в расшифровке кодирование обонятельной информации. Экспериментов показано в этом исследовании представляют пример того, как можно определить, используя в пробирке или выражение системы, отвечающей СПР среди человека или репертуар для пахучие химические интерес и впоследствии характеризующие рецептор Фармакология, используя различные концентрации химического вещества. Наши результаты подтверждают OR5AN1 как bona fide рецептор для Мускон. Это согласуется с предыдущего доклада39 и предоставляет дополнительные доказательства для спекуляции, что только небольшое количество рецепторов участвуют в зондирования мускусный запах27,40. По сравнению с данным Сато-Akuhara et al. , созданный Люцифераза пробу на аналогичный или гетерологичных выражение системы скрининга, результаты нашей проверки показали несколько хуже соотношение сигнал шум. Помимо вариаций, присущие методам различных участвующих разница в выходных данных может быть связано с тем, что мы использовали более низкой концентрации Мускон (30 мкм против 100 мкм). В самом деле ЕС50 кривая концентрация реакция OR5AN1 против Мускон, которую мы получили через реальном времени лагеря assay значение в том же порядок величины, что Сато-Akuhara et al. , полученные в их системе пробирного Люцифераза, продемонстрировать сопоставимые результаты для той же гетерологичных системы выражения или даже когда используются различные методы. В другом исследовании наша группа обнаружила, что лагеря системы реального времени может быть немного более чувствителен, чем Люцифераза Репортер ген системы в оценке OR2T11 рецептор избирательности, учитывая, что небольшое количество отдушки были только активно в бывшей, но не в последнем системы35. По сравнению с серии данных, сообщаемых Geithe et al. 31 на OR1A1 против (+)-карвона, наши данные о OR5AN1 против Мускон, показан задержку в время, необходимое для достижения плато, которое может непосредственно из различных видов СПР и отдушки используется. В других данных реального времени лагеря пробирного сообщили из нашей группы мы также показали разное время пика в зависимости от СПР и отдушки34,35. Кроме того различных клеточных линий используется для выражения ORs, различные субстрата используется, различные реального времени лагеря биосенсор вариант плазмид, различную чувствительность хемилюминесценции пластины читателя, и/или различных экспериментальных условиях, таких, как различия в комнатной температуре, могут способствовать колебания в выход люминесценции.

Реальном времени лагеря assay показывает несколько преимуществ перед другими методами для измерения или активации. Во-первых, похож на ген assay репортера Люцифераза, реального времени лагеря assay обеспечивает дополнительные в vitro средства высок объём идентификации или репертуаров, отвечая одоранты. Крупномасштабные рецепторов или одоранта экраны в реальном времени лагеря assay может предложить большое количество информации на рецептор запах спаривание с использованием небольшое количество пластин. Когда luminometers и дозирования роботы доступны, 96-луночных протокол, описанный здесь можно легко обновить до 384-ну формат, в котором даже меньше плазмидной ДНК и реактивы необходимы на единицу вывода данных. Во-вторых метод реального времени лагеря способный измерять изменения внутриклеточной концентрации лагеря в режиме реального времени. Хотя большинство анализов используется для измерения активности или к настоящему времени на основе флуоресценции или хемилюминесценции конечной точки обнаружения требующих клеток лизис, реальном времени лагерь пробирного isimplemented условиях не литических, жить клеток, которые больше похожи на эндогенные положение и включить отслеживание изменений в лагере уровнях. В-третьих относительно меньше времени требуется для выполнения метода в реальном времени. Еще высок объём анализа метода или функции, которая опирается на выражение гена репортера Люцифераза, требует дополнительных 4 h после стимуляции запах завершить эксперимент. В некоторых случаях длительного запах инкубации интервал может привести к потенциальной токсичности одоранта в ячейки, которая эффективно решены под временные экспозиции. Кроме того в более длительных экспериментов, также увеличиваются шансы заражения соседних скважин путем испарительного переноса, при использовании различных отдушки и/или разные концентрации же одоранта в том же пластины. Немедленного обнаружения запаха добавлением делает в реальном времени лагеря assay быстрый и надежный парадигмы.

Ограничения в реальном времени лагерь анализа для измерения или активации является следующим. Во-первых наши в vitro пробирного основана на линии HEK293T-производные ячейки, которая не хватает многих эндогенных молекул родной обонятельной сенсорных нейронов. Кроме того растворимые белки и ферментативные преобразований, происходящих в носовой слизи может связываться с отдушки или влияние или в сродство для отдушки. Таким образом активации в системе гетерологичных может отличаться от ситуации в естественных условиях с точки зрения чувствительности и запах тюнинг. Во-вторых определение СПР для данного одоранта требует весь репертуар или, по крайней мере данного вида. СПР большой семьи GPCR и числа или белков в человека и мыши очень большие4,5,41. Значительное время и усилия могут быть вовлечены в клонирования каждый репертуар или интереса. В-третьих, хотя система гетерологичных выражение или включает в себя изменения или последовательности (например, Ро тегов) и некоторые из ключевых или аксессуар белков (например, RTP1S и M3R), мы подозреваем, что не все ORs функционально выражаются на мембране клеток HEK293T-производные ячейки. Таким образом отсутствие ответов на определенные одоранта в vitro не обязательно исключает или ответ в естественных условиях, в результате тот факт, что некоторые ОРС может быть просто слабо выраженной на поверхности клетки и не в состоянии признать их лиганды. Таким образом когда возможности реального времени лагерь должны использоваться в сочетании с другими in vitro и in vivo анализов для получения более убедительных результатов.

Несколько важных шагов следует дополнительное внимание в ходе реального времени лагеря assay. Во-первых для экспериментов с участием люминесценции в целом, температура является ключевым фактором, который влияет на результат эксперимента, как повышение температуры Снижение базальной и индуцированных уровень светоотдачи и снижением температуры повышения светоотдачи. Поэтому, предварительно equilibrating пластины в стационарном Рабочая температура музыкаNT перед добавлением одоранта необходимо, чтобы избежать влияния на результаты, вызванные изменения температуры. Во-вторых концентрации субстрата реагента в реальном времени лагеря пробирного должны корректироваться с учетом фактической ситуации. Когда базальной свечения не удается достичь низкого порога обнаружения хемилюминесценции пластины читателя, один следует рассмотреть возможность увеличения концентрации субстрата для увеличения сигнала. Наконец несмотря на линию адэрентных клеток, Hana3A клетки могут отключить во время эксперимента. Когда аспирационных или Добавление среды, размещение наконечники на стороне хорошо можно минимизировать нарушения монослоя клеток. Важно также для плиты клетки надлежащего и единообразного плотности, чтобы избежать зарастания клетки как густые пятна клеток, как правило, во время изменения среднего слезает.

Помимо выявления OR(s) для одоранта интереса, в реальном времени лагеря assay может также использоваться для экран для родственных лигандов для данного или когда имеются библиотеки химических веществ. Наконец когда используются типы соответствующих клеток и трансфекции условий, assay может также разрешить для обнаружения гиперэкспрессия или эндогенных GPCR активации и дать ответ зависит от концентрации кривых для агонистов и антагонистов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Работа была поддержана Китайский Национальный научный фонд (31070972), Наука и технологии Комиссии Шанхае муниципалитет (16ZR1418300), программа для новаторских исследований команда из Шанхая муниципального образования Комиссии, Восточной Шанхай Программа (J50201) и программа национальных базовых исследований Китая (2012CB910401).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma A2942
DMSO Sigma D2650
FBS Gibco 10099-141
GloSensor cAMP reagent Promega E1290
pGloSensor-20F cAMP plasmid Promega E1171
Hana3A cells available from authors upon request
HBSS, without calcium or magnesium GIBCO 14175095
HEPES Hyclone SH30237
Lipofectamine2000 Invitrogen 11668-019
M3R plasmid cloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamine Hyclone SH30024
Muscone Santa Cruz sc-200528
Musk tibetene Sigma-Aldrich S359165
OR plasmids cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI
PBS, without calcium or magnesium Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Plasmid miniprep kit Tiangen DP103-03
Puromycin Sigma P8833
RTP1S plasmid cloned into a mammalian expression vector such as pCI
Trypsin-EDTA Hyclone SH30236
0.2-mL PCR tube Axygen PCR-02-C
1.5-mL Eppendorf tube Eppendorf
15-mL 17 mm x 120 mm conical tube BD Falcon 352096
8-well and/or 12-well multichannel pipetman Eppendorf
96-well flat-bottomed white cell culture plate Greiner 655098
100 mm x 20 mm cell culture dish BD Falcon 353003
Class II biological safety cabinet with laminar flow
Cell culture incubator, with 5% CO2
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes
Infinite F200 plate reader Tecan
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives
Spectrophotometer
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution
Sterile paper towel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malakoff, D. Following the scent of avian olfaction. Science. 286 (5440), 704-705 (1999).
  2. Zippel, H. P. The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8. Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).
  3. Dryer, L., Berghard, A. Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).
  4. Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).
  5. Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).
  6. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
  7. Reed, R. R. After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction. Cell. 116 (2), 329-336 (2004).
  8. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  9. McClintock, T. S., et al. In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors. J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).
  10. Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity. J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).
  11. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal. 2 (60), ra9 (2009).
  12. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).
  13. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  14. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  16. von der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).
  17. D'Hulst, C., et al. MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding. Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).
  18. Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
  19. McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).
  20. Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
  21. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  22. Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).
  23. Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Sci Signal. 4 (155), ra1 (2011).
  24. Durocher, Y., et al. A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture. Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).
  25. Liberles, S. D., Buck, L. B. A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium. Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).
  26. Saraiva, L. R., et al. Combinatorial effects of odorants on mouse behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).
  27. Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium. J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).
  28. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).
  29. Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).
  30. Fan, B. F., Wood, K. V. Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications. Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).
  31. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors. J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).
  32. Noe, F., et al. OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol. Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).
  33. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).
  34. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).
  35. Li, S., et al. Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols. J Am Chem Soc. , (2016).
  36. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps. J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).
  37. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
  38. Block, E., et al. Implausibility of the vibrational theory of olfaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).
  39. Sato-Akuhara, N., et al. Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection. J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).
  40. Gane, S., et al. Molecular vibration-sensing component in human olfaction. PLoS One. 8 (1), e55780 (2013).
  41. Young, J. M., et al. Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families. Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).

Tags

Нейробиология выпуск 128 реального времени лагеря пробирного одоранта рецепторов одорант клеток Кинетические измерения Мускон
Жить клеточной измерение одоранта рецептор активации с помощью реального времени лагеря Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H.,… More

Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. J. Vis. Exp. (128), e55831, doi:10.3791/55831 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter